周小芳，易若琨，趙　欣

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，重慶 400067)

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LactobacillusfermentumZhao的小鼠抗皮膚老化效果

周小芳，易若琨，趙欣

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，重慶 400067)

本文對LactobacillusfermentumZhao(LF-Zhao)的抗老化效果進行研究。體外抗氧化實驗結(jié)果顯示 LF-Zhao具有較強的DPPH自由基和·OH清除能力。進一步的動物實驗表明，LF-Zhao可以提高D-半乳糖誘導(dǎo)氧化小鼠血清和皮膚組織中的SOD、GSH-Px水平和降低NO、MDA水平，且隨著LF-Zhao濃度的增加效果更為明顯。通過RT-PCR實驗分析小鼠皮膚組織發(fā)現(xiàn)，LF-Zhao能上調(diào)氧化小鼠皮膚的nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT mRNA表達和下調(diào)iNOS表達，高濃度的LF-Zhao使以上表達最接近正常組小鼠。通過這些結(jié)果可以得出LF-Zhao具有良好的皮膚抗老化作用。

牦牛酸乳；Lactobacillus fermentum Zhao；氧化；老化；小鼠

牦牛是分布在我國青藏高原地區(qū)的一種特有畜牧資源，其中牦牛酸乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)和發(fā)酵中的菌群都對牦牛酸乳保健效果產(chǎn)生影響。特別是牦牛酸乳中的乳酸菌群種類主要受各地區(qū)牧民生活習(xí)慣，擠奶及發(fā)酵的器具，發(fā)酵溫度、時間等因素的影響，故從牧區(qū)的牦牛酸乳分離出的乳酸菌與常用的商業(yè)乳酸菌有很大區(qū)別[1]。目前有大量的研究表明，乳酸菌在食品行業(yè)中具有很廣泛的作用，現(xiàn)已被應(yīng)用在發(fā)酵等食品工業(yè)相關(guān)領(lǐng)域[2-5]，但我國工業(yè)中生產(chǎn)發(fā)酵乳制品所用的絕大部分乳酸菌均來自國外，因此國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)開始對青海、西藏和甘肅等地區(qū)牦牛發(fā)酵乳中含有的微生物進行了分離、鑒定，旨在發(fā)現(xiàn)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的、保健功能顯著的乳酸菌[6-8]。

研究表明乳酸菌對人體有較多的益處，可以促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[9]；改善人體胃腸道功能，抑制腐敗菌的繁殖，清除腸道垃圾[10]；增強人體免疫力和抵抗力；消除人體內(nèi)自由基，具有抗衰老的作用[11]。進一步的研究表明乳酸菌有較強的抗氧化作用，對于控制氧化導(dǎo)致的機體異常具有一定的幫助[12]。本研究團隊對藏區(qū)牦牛酸乳進行了初步研究，分離鑒定出具有知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌菌株。通過動物實驗對已鑒定的牦牛酸乳分離乳酸菌LactobacillusfermentumZhao的皮膚老化預(yù)防效果進行了研究，實驗結(jié)果為食品和保健品行業(yè)進一步利用LactobacillusfermentumZhao積累了理論依據(jù)。

一、材料與方法

(一)材料與試劑

菌株：乳酸菌LactobacillusfermentumZhao(LF-Zhao)分離自四川紅原縣自然發(fā)酵的牦牛酸乳(中國典型培養(yǎng)物保藏中心菌種保藏號：M2013513)。

DPPH試劑，上海金穗生物科技有限公司；NO、SOD、GSH-Px、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；EDTA，Sigma公司，美國；CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒，Becton Dickinson公司，德國；Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV，Invitrogen公司，美國；RT-PCR引物nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT，天根生化科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

(二)實驗動物

雄性SPF級KM小鼠40 只(體重20～25 g)，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(合格證號：SYXK(渝)2012-0001)。

(三)儀器與設(shè)備

LD2X-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋，江西華科精密儀器有限公司；PYX-DHS-50X65BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海百典儀器設(shè)備有限公司； UV9600紫外分光光度計，北京北分瑞利分析儀器(集團)公司；Bio-Rad小型水平電泳槽，Bio-Rad公司，美國 ABI 2720 PCR儀, 美國Applied Biosystems公司。

(四)方法

1. DPPH自由基清除能力的測定

將4mL的LF-Zhao菌液(濃度為1.0×107、1.0×108CFU/mL)和1mL的DPPH(1.5×10-4M)試劑混合后室溫放置30min，最后在517nm處讀得吸光度，計算得到DPPH 自由基清除能力[13]。

2. ·OH清除能力的測定

配制測定反應(yīng)體系(1.4mL)，包含0.2mL的LF-Zhao菌液(濃度為1.0×107、1.0×108CFU/mL)，脫氧核糖(6mM，0.2mL)，0.2mL的磷酸鈉緩沖液(20mM，pH 7.4)，0.2mL無水氯化鐵(FeCl3，400μM)，0.2mL的硫酸亞鐵-乙二胺四乙酸(EDTA，400μM)，0.2mL的H2O2(3mM)和0.2mL抗壞血酸(400μM)。在37℃水浴中保溫60min后，在反應(yīng)體系液中加入1mL的三氯乙酸和1mL的硫代巴比妥酸后，在90℃水浴中加熱20min。最后在532nm處測定吸光度測后計算·OH清除能力[13]。

3. 動物抗老化實驗

KM小鼠喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后平均分為4組，分別是正常組、老化對照組、LF-Zhao低濃度組和LF-Zhao高濃度組，每組10只小鼠。正常組除外其余3組每只小鼠每日按濃度120mg/kg腹腔注射D-半乳糖，持續(xù)6周。注射D-半乳糖的同時，LF-Zhao低濃度組(1.0×107CFU/mL)和LF-Zhao高濃度組(1.0×108CFU/mL)小鼠每日灌胃0.2mL的LF-Zhao，同樣持續(xù)6周。6周后對小鼠實施絕食24h后乙醚處死小鼠并解剖，心臟取血，皮膚組織待用[13]。

4. 血清和皮膚組織NO、SOD、GSH-Px和MDA含量測定

將取得的血漿在4000rpm下離心分離10min后取上層血清，按試劑盒說明書測定小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA的含量。將小鼠皮膚組織制成10%的勻漿后在4000rpm下離心分離10min，取上清液按試劑盒說明書測定皮膚組織指標(biāo)。

5. RT-PCR實驗分析皮膚組織

用RNAzol 試劑提取皮膚組織中的總RNA，然后將其濃度稀釋到1μg/μL。在RNA 提取液(2μL)中按次序加入1μL的 oligodT18，RNase, dNTP 和MLV 酶，10μL的5×buffer，然后合成cDNA(37℃ 120 min，99℃ 4min，4℃ 3 min)。然后以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴增nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達，同時GAPDH(持家基因)作為內(nèi)參照同樣進行擴增。最后以瓊脂(含1%濃度溴化乙錠)電泳檢查PCR擴增產(chǎn)物，并用Image1.44軟件定量分析表達強度[13]。

(五)數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有的實驗均進行3 次平行實驗，然后使用SAS9.1 統(tǒng)計軟件采用one-way ANOVA 分析方法分析各組數(shù)據(jù)在p<0.05 水平上是否具有顯著差異。

二、 結(jié)果與分析

(一)LF-Zhao的體外抗氧化效果

通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)LF-Zhao的抗氧化效果在濃度0-1.0×108CFU/mL呈現(xiàn)線性增長，因此本研究選擇濃度1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao進行體外和動物體內(nèi)的抗氧化效果研究。實驗結(jié)果顯示1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao具有較強的DPPH自由基清除能力，1.0×107CFU/mL的LF-Zhao對DPPH自由基清除能力為47.5±3.8%，濃度提高到1.0×108CFU /mL時對DPPH自由基清除能力達到84.5±4.2%。同時，1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao對·OH清除能力也呈現(xiàn)出和DPPH自由基清除能力相同的趨勢，分別達到52.1±3.3%和88.6%±3.5。DPPH自由基清除能力和·OH清除能力的測定可以有效地對食品的體外抗氧化效果進行檢測[14]，由本實驗的結(jié)果可以看出LF-Zhao具有很強的體外抗氧化效果，且隨著濃度的提高，抗氧化效果也隨之提高。

(二)LF-Zhao對小鼠NO、SOD、GSH-Px和MDA含量的影響

由表1和表2可知，灌胃LF-Zhao的小鼠血清和皮膚組織中的NO、MDA含量較僅誘導(dǎo)老化的老化對照組小鼠低，而SOD、GSH-Px含量更高。同時，不同濃度LF-Zhao灌胃小鼠體內(nèi)的NO、SOD、GSH-Px和MDA含量也產(chǎn)生一定的差異，1.0×107和1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠血清中的NO和MDA含量顯著低于老化對照組小鼠，而SOD、GSH-Px含量顯著高于老化對照組小鼠，且1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA水平比1.0×107CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠的水平更接近正常組小鼠。LF-Zhao灌胃小鼠皮膚組織中的NO、MDA、SOD、GSH-Px含量表現(xiàn)出和血清指標(biāo)相似的狀態(tài)，NO和MDA的含量高于正常組，SOD和GSH-Px的含量低于正常組，高濃度的LF-Zhao能使老化皮膚中的NO、MDA、SOD、GSH-Px含量更接近正常組。一氧化氮在體內(nèi)是由一氧化氮合酶(NOS)催化下產(chǎn)生的, 在體內(nèi)各生理系統(tǒng)和組織中均有十分重要的作用，一定量的NO起到維持體內(nèi)老化平衡的作用，當(dāng)機體收到老化損傷時，NO在NOS的作用下大量產(chǎn)生，是機體失衡的表現(xiàn)[15]。本研究也得到了相似的結(jié)果，老化對照組小鼠由于氧化損傷導(dǎo)致NO的含量異常上升，LF-Zhao可以緩解這種異常的NO含量上升，且高濃度的LF-Zhao具有更顯著的效果，意味著LF-Zhao具有較強的動物體內(nèi)抗老化效果。SOD和GSH-Px作為評價體內(nèi)抗氧化的重要標(biāo)準(zhǔn)已得到證明，高含量的SOD和GSH-Px證明抗氧化效果的優(yōu)異；同時MDA是脂質(zhì)過氧化的重要表現(xiàn)，其含量越低證明機體收到脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致老化的影響越小[16]。本研究中LF-Zhao可以起到緩解氧化造成的SOD、GSH-Px含量下降和抑制MDA含量的升高，且高濃度的LF-Zhao效果最好。

表1　不同濃度LF-Zhao灌胃小鼠血清中NO、SOD、GSH-Px和MDA含量

不同字母表示比較各組數(shù)據(jù)平均值顯著性差異(p<0.05)，表2，圖1、2同。

表2　不同濃度LF-Zhao灌胃小鼠皮膚組織中NO、SOD、GSH-Px和MDA含量

(三)不同濃度LF-Zhao對小鼠皮膚組織中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表達的影響

通過PT-PCR實驗結(jié)果可以看到，LF-Zhao灌胃小組小鼠皮膚組織中的nNOS、eNOS表達顯著高于老化對照組，但低于正常組，同時皮膚組織中的iNOS表達呈現(xiàn)與nNOS、eNOS表達相反的趨勢，顯著低于老化對照組(見圖1)。然而，LF-Zhao灌胃小鼠的nNOS、eNOS表達顯著高于老化對照組小鼠，1.0×108CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠的nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表達比1.0×107CFU/mL的LF-Zhao灌胃小鼠更為接近正常組小鼠。體內(nèi)的NO失衡是機體損傷的標(biāo)志之一，NO在體內(nèi)是由NOS催化產(chǎn)生的，其中iNOS在正常情況下不表達，機體氧化損傷后，iNOS大量轉(zhuǎn)化成NO，使機體氧化損傷加重；nNOS和eNOS在機體多個組織中均體現(xiàn)出氧化受損后下降的趨勢，可見nNOS、eNOS表達減弱，iNOS表達增強是氧化損傷的重要體現(xiàn)[17]。

圖1　Lactobacillus fermentum Zhao灌胃小鼠皮膚組織中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表達水平

(四)不同濃度LF-Zhao對小鼠皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達的影響

實驗結(jié)果顯示LF-Zhao灌胃可以顯著提高老化損傷小鼠皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達(見圖2)，起到抗老化的作用，且高濃度的LF-Zhao的效果更為優(yōu)異，其皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的表達強度更為接近正常組小鼠。SOD在動物體內(nèi)有三種異構(gòu)體，Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和EC-SOD，體內(nèi)的Mn-SOD和Gu/Zn-SOD水平過低會導(dǎo)致自由基的大量產(chǎn)生，對機體造成老化損傷。CAT作為生物防御體系中的關(guān)鍵酶之一，能清除氧自由基和促進過氧化氫分解，從而避免氧化對體內(nèi)細(xì)胞的老化損傷[18]。

圖2　Lactobacillus fermentum Zhao灌胃小鼠皮膚組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表達水平

三、結(jié)語

本研究對不同濃度的LF-Zhao的抗老化效果進行研究，通過體外和動物體內(nèi)實驗證明LF-Zhao具有顯著的抗老化效果。不同濃度的LF-Zhao均能夠清除DPPH自由基和·OH。動物實驗也證明受到D-半乳糖誘導(dǎo)老化的小鼠在灌胃LF-Zhao后體內(nèi)NO和MDA含量下降，SOD和GSH-Px含量上升。進一步通過RT-PCR實驗觀察小鼠肝組織中mRNA表達的變化發(fā)現(xiàn)，LF-Zhao可以上調(diào)氧化損傷小鼠的nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT表達和下調(diào)iNOS表達。根據(jù)這些結(jié)果可以得出結(jié)論：LF-Zhao可以產(chǎn)生較好的抗老化效果。

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[責(zé)任編輯劉江南]

2016-04-11

重慶第二師范學(xué)院學(xué)生科研項目(2014036)

周小芳(1993— )，女，在讀本科生，研究方向：功能性食品；通信作者：趙欣(1981—)，男，教授，理學(xué)博士，研究方向：功能性食品。

TS201.4

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1008-6390(2016)05-0160-04