汪艷群，孟憲軍

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

超聲波處理對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

汪艷群，孟憲軍

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

利用超聲波對(duì)北五味子多糖進(jìn)行改性，從而提高其抗氧化活性。以羥自由基（·OH）及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，考察了超聲波處理功率、超聲波處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：超聲波處理功率、處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖抗氧化活性有顯著影響。最佳超聲波處理功率為330 W、處理時(shí)間為20 min。經(jīng)此條件處理后，·OH清除率由74.34%提高到87.05%，半抑制濃度（IC50）為10.7 mg/mL；DPPH自由基清除率由84.43%提高到95.05%，IC50＜2 mg/mL。適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢蕴岣弑蔽逦蹲佣嗵堑目寡趸钚浴?/p>

北五味子；多糖；抗氧化；超聲波

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）又名五梅子、玄及、會(huì)及、山花椒等，木蘭科多年生落葉藤本。五味子為藥食兩用物質(zhì)，其應(yīng)用已有2 000多年的歷史，被列為新資源食品，可用于生產(chǎn)藥品、保健品、化妝美容品和多種飲品、食品添加劑等。20世紀(jì)90年代以來(lái)，許多學(xué)者從五味子水提液中分離得到了多糖，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)五味子多糖具有保肝、抗疲勞、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、清除氧自由基、抗衰老、降血糖、降血脂等生理活性[1-5]。近年來(lái)，多糖的生物活性和化學(xué)多樣性引起關(guān)注。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)改變能提高多糖的生物活性。多糖改性的方法有化學(xué)、物理和生物手段[6]。超聲波處理是近年來(lái)新興的一種改性方法，其通過(guò)超聲空化作用引起的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和水分子裂解產(chǎn)生的自由基效應(yīng)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而改變多糖的生物活性[7]。與其他改性方法相比，超聲波處理具有節(jié)能省時(shí)，無(wú)化學(xué)試劑和有機(jī)溶劑污染等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前，針對(duì)北五味子多糖進(jìn)行改性的研究報(bào)道較少。本研究將純化后的北五味子多糖用超聲波處理，對(duì)其進(jìn)行改性，考察超聲波處理對(duì)其體外抗氧化活性的影響，為提高北五味子多糖生物活性提供理論依據(jù)和借鑒，為超聲波在多糖改性中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子干果由遼寧遼陽(yáng)五味子種植基地提供，沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院天然藥化教研室鑒定為木蘭科植物五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）的干燥果實(shí)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；玻璃層析柱、HL-2恒流泵 上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；透析袋（截留分子質(zhì)量為14 000 u） 上海蓮冠生物化工有限公司；GDC-TQ/ZS/4中試型智能控制超聲波多功能提取機(jī)組 濟(jì)寧金百特生物機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子多糖的分離純化工藝流程

北五味子干果→破碎→40 目篩→水提→乙醇沉淀→乙醚、丙酮洗滌→脫蛋白→聚酰胺柱層析→透析→冷凍干燥→北五味子精多糖備用

稱(chēng)取一定量五味子粉末按照料液比為1∶40（m/V）、提取時(shí)間為5 h、提取溫度為90 ℃進(jìn)行提取。提取后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至原體積的約1/5，加4 倍于提取液體積的95%乙醇，攪拌均勻后4 ℃條件下靜置12 h。將靜置液抽濾，所得沉淀用乙醚、丙酮、無(wú)水乙醇依次洗滌，濾干。將上述粗多糖配成20%的粗多糖溶液，將三氯乙酸-正丁醇溶液（1∶10，V/V）與粗多糖溶液等體積混合，移入分液漏斗中振蕩10 min后靜置1 h，分液取下層溶液，再與三氯乙酸-正丁醇溶液等體積混合，如此重復(fù)4 次。脫蛋白后進(jìn)行聚酰胺柱層析，上樣體積500 mL，多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，流速1.2 mL/min，蒸餾水洗脫，收集洗脫液。洗脫10 h后將收集的組分真空濃縮，凍干后再進(jìn)行一次柱層析。之后進(jìn)行透析，自來(lái)水流水透析3 d，蒸餾水透析2 d，每3～4 h換一次蒸餾水，透析后冷凍干燥得白色絮狀北五味子精多糖，備用。

1.3.2 超聲波處理對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

1.3.2.1 超聲波處理功率對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

超聲波頻率為28.5 kHz，處理時(shí)間為20 min，北五味子多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL。采用功率為0、220、330、440、550、660 W的超聲波分別處理20 min，測(cè)定其清除羥自由基（·OH）的能力。

超聲波處理功率對(duì)北五味子多糖清除DPPH自由基活性影響實(shí)驗(yàn)：設(shè)定北五味子多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，其他處理?xiàng)l件相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

超聲波頻率為28.5 kHz，功率為330 W，北五味子多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL。超聲波分別處理0、2.5、5、10、20、40 min，測(cè)定其清除·OH的能力。

超聲波處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖清除DPPH自由基活性影響實(shí)驗(yàn)：設(shè)定北五味子多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，其他處理?xiàng)l件相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2.3 超聲波最佳條件處理后北五味子多糖抗氧化活性的測(cè)定

超聲波頻率為28.5 kHz，功率為330 W，處理時(shí)間為20 min。北五味子多糖溶液質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、15、20 mg/mL，處理后測(cè)定其清除·OH的能力。

設(shè)定北五味子多糖溶液質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL，其他處理?xiàng)l件相同，對(duì)清除DPPH自由基的能力進(jìn)行測(cè)定。對(duì)照為未經(jīng)超聲波處理的北五味子多糖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 抗氧化活性的測(cè)定[9]

1.3.3.1 ·OH清除能力的測(cè)定

取1.5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL，加0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，充分混勻后，加1.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，加入樣品溶液1.0 mL，每加一管立即混勻，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% H2O2溶液1.0 mL。整個(gè)反應(yīng)體系體積共6 mL。反應(yīng)在37 ℃條件下恒溫水浴鍋中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1 h后，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為AX。損傷組中用1.0 mL去離子水代替樣品溶液；未損傷組中用2.0 mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。以VC作為參照物。按式（1）計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率。

式中：AX為樣品組吸光度；A0為未損傷組吸光度；A1為損傷組吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

在2 mL 2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液中加入2 mL樣品溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度AX。對(duì)照組A1中用2 mL去離子水代替樣品溶液，對(duì)照組A2中用2 mL無(wú)水乙醇代替2 mL DPPH乙醇溶液。以VC為參照物。按式（2）計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013處理軟件，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

2.1.1 超聲波處理功率對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

圖2 超聲波處理功率對(duì)北五味子多糖清除DPPH自由基活性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由圖1可知，超聲波處理顯著增強(qiáng)了北五味子多糖清除·OH的活性，超聲波功率在330 W時(shí)，多糖的·OH清除率最高，達(dá)到48.63%，功率超過(guò)330 W后，·OH清除率緩慢下降，趨于平穩(wěn)。由圖2可知，超聲波功率在330 W時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率最大，隨后緩慢下降，直至趨于平穩(wěn)，并且超聲波處理對(duì)北五味子多糖清除DPPH自由基活性的增強(qiáng)作用更顯著，功率為220 W時(shí)，清除率就達(dá)到71.70%，未經(jīng)超聲波處理的多糖，其清除率為63.03%。這可能是由于適宜功率的超聲波處理有利于北五味子多糖的適度降解和溶解度的提高[10]，增強(qiáng)DPPH自由基清除能力；功率太大又可能引起多糖分子交聯(lián)，使其抗氧化活性降低[11]。超聲波對(duì)聚合物的降解作用與超聲聲強(qiáng)、處理時(shí)間、溫度等有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)，超聲波功率越大超聲聲強(qiáng)越高，通常超聲聲強(qiáng)越高，降解作用越強(qiáng)，但達(dá)到一定程度后，進(jìn)一步增強(qiáng)聲強(qiáng)，降解作用增強(qiáng)不明顯，這在Zhong Kui等[12]對(duì)裂褶菌胞外多糖，Zhang Lifen[13]和Sun Yujing[14]等對(duì)蘋(píng)果果膠、全反式-β-胡蘿卜素的超聲波降解研究中均有報(bào)道。因此，選擇超聲波處理功率為330 W，對(duì)提高五味子多糖的抗氧化活性較為適宜。

2.1.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響

圖3 超聲波處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖清除·OH活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

圖4 超聲波處理時(shí)間對(duì)北五味子多糖清除DPPH自由基活性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由圖3、4可知，當(dāng)超聲波處理時(shí)間在20 min內(nèi)時(shí)，隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，北五味子多糖對(duì)·OH的清除率提高，0～20 min時(shí)，·OH清除率從42.91%上升到48.30%，DPPH自由基清除率從63.03%上升到72.15%；之后，隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，自由基清除率趨于穩(wěn)定。超聲波處理可以使多糖降解，分子質(zhì)量和黏度降低，一般單糖組成和糖苷鍵類(lèi)型不發(fā)生變化[15]，也沒(méi)有支鏈反應(yīng)的發(fā)生[16]，還有報(bào)道超聲波處理使多糖α-螺旋數(shù)量增多[15]，這些變化可能與改性后的多糖抗氧化活性、抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性提高有關(guān)[15,17-18]。也有研究表明，多糖鏈的降解存在最低降解分子質(zhì)量（Mmin，即超聲波不能對(duì)其進(jìn)行降解的低多糖分子質(zhì)量）[19]。因此，推測(cè)在固定超聲波功率為330 W的情況下，20 min的處理時(shí)間已使多糖長(zhǎng)鏈能發(fā)生的斷裂基本完成，分子質(zhì)量的降低有助于自由基清除率的提高；進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間，已經(jīng)斷裂的多糖鏈不再變化，故而清除率趨于穩(wěn)定。合理控制超聲波處理時(shí)間，在一定程度上可以提高五味子多糖清除自由基的活性。

2.1.3 超聲波最佳條件處理后北五味子多糖的抗氧化活性

圖5 北五味子多糖質(zhì)量濃度對(duì)其清除·OH活性的影響Fig.5 Effect of polysaccharide concentration on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所有的北五味子多糖溶液都表現(xiàn)出明顯的自由基清除能力，并且隨北五味子多糖質(zhì)量濃度的上升，·OH的清除率隨之提高，表現(xiàn)出了明顯的劑量依賴(lài)性。經(jīng)超聲波處理后的北五味子多糖其·OH清除能力較未經(jīng)超聲波處理的多糖顯著提高（P＜0.05），且二者的·OH清除率均高于VC對(duì)照組。經(jīng)超聲波處理后的北五味子多糖其·OH清除率最高為87.05%，IC50為10.7 mg/mL；未經(jīng)超聲波處理的五味子多糖其·OH清除率最高為74.34%，IC50為13.2 mg/mL。

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，廣泛用于各種抗氧化劑清除自由基能力的研究中。抗氧化劑通過(guò)轉(zhuǎn)移傳遞電子或氫原子給DPPH來(lái)中和其自由基。因此，對(duì)DPPH自由基的清除效果可以反映抗氧化劑的供氫能力[20]。由圖6可知，北五味子多糖具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，未經(jīng)超聲波處理的北五味子多糖，和超聲波處理后的多糖在質(zhì)量濃度為2 mg/mL條件下其DPPH自由基清除率即可達(dá)到63.03%和72.72%，這提示北五味子多糖可能具有較強(qiáng)的供氫能力，但二者的清除能力均不如VC對(duì)照組。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，超聲波處理可以顯著提高北五味子多糖清除DPPH自由基能力，DPPH自由基清除率由84.43%提高到95.05%。

圖6 北五味子多糖質(zhì)量濃度對(duì)其清除DPPH自由基活性的影響Fig.6 Effect of polysaccharide concentration on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

超聲波處理能提高多糖的抗氧化活性，這與王振斌等[11]對(duì)無(wú)花果多糖，Zhang Henan等[18]對(duì)桑黃菌絲體多糖，李岱等[21]對(duì)柴胡多糖，Yang Bao等[22]對(duì)龍眼果皮多糖，涂宗財(cái)?shù)萚23]對(duì)荷葉多糖，嚴(yán)碧歌等[24]對(duì)麥冬多糖的研究結(jié)果均一致。超聲波處理能提高北五味子多糖的自由基清除能力，推測(cè)與多糖內(nèi)能引起抗氧化活性的分子內(nèi)氫鍵有關(guān)。據(jù)報(bào)道，高分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)致密，導(dǎo)致能引起羥基和氨基活性的分子內(nèi)氫鍵的作用變?nèi)酰欢头肿淤|(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)松散，對(duì)分子內(nèi)氫鍵的影響就相對(duì)溫和[25]。超聲波處理使五味子多糖發(fā)生降解，將高分子質(zhì)量的多糖變?yōu)榉肿淤|(zhì)量低一些的大小適宜的碎片，使其對(duì)氫鍵的影響減小，從而表現(xiàn)出更顯著的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢燥@著提高北五味子多糖的抗氧化活性。超聲波處理功率、處理時(shí)間對(duì)多糖抗氧化活性有顯著影響（P＜0.05）。在實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)，最佳超聲波處理功率為330 W，處理時(shí)間為20 min。經(jīng)此條件處理后，·OH清除率最高，為87.05%，IC50為10.7 mg/mL；DPPH自由基清除率最大，可達(dá)到95.05%，IC50＜2 mg/mL。

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Effect of Ultrasonic Treatment on Antioxidant Activity of Polysaccharides from Mature Fruits of Schisandra chinensis

WANG Yanqun, MENG Xianjun
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Ultrasonic treatment was employed to improve the antioxidant activity of polysaccharides from the mature fruits of Schisandra chinensis. Based on hydroxyl and DPPH radical scavenging activity, the effects of ultrasonic power and treatment time on antioxidant activity of polysaccharides were studied. The results showed that both ultrasonic power and treatment time had significant effects on the antioxidant activity of polysaccharides. The optimal conditions of ultrasonic treatment were 330 W of ultrasonic power, 20 min of treatment time. Under these conditions, the scavenging rates of hydroxyl and DPPH radicals were increased from 74.34% to 87.05%, and from 84.43% to 95.05%, respectively. The IC50of the treated polysaccharides for scavenging of hydroxyl and DPPH radicals were 10.7 and less than 2 mg/mL, respectively. In conclusion, appropriate ultrasonic treatment can improve the antioxidant activity of polysaccharides from Schisandra chinensis fruits.

Schisandra chinensis; polysaccharides; antioxidant activity; ultrasonic treatment

10.7506/spkx1002-6630-201603013

TS201

A

1002-6630（2016）03-0066-05

汪艷群, 孟憲軍. 超聲波處理對(duì)北五味子多糖抗氧化活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 66-70. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603013. http://www.spkx.net.cn

WANG Yanqun, MENG Xianjun. Effect of ultrasonic treatment on antioxidant activity of polysaccharides from mature fruits of Schisandra chinensis[J]. Food Science, 2016, 37(3): 66-70. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603013. http://www.spkx.net.cn

2015-08-24

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)青年教師科研基金項(xiàng)目（20121005）

汪艷群（1980—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樾{果加工及植物活性成分。E-mail：syauwyq@163.com