楊正騰廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023南寧市東葛路89-9號(hào)葉信廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001馬家寶王力寧陳小媛廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023陳勇廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001

·中藥方劑·

麻杏二陳特稟咳顆粒的提取工藝優(yōu)選及含量測(cè)定研究

楊正騰廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023南寧市東葛路89-9號(hào)
葉信廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001
馬家寶王力寧陳小媛廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院530023
陳勇*廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001

目的：考察并優(yōu)選麻杏二陳特稟咳顆粒的提取工藝，建立麻黃堿與橙皮苷的含量測(cè)定方法。方法：以麻黃堿與橙皮苷的含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選麻吉二陳特稟咳顆粒的提取工藝；采用HPLC測(cè)定麻黃堿、橙皮苷的含量，流動(dòng)相分別為甲醇-乙腈-0.2%磷酸（2.5∶2.5∶95）、乙腈-0.2%磷酸（21∶79），檢測(cè)波長(zhǎng)分別為208 nm、283 nm。結(jié)果：最佳提取工藝為加12倍水，提取3次，每次90 min。麻黃堿平均含量為0.59 mg/g，RSD=2.08%（n=3）；橙皮苷平均含量為2.98 mg/g，RSD= 3.61%（n=3）。結(jié)論：該提取工藝和含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行，可以為麻杏二陳特稟咳顆粒的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考。

麻杏二陳特稟咳顆粒；麻黃堿；橙皮苷；正交試驗(yàn)；HPLC

麻杏二陳特稟咳顆粒是在麻杏二陳湯復(fù)方基礎(chǔ)上開發(fā)而成，由炙麻黃、杏仁、細(xì)辛、射干、僵蠶、半夏、陳皮、茯苓、萊菔子和甘草等10味藥組成，是治療小兒特稟質(zhì)咳嗽的經(jīng)驗(yàn)方［1-2］。顆粒劑型既保留原處方的有效性，又符合小兒服藥特點(diǎn)，具有便于攜帶與保存的優(yōu)點(diǎn)。為此，本課題組將該方開發(fā)成顆粒劑，并對(duì)該方的工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器1260型高效液相色譜（美國(guó)安捷倫公司）；SQPPRAGTUM224-1CN電子分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Simplicity-185超純水器（美國(guó)密理博公司）；LG16-W高速微量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2試藥甲醇、乙腈為色譜純，水為純水，其他試劑均為分析純。麻黃堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：171241-201007）；橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110721-201306）；藥材均購自柳州市神農(nóng)中藥飲片廠。

表1　正交設(shè)計(jì)因素水平表

2　方法與結(jié)果

2.1提取工藝條件篩選原藥材飲片浸泡1 h，在同等溫度下（100℃）考察加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間三個(gè)因素［3］。取麻杏二陳湯處方量（61 g）9份，以麻黃堿和橙皮苷含量綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.5。采用L9（34）正交試驗(yàn)選取麻杏二陳特稟咳顆粒最佳提取工藝，設(shè)計(jì)因素水平表見表1，結(jié)果見表2、表3。

由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析可知，影響麻杏二陳湯提取效果的因素大小順序?yàn)锽＞A＞C，即提取次數(shù)＞加水量＞提取時(shí)間；其中A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1。且從表3方差分析結(jié)果得知，B因素對(duì)提取工藝有顯著影響（P＜0.05），故選擇最佳提取工藝條件為A3B3C2，即以12倍水量提取3次，每次90min。

表2　正交試驗(yàn)方案安排與結(jié)果

表3　方差分析結(jié)果

2.2處方顆粒的制備以上述最優(yōu)提取工藝為條件，濃縮藥液至浸膏，加乙醇使含醇量為60%，靜置24 h，濾過，再次濃縮至浸膏，加入適量輔料，混勻，過3號(hào)篩，整粒干燥至顆粒狀。

2.3麻黃堿的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［4-5］進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1麻黃堿對(duì)照品溶液的制備精密稱取麻黃堿對(duì)照品2.40mg，加甲醇定容至50ml，制成0.048mg/ml的麻黃堿對(duì)照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備取2.2項(xiàng)下顆粒劑2份，每份0.5 g，研細(xì)后精密稱定，置100m l錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，超聲30 min后取出放冷，加甲醇補(bǔ)足重量，過濾后備用。

2.3.3陰性溶液的制備按處方和篩選出的工藝制備不含麻黃的陰性樣品，并按2.3.2項(xiàng)方法制備得陰性溶液。

2.3.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示麻黃堿在208 nm處有最大吸收。

2.3.5色譜條件色譜柱為Agilent SB-C18柱（5μm，4.6mm×250mm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸（2.5∶2.5∶95），檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm，流速為1.0 ml/min。理論板數(shù)按麻黃堿峰計(jì)算均應(yīng)不低于3 000。此條件下色譜圖見圖1。

2.3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密吸取麻黃堿對(duì)照品溶液（0.048 mg/m l）5μl、10μl、15μl、20μl、25μl和30μl，按2.3.5項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y= 20667.3X-8421.6（r=0.9996），線性范圍為0.24～1.44μg。

2.3.7精密度試驗(yàn)分別精密吸取麻黃堿對(duì)照品溶液1μl，按2.3.5項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)出峰面積分別為12 277、12 280、12 283、12 272、12 289、12 268，計(jì)算峰面積的RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.3.8重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按2.3.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)出峰面積分別為1 523、1 527、1 518、1 531、1 529、1 530，RSD＜2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液20μl，室溫放置，分別于0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h按2.3.5項(xiàng)下色條件測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD為1.1%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取已知含量的樣品6份，分別加入適量麻黃堿對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率。測(cè)得平均回收率為100.02%，RSD為1.30%（n=6）。結(jié)果見表4。

圖1　麻黃堿HPLC色譜圖

表4　加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=b）

2.4橙皮苷的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［4-5］進(jìn)行測(cè)定。

2.4.1橙皮苷對(duì)照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷對(duì)照品10 mg，加甲醇定容至50m l，制成0.2mg/m l的橙皮苷對(duì)照品溶液。

2.4.2供試品溶液的制備取2.2項(xiàng)下顆粒劑2份，每份0.5 g，研細(xì)后精密稱定，置100 m l錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，超聲30min后取出放冷，加甲醇補(bǔ)足重量，過濾后備用。

2.4.3陰性溶液的制備按處方

和篩選出的工藝制備不含陳皮的陰性樣品，并按2.4.2項(xiàng)方法制備得陰性溶液。

2.4.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取2.4.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示橙皮苷在283 nm處有最大吸收。

2.4.5色譜條件色譜柱為Agi lent SB-C18柱（5μm，4.6 mm× 250 mm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（21∶79），檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，流速為1.0 ml/min。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。此條件下色譜圖見圖2。

2.4.6標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液（0.2mg/m l）5μl、10μl、15μl、20μl、25μl和30μl，按2.4.5項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=55 678.8X-11 163.6（r=0.9999），線性范圍為1.00～15.00μg。

2.4.7精密度試驗(yàn)分別精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液1μl，按2.4.5項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)出峰面積分別為44 521、44 530、44 511、44 512、44 526、44 510，計(jì)算峰面積的RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.4.8重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批樣品，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按2.4.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)出峰面積分別為33 223、33 227、33 218、33 231、33 229、33 230，RSD＜2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液20μl，室溫放置，分別于0 h，1 h，3 h，6 h，9 h，12 h按2.4.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD為1.5%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.10加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取已知含量的樣品6份，分別加入適量橙皮苷對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率。測(cè)得平均回收率為99.82%，RSD為1.36%（n=6）。結(jié)果見表5。

2.5樣品含量測(cè)定精密稱取2.2項(xiàng)下顆粒約0.5 g 3份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別取10μl按2.3.5和2.4.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算出麻黃堿和橙皮苷含量。結(jié)果見表6。

3　討論

3.1麻杏二陳湯的提取因素曾考察過藥材浸泡時(shí)間，但效果不明顯，故選擇中藥煎煮常規(guī)的加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間作為考察因素，并以處方中主藥麻黃和陳皮的有效成分麻黃堿和橙皮苷的含量綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最佳提取工藝條件為A3B3C2，即以12倍水量提取3次，每次90min。

3.2由于麻杏二陳湯中僵蠶、半夏等含有大量的蛋白質(zhì)和淀粉，所以在制備供試品溶液時(shí)會(huì)有大量沉淀，但不影響麻黃堿與橙皮苷的測(cè)定。

3.3特稟質(zhì)類似于西醫(yī)的過敏體質(zhì)，特稟質(zhì)咳嗽包括了咳嗽變異性哮喘（CVA）及既往病史有哮喘、CVA、過敏性鼻炎、蕁麻疹等過敏體質(zhì)小兒的咳嗽［6-7］。王力寧等［8］臨床研究發(fā)現(xiàn)麻杏二陳湯治療特稟質(zhì)咳嗽具有特異性。方中炙麻黃和杏仁宣降肺氣，細(xì)辛宣肺散寒，萊菔子化痰降逆，射干和僵蠶能夠解痙祛風(fēng)，半夏、陳皮和茯苓健脾燥濕化痰，甘草和中而調(diào)和諸藥。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，共奏逐寒化痰止咳之效。

本研究考察并優(yōu)選了麻杏二陳特稟咳顆粒的提取工藝，建立了麻黃堿與橙皮苷的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明，提取工藝和含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行，可為麻杏二陳特稟咳顆粒的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

圖2　橙皮苷HPLC色譜圖

表5　加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

表6　樣品中麻黃堿和橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

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（2016-07-23收稿/編輯陳明偉）

R284.1

A

1003-0719（2016）05-0072-04

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：桂科攻1355004）

，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物分析、中藥及其制劑質(zhì)量分析；E-mail：cy6381@163.com