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        紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的變化

        2016-11-11 07:34:20辛秀蘭楊富民
        食品科學 2016年3期
        關(guān)鍵詞:樹莓花色釀造

        張 強,辛秀蘭*,楊富民,陳 亮,張 雪,池 蓬

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;2.北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院,北京 100029)

        紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的變化

        張 強1,辛秀蘭2,*,楊富民1,陳 亮2,張 雪2,池 蓬2

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;2.北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院,北京 100029)

        采用液態(tài)深層快速發(fā)酵法發(fā)酵紅樹莓果醋,分析紅樹莓釀造過程中總多酚、總黃酮、花色苷的含量以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基()清除率的變化。結(jié)果表明:總多酚、總黃酮、花色苷的含量先升高后降低,3 種自由基清除率隨著醋酸發(fā)酵明顯升高,醋酸發(fā)酵10 d后,總多酚、總黃酮、花色苷含量分別保留了68%、85%、38%,DPPH自由基、、·OH清除率分別為98.63%、83.82%、78.36%。相關(guān)性分析顯示總多酚、總黃酮、花色苷含量互為極顯著正相關(guān),且與主成分1成很高的負相關(guān);·OH清除率、清除率、DPPH自由基清除率互為極顯著正相關(guān),且與主成分1成很高的正相關(guān)。聚類分析將釀造過程分為3 個集群,代表發(fā)酵過程中抗氧化性能不同的變化趨勢。

        紅樹莓果醋;抗氧化;自由基清除率;主成分分析;聚類分析

        紅樹莓(Rubus idaeus)又名覆盆子、托盤、馬林等,系薔薇科懸鉤子屬。果實柔嫩多汁,香甜可口,風味獨特,富含多種氨基酸和有機酸,尤其富含超氧化物歧化酶、類黃酮、花青素等大量抗氧化物質(zhì),能夠起到抗衰老,抗心血管疾病等作用,具有很高的醫(yī)藥及保健作用,被譽為第三代水果[1]。

        果醋作為新型飲料,是一種運用現(xiàn)代生物技術(shù),以水果或果品的加工腳料為主要原料,利用微生物二次發(fā)酵釀造的營養(yǎng)豐富,口感優(yōu)良的酸味飲料。果醋具有很高的保健價值,富含的有機酸能促進肌肉中乳酸和丙酮酸等疲勞物質(zhì)分解,其中尼克酸能促進膽固醇的代謝,起到降血脂的作用,此外還有很高的殺菌能力和防腐敗作用,其特有的揮發(fā)性香氣成分能刺激大腦神經(jīng)中樞,有助于消化功能的增強。近年來,果醋市場需求呈上升趨勢,這與果醋兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能密不可分,是集多功能于一身的新型飲品,被稱為“第四代功能性飲料”[2-4]。

        本實驗采用液態(tài)深層快速發(fā)酵制醋的方法,主要是通過對空氣、溫度的控制,短時間內(nèi)使經(jīng)擴大培養(yǎng)的醋酸菌借助自吸空氣的氣流以及搖床的機械振動充分攪拌混合,加大了氣液混合面積從而進行全面的酒精氧化,生成高醋酸含量的果醋。

        目前,紅樹莓果實不耐貯運的問題制約著紅樹莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,采摘后如果不及時進行銷售或加工,會造成大量鮮果積壓和腐爛,因此對紅樹莓的深加工成為發(fā)展方向。本實驗對紅樹莓果醋在釀造過程中抗氧化物質(zhì)含量和清除自由基能力進行測定,通過相關(guān)性、主成分分析等統(tǒng)計方法,進一步分析抗氧化性能的變化規(guī)律及特點,以期為紅樹莓果醋產(chǎn)品的研究開發(fā)提供科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        紅樹莓冷凍果由北京匯源果汁有限公司提供。

        果酒酵母1399、醋酸桿菌20056 中國發(fā)酵工業(yè)研究所;沒食子酸、蘆丁 天津市百世化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 美國Sigma公司;其余試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設備

        ZKSY-6恒溫智能水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;豪威斯AR5120型電子天平 北京天平醫(yī)用廠;UV-1800紫外分光光度計 北京彭曼科技有限責任公司;J0050024生化培養(yǎng)箱 上海?,攲嶒炘O備有限公司;日立CR-GIII高速離心機 天美科學儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 工藝流程

        原料挑選→破碎→酶解→成分調(diào)整→滅酶、巴氏果酒酵母 醋酸桿菌

        ↓ ↓

        滅菌→酒精發(fā)酵(10 d)→醋酸發(fā)酵(10 d)→陳釀→澄清→過濾→灌裝滅菌→成品

        具體過程:挑選成熟、飽滿、色澤鮮艷的紅樹莓果實,打漿。往漿液中添加50 mg/L的果膠酶,在45 ℃條件下酶解3 h。添加白砂糖調(diào)整糖度為18°Bx,使發(fā)酵液滿足酵母發(fā)酵的需求。將成分調(diào)整后的紅樹莓果汁在85 ℃條件下保溫15 min,達到滅酶滅菌的目的。之后在紅樹莓果汁中接種果汁含量為3%的馴化后的果酒酵母1969,30 ℃酒精發(fā)酵10 d。然后在紅樹莓果汁中接種9%馴化后的醋酸桿菌20056,28 ℃醋酸發(fā)酵10 d。將醋酸發(fā)酵好的紅樹莓果醋置于14 ℃,陳釀30 d后,用硅藻土澄清過濾,裝入瓶中滅菌。

        1.3.2 總多酚含量的測定

        參考趙金梅等[5]的方法略有改動,采用Folin-酚比色法進行測定。精確稱取沒食子酸25 mg溶解于100 mL水中,即得沒食子酸標準母液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于5 支比色管中,分別加入體積分數(shù)為10%的Folin-酚試劑2.5 mL和75 mg/mL Na2CO3溶液2 mL,加水定容至10 mL,對應含量為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mg/mL的沒食子酸溶液,在45 ℃水浴中反應15 min,取出樣品混勻10 s后,在波長765 nm處測定其吸光度。以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(x,mg/mL),以吸光度為縱坐標(y)繪制標準曲線,擬合的回歸方程為:y=8.112 0x-0.055 8,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

        樣品測定:取紅樹莓液體樣品0.1 mL,稀釋10 倍,按上述步驟操作,用水定容至25 mL,在45 ℃水浴中反應15 min,取出樣品混合10 s后在波長765 nm處測定其吸光度。

        1.3.3 總黃酮含量的測定

        參考白立敏等[6]的方法略有改動,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定。精確稱取蘆丁標品28 mg溶于體積分數(shù)為30%的乙醇溶液,定容至50 mL,分別取0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mL于比色管中,分別加入50 g/L NaNO2溶液0.4 mL,搖勻,靜置6 min,再加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,搖勻,靜置6 min,再加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,用30%的乙醇定容至10 mL,靜置15 min,在波長510 nm處測定其吸光度。以蘆丁的質(zhì)量濃度x為橫坐標,以吸光度y為縱坐標繪制標準曲線,擬合的回歸方程為:y=1.818 5x+0.030 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。

        樣品測定:取紅樹莓液體樣品1 mL,按上述步驟操作并測定吸光度。

        1.3.4 花色苷含量的測定

        參考肖軍霞等[7]的方法,采用pH示差法測定。分別移取2 份0.4 mL花色苷提取液,分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液定容至10 mL,每隔10 min分別在波長為520、700 nm處測定吸光度,直至穩(wěn)定。

        式中:A為吸光度;ε為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù)26 900 L/(mol·cm);L為比色皿光程1 cm;MW為矢車菊-3-葡萄糖苷相對分子質(zhì)量449.2 g/mol;DF為稀釋因子;V為最終體積/mL;m為樣品質(zhì)量/g。

        1.3.5 羥自由基(·OH)清除率的測定

        參考包怡紅等[8]的方法測定。取3 支比色管,分別加入稀釋5 倍的樣品5 mL,依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL,6 mmol/L H2O2溶液2 mL,混勻靜置10 min,再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL,混勻靜置30 min,在520 nm波長處測定其吸光度。

        式中:AJ為加入樣品后的吸光度;AI為不加水楊酸樣品的吸光度;A0為空白(蒸餾水)吸光度。

        1.3.6 超氧陰離子自由基(O2-·)清除率的測定

        參考張小強等[9]的方法測定。取0.05 mol/L,pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中,置25 ℃水浴中預熱20 min。分別加入不同濃度的待測品0.1 mL后均加入2.5 mmol/L鄰苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 mL,混勻后25 ℃水浴中準確反應4 min,立即加入2 滴8 mol/L HCl終止反應。用蒸餾水調(diào)零,在299 nm波長處測定吸光度??瞻捉M以0.1 mL蒸餾水代替樣品試液。

        1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

        參考包怡紅等[8]的方法。精確吸取0.5 mL紅樹莓液體樣品于比色管中,放入2 mL 0.2 mmol/L的 DPPH溶液,用無水乙醇定容至5 mL,搖勻置于暗處30 min后,在波長517 nm處測定其吸光度。

        式中:AJ為樣品+DPPH溶液的吸光度;AI為樣品+無水乙醇溶液的吸光度;A0為DPPH+無水乙醇溶液的吸光度。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        實驗平行3 次,采用SPSS 18.0、Excel 2003軟件進行數(shù)理統(tǒng)計分析與相關(guān)性分析,分別采用降維法、歐氏距離法對發(fā)酵過程中紅樹莓果醋的抗氧化性能進行主成分分析和聚類分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮、花色苷含量變化

        圖1 紅樹莓果醋釀造過程中總多酚含量的變化Fig.1 Change in total phenolic content during the fermentation of red raspberry vinegar

        由圖1可知,紅樹莓釀造過程中總多酚的含量在酒精發(fā)酵階段先上升后下降。在酒精發(fā)酵起始階段,由于酵母菌發(fā)酵作用,紅樹莓果漿中多酚物質(zhì)更好地溶于果汁中[10],使得前2 d的總多酚含量略有上升。在發(fā)酵中期趨于平穩(wěn)。醋酸發(fā)酵結(jié)束后,總多酚含量保留了68%。

        圖2 紅樹莓果醋釀造過程中總黃酮含量的變化Fig.2 Change in total flavonoid content during the fermentation of red raspberry vinegar

        樹莓黃酮具有抗氧化活性,能夠清除自由基,抑制腸道革蘭氏陽性腸球菌的生長繁殖,進而抑制腸道的腐敗。此外,黃酮類化合物能夠降低血管內(nèi)皮細胞羥脯酸的代謝,減少膠原纖維的積累,有利于防止血栓的形成[11-12]。由圖2可知,紅樹莓釀造過程中總黃酮的含量在酒精發(fā)酵階段先上升后下降,之后趨于平穩(wěn)。醋酸發(fā)酵結(jié)束后,總黃酮含量保留了85%。由于酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物與多酚類物質(zhì)反應生成衍生物,酶促反應導致總黃酮降解[13]。醋酸發(fā)酵初期上升機理目前尚不清楚,有待進一步研究。

        圖3 紅樹莓果醋釀造過程中總花色苷含量的變化Fig.3 Change in total anthocyanin content during the fermentation of red raspberry vinegar

        紅樹莓釀造過程中花色苷的含量在酒精發(fā)酵階段先上升后下降,之后趨于平穩(wěn)。醋酸發(fā)酵結(jié)束后,總花色苷含量保留了38%。酒精發(fā)酵初期果皮、果肉細胞在發(fā)酵液底部,使其含有的花色苷物質(zhì)在發(fā)酵液中分布不均勻,由于之后的緩釋作用導致發(fā)酵初期花色苷含量上升。由于酵母的細胞壁對花色苷有一定的吸附作用[14],因此隨著酵母不斷大量的繁殖,在酶促反應下花色苷的含量不斷降低。此外有研究證明,隨著發(fā)酵的進行糖含量的減少促進了花色苷的降解[15]?;ㄉ赵谒嵝詶l件下穩(wěn)定,所以隨著醋酸發(fā)酵的進行,花色苷的氧化程度變小,下降幅度減小,逐漸趨于穩(wěn)定。

        2.2 發(fā)酵過程中自由基清除率的變化

        DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,在517 nm波長處具有最大吸收率,有自由基清除劑存在時,DPPH自由基的單電子被捕捉而使其顏色變淺,吸光度與抗氧化性成反比線性關(guān)系,從而用以評價實驗樣品的抗氧化能力[16]。氧自由基主要指和·OH,它們能使脂質(zhì)過氧化,破損生物膜的結(jié)構(gòu)及功能,加速機體衰老[17]。

        圖4 紅樹莓果醋釀造過程中DPPH自由基、和·OH清除率的變化Fig.4 Changes in DPPH, superoxide anion and hydroxyl free radical scavenging activities during the fermentation of red raspberry vinegar

        由圖4可知,在酒精發(fā)酵階段3 種自由基清除率均有不同程度的下降:DPPH自由基清除率下降了4.71%,但一直大于85%,保持了較高的清除率;·OH清除率下降了13.36%,·清除率下降了10.39%,兩者下降趨勢相近,清除率保持在40%~65%之間。在酒精發(fā)酵初期,由于紅樹莓果汁中含有一定量的氧,并且酵母菌大量繁殖,導致發(fā)酵液抗氧化性能下降。發(fā)酵后期由于積累了大量的酒精,增加了酒中酚類物質(zhì)的活性以及酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中降解的綜合作用,3 種自由基的清除率在酒精發(fā)酵后期有一定的波動變化[18-19]。

        2.3 抗氧化性能相關(guān)性分析

        表1 清除自由基能力與花色苷、總多酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析Table1 Linear correlation coefficients between free radical scavenging capacities and the contents of total anthocyanins, total phenols, flavonoids

        表1采用Pearson’s相關(guān)系數(shù)分析紅樹莓果醋釀造過程中自由基清除性能與總多酚、總黃酮、花色苷含量的相關(guān)性,結(jié)果表明:總多酚、總黃酮、花色苷含量互為極顯著正相關(guān),·OH清除率、·清除率、DPPH自由基清除率互為極顯著正相關(guān),花色苷含量與3 種自由基清除率成顯著負相關(guān),清除率與3 種抗氧化物質(zhì)含量成顯著負相關(guān)。研究表明,天然抗氧化劑主要來源于植物多酚,其中以黃酮類化合物最為常見,其共同結(jié)構(gòu)為C6—C3—C6,花色苷同樣具有黃酮類特有的3C結(jié)構(gòu),三者結(jié)構(gòu)相近,因此三者之間具有極顯著的相關(guān)性[20]。氧自由基(·、·OH)與DPPH自由基的氧化與機體內(nèi)的電子鏈傳遞有很高的相關(guān)性[21],這可能是3 種自由基之間有較高的相關(guān)性的原因之一,有待進一步研究。

        2.4 抗氧化性能主成分分析結(jié)果

        圖5 抗氧化性能的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of antioxidant properties

        由圖5可知,PC1、PC2分別解釋了變量的68.83%、23.91%,累計貢獻率為92.74%,因此這2 個主成分能夠代表整體數(shù)據(jù)的信息特征。不同抗氧化指標在主成分分析圖上有較好的分類,總多酚、總黃酮、花色苷含量與PC1成很高的負相關(guān)性,DPPH自由基清除率、清除率、·OH清除率與PC1成很高的正相關(guān)性,上述變量均與PC2成一定的正相關(guān)性。·OH清除率,花色苷含量與PC1相關(guān)性最高,說明二者對紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的貢獻最高。

        2.5 紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的聚類分析結(jié)果采用歐氏距離法對釀造過程中的抗氧化性能進行聚類分析,結(jié)果如圖6所示。所測樣本明顯的分為3 個集群:集群1為發(fā)酵前5 d,自由基清除率和抗氧化物質(zhì)含量都有不同程度的上升;集群2主要為酒精發(fā)酵后期以及醋酸發(fā)酵第1天,抗氧化物質(zhì)——多酚、黃酮、花色苷迅速降解,抗氧化性能下降,是抗氧化性能轉(zhuǎn)變的過渡時期;集群3為醋酸發(fā)酵期,自由基清除率大幅度穩(wěn)定升高,抗氧化物質(zhì)穩(wěn)定小幅度下降。通過聚類分析表明不同發(fā)酵時期的變量數(shù)據(jù)特點,對紅樹莓釀造過程中抗氧化性能起到了很好的評價作用,是一種行之有效的分析方法。

        圖6 抗氧化性能的聚類分析樹狀圖Fig.6 Cluster analysis dendrogram of antioxidant properties

        3 討 論

        近年來,抗氧化研究在食品、藥品領(lǐng)域應用廣泛,但由于每種測定抗氧化活性的方法所得結(jié)果差異較大,且沒有一種單一有效的實驗方法可以用來精確評價抗氧化活性,因此需要通過多種實驗方法、統(tǒng)計方法來完整精確地評價抗氧化活性[22]。本實驗對紅樹莓果醋發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮、花色苷的含量和3 種自由基(·OH、DPPH自由基、)清除率進行了分析,評價紅樹莓果醋的抗氧化性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),總多酚、總黃酮、花色苷3 種抗氧化物質(zhì)含量依次減小,并且在釀造過程中總體趨勢相近,這與三者的主體結(jié)構(gòu)有關(guān)。DPPH自由基清除率在發(fā)酵過程中保持較高的水平,·OH、清除率變化趨勢相近并在醋酸發(fā)酵階段迅速上升。

        實驗確定了總多酚、總黃酮、花色苷含量與3 種自由基(DPPH自由基、、·OH)清除率的關(guān)系,通過相關(guān)分析表明花色苷與3 種自由基清除率成顯著負相關(guān),清除率與3 種抗氧化物質(zhì)成顯著負相關(guān);主成分分析表明·OH清除率、花色苷含量對紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的貢獻最高;聚類分析將紅樹莓釀造過程分為3 類,集群1呈上升趨勢,集群2呈大幅度下降趨勢,集群3顯示3 種自由基清除率穩(wěn)定上升。

        本實驗采用液態(tài)深層快速發(fā)酵制醋的方式,最大程度保留了紅樹莓中的抗氧化物質(zhì),醋酸發(fā)酵后總多酚含量保留了68%,總黃酮含量保留了85%,花色苷含量保留了38%,DPPH自由基清除率為98.63%,清除率為83.82%,·OH清除率為78.36%。可為紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能研究提供理論支持,為紅樹莓果醋產(chǎn)品的開發(fā)提供實踐依據(jù)。

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        Changes in Antioxidant Properties of Red Raspberry Vinegar during Fermentation

        ZHANG Qiang1, XIN Xiulan2,*, YANG Fumin1, CHEN Liang2, ZHANG Xue2, CHI Peng2
        (1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;2. College of Bioengineering, Beijing Polytechnic, Beijing 100029, China)

        The changes in the contents of total polyphenols, total flavonoids and total anthocyanins, and radical scavenging capacities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl and superoxide anion free radicals in red raspberry vinegar produced by submerged fermentation were analyzed during the fermentation process. The results indicated that the contents of total polyphenols, total flavonoids and total anthocyanins increased first and then decreased. The scavenging rates of all three kinds of free radicals increased significantly with acetic acid fermentation. After acetic acid fermentation for 10 days, 68% of the total polyphenols, 85% of the total flavonoids and 38% of the total anthocyanins were retained, and the scavenging rates of DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radicals were 98.63%, 78.36% and 83.82%, respectively. Our results also showed there were had extremely significant positive correlations among the contents of total polyphenols, total flavonoids and total anthocyanins, and each of these was highly negative correlated with principal component 1. The scavenging rates of DPPH, hydroxyl and superoxide ani on free radicals also had extremely significant positive correlation with each other, and each showed a highly positive correlation with principal component 1. In addition, the brewing process was divided into three clusters by cluster analysis, which represented the changing trend of antioxidant properties at different fermentationstages.

        red raspberry vinegar; antioxidant properties; radical scavenging rates; principal component analysis; cluster analysis

        10.7506/spkx1002-6630-201603002

        TS207.3

        A

        1002-6630(2016)03-0006-06

        張強, 辛秀蘭, 楊富民, 等. 紅樹莓果醋釀造過程中抗氧化性能的變化[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 6-11. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603002. http://www.spkx.net.cn

        ZHANG Qiang, XIN Xiulan, YANG Fumin, et al. Changes in antioxidant properties of red raspberry vinegar during fermentation[J]. Food Science, 2016, 37(3): 6-11. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603002. http://www.spkx.net.cn

        2015-03-12

        國家自然科 學基金青年科學基金項目(21306002);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103037);北京市教委科技計劃面上項目(KM201510858001)

        張強(1988—),男,碩士研究生,研究方向為小漿果深加工。E-mail:867959208@qq.com

        *通信作者:辛秀蘭(1968—),女,教授,博士,研究方向為小漿果資源研究及產(chǎn)品推廣。E-mail:xiulanxin@163.com

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