易仲媛 甘國興△ 李勁平 郭小玲 饒劍花△

?

壯骨止痛方對去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦瘦素及其受體的影響

易仲媛1甘國興1△李勁平2郭小玲1饒劍花1△

目的 觀察壯骨止痛方對去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦瘦素及其受體的影響，探討其抗骨質疏松機制。方法 72只200 g左右的SD大鼠按體質量隨機抽出假手術組12只，造模組60只，造模組采用雙側去卵巢法造模，假手術組只切除卵巢周圍相應質量的脂肪。造模成功后，造模組大鼠按體質量隨機分為模型組、壯骨止痛方高劑量組(13.2 g/kg)、中劑量組(6.6 g/kg)、低劑量組(3.3 g/kg)和戊酸雌二醇組，每組12只。術后第5天開始藥物干預，模型組和假手術組給予相應體積的純凈水，持續(xù)13周。給藥結束后，檢測大鼠骨密度和下丘腦Leptin含量及OB-Rb蛋白表達。結果 模型組大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb含量顯著降低，骨密度顯著減少，與假手術組比較差異有統計學意義。壯骨止痛方各劑量組大鼠OB-Rb蛋白表達顯著增加，骨密度顯著增加，與模型組比較差異有統計學意義。結論 促進OB-Rb蛋白表達，可能是壯骨止痛方抗骨質疏松的作用機制之一。

骨質疏松；壯骨止痛方；瘦素；瘦素受體

壯骨止痛方由補骨脂、淫羊藿、枸杞子、牛膝等7味藥物組成，還有補益肝腎、壯骨止痛功效[1，2]，還具有顯著的抗骨質疏松作用。前期對壯骨止痛方抗骨質疏松的藥效物質和作用機制的研究取得了一定的進展，明確了柚皮苷、補骨脂酚、齊墩果酸、淫羊藿苷等是其主要藥效物質基礎，其可以通過調節(jié)鈣磷等無機元素，調節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸發(fā)揮抗骨質疏松作用，但是其具體的作用環(huán)節(jié)尚未完全闡明，今后應進一步深入研究其具體作用環(huán)節(jié)。我們前期研究發(fā)現壯骨止痛方能夠降低去卵巢骨質疏松模型大鼠血清瘦素，但是其對模型大鼠下丘腦瘦素及其受體表達的影響尚未明確。本研究通過探討壯骨止痛方對去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb的影響，從下丘腦瘦素信號傳導通路探討其抗骨質疏松的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3月齡SD雌性大鼠72只，體質量(220±15)g，SPF級。購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號No.43004700005517，中南大學湘雅三醫(yī)院動物實驗中心許可證號：SYXK(湘)2013-0001。標準普通飼料。

1.1.2 儀器 雙能X線骨密度儀(Unigamma，意大利)、酶標儀(BioTek， USA)、電子天平(奧豪斯儀器有限公司，CP214)、MIAS 醫(yī)學圖像分析系統，Motic B5顯微攝像系統等。

1.1.3 藥物與試劑 壯骨止痛方由中南大學藥學院李勁平教授制備；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，J20130009)；Leptin ELISA檢測試劑盒及OB-Rb 蛋白免疫組化檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥 采用國內外公認的雌性大鼠去卵巢3 個月造成絕經后骨質疏松癥病理模型[2]。大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為假手術組12只，造模組60只，用10%水合氯醛麻醉，在無菌條件下摘除雙側卵巢，假手術組僅在卵巢周圍切除相應質量的脂肪。造模成功后，按體質量隨機分為模型組、壯骨止痛方高劑量組、中劑量組、低劑量組、戊酸雌二醇組，加上假手術組共6組，每組12只。飼養(yǎng)于室溫23℃～25℃，相對濕度50%～70%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水。從術后第5 d開始，各組開始灌胃給藥干預，持續(xù)13周。模型組和假手術組給予等體積的純凈水。

1.2.2 下丘腦瘦素檢測 灌胃給藥干預結束后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，在冰蝶中迅速取出下丘腦，摘取1.0 g勻漿，取上清液按試劑盒操作說明采用ELISA檢測大鼠下丘腦Leptin含量。

1.2.3 下丘腦OB-Rb蛋白檢測 大鼠處死后，將取出的下丘腦用4%的多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋。標本用Shandon切片機間斷連續(xù)切片，切片厚4μm，60℃恒溫培養(yǎng)箱中烘烤24 h，常規(guī)脫蠟去水，PBS洗后，用SABC法(按試劑盒使用說明書)行免疫組織化學染色。DAB顯色，蘇木素襯染，常規(guī)封片。以棕黃色或棕褐色為陽性，每張免疫組化的切片選5個視野，采用北航MIAS醫(yī)學圖像分析系統進行分析。

1.2.4 骨組織形態(tài)學檢測 取左側股骨，用4% 的多聚甲醛固定48 h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，HE染色后顯微形態(tài)學計算機網絡系統測量脛骨平均骨小梁密度。

2 結果

2.1 對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織形態(tài)學的影響 大鼠骨組織HE染色后鏡下顯示，模型組大鼠骨小梁稀疏、破壞，骨髓腔擴大，梁髓比明顯下降；戊酸雌二醇組和壯骨止痛方各劑量組大鼠骨小梁密度分布比較均勻，梁髓比基本恢復正常。見圖1。

2.2 對去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb的影響 與假手術組比較，去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦Leptin含量顯著下降，OB-Rb蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；給藥干預后，壯骨止痛方高、中劑量組大鼠下丘腦OB-Rb蛋白表達顯著增加，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 對去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb的影響

組別劑量(g/kg)Leptin(ng/L)OB?Rb假手術組—15720±014971)069±0141)模型組—13482±01047046±013戊酸雌二醇組21×10-514901±034401)065±0171)高劑量組13212458±01361064±0141)中劑量組6613260±01710060±0111)低劑量組3313013±03940057±009

注：與模型組比較，1)P<0.05

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)學(10×40)

圖2 各組大鼠下丘腦OB-Rb蛋白表達免疫組化結果(SABC法)

3 討論

中藥抗骨質疏松的作用已經得到公認，但是其抗骨質疏松的作用機制大多尚未明確，這嚴重阻礙了中藥的國際化和現代化。近年來，廣大中醫(yī)藥科技工作者對中藥及其復方制劑的作用機制進行了研究，取得了一定的成果。但是中藥及其復方制劑藥效成分多、作用靶點多，給研究帶來了困難。壯骨止痛方具有顯著的抗骨質疏松作用，前期對壯骨止痛方抗骨質疏松的藥效物質和作用機制研究取得了一定的進展[2，4～15]，明確了柚皮苷、補骨脂酚、齊墩果酸、淫羊藿苷等是其主要藥效物質基礎，其可以通過調節(jié)鈣磷等無機元素，調節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸發(fā)揮抗骨質疏松作用，但是其具體的作用環(huán)節(jié)尚未完全闡明，今后應進一步深入研究其具體作用環(huán)節(jié)。我們前期研究發(fā)現壯骨止痛方能夠降低去卵巢骨質疏松模型大鼠血清瘦素，但是其對模型大鼠下丘腦瘦素及其受體表達的影響尚未明確。

近年來研究發(fā)現瘦素中樞調控骨代謝主要通過瘦素下丘腦交感神經系統調控，但是瘦素中樞調節(jié)骨代謝的機制十分復雜，研究結果也不盡相同。Fernández-Galaz等[16]研究證實瘦素可通過與表達于腦干5-羥色胺能神經元上的Ob-Rb相結合，減少5-HT的合成并抑制5-HT與下丘腦腹內側核上的5-HT受體Htr2c(5-hydroxytryptamine receptor 2c)之間的信號傳導，調控骨代謝。Sato等[17]研究發(fā)現NMU缺乏小鼠通過中樞下丘腦通路改變成骨細胞活性來調控骨代謝，并表現出骨生成及骨量的增加，由此提出了NMU調控骨代謝可能是通過瘦素下丘腦交感神經通路發(fā)揮作用的[18]。本研究中，模型組大鼠下丘腦瘦素含量顯著下降，瘦素長形受體(OB-Rb)蛋白表達顯著下降，骨密度顯著降低。給藥干預后，壯骨止痛方高、中劑量組大鼠瘦素長形受體(OB-Rb)蛋白表達顯著增加，骨密度顯著增加。研究結果提示，壯骨止痛方可能是通過促進下丘腦瘦素受體表達，增強瘦素中樞調節(jié)骨代謝作用，增加骨密度，這可能是其抗骨質疏松的機制之一。

[1] 曾英，莫新民，雷曉明，等.壯骨止痛膠囊對去卵巢雌鼠骨質疏松癥骨密度及相關生化指標的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2008，28(2)：10-12.

[2] 甘國興，莫新民，李勁平，等. 壯骨止痛方藥效部位的篩選及其對骨質疏松雌鼠骨代謝相關激素的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(15)：126-130.

[3] 易仲媛，甘國興， 郭小玲，等.壯骨止痛方對去卵巢骨質疏松大鼠下丘腦神經肽Y及α-促黑素的影響[J].中國醫(yī)藥導報，2016，13(2)：20-23.

[4] 莫新民，曾英，彭瓊輝，等.壯骨止痛膠囊治療去卵巢雌鼠骨質疏松癥療效的實驗研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2007，13(3)：195-198.

[5] 曾英，莫新民，雷曉明，等.壯骨止痛膠囊對去卵巢雌鼠骨質疏松癥骨強度和骨生物力學的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2007，13(4)：292-295.

[6] 張國民，莫新民，甘國興，等.壯骨止痛方全方提取物對去勢雌鼠基質金屬蛋白酶2的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16(11)：1010-1012.

[7] 楊軍，莫新民，李勁平.壯骨止痛方治療大鼠去卵巢骨質疏松癥的蛋白質組學分析[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2012，18(2)：166-168.

[8] 高峰，莫新民，李勁平，等.去勢大鼠骨質疏松癥基因表達譜特征初步分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(12)：29-31

[9] 高峰，莫新民，李勁平.淫羊藿苷治療去勢大鼠骨質疏松癥基因表達譜分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20(2)：43-45

[10] 李勁平，曾英，雷曉明，等. 壯骨止痛膠囊抗實驗性絕經后骨質疏松作用的三維組學分析[J]. 中國中藥雜志，2014，39(16)：3203-3207.

[11] 甘國興，莫新民，李勁平，等.壯骨止痛方水提B部位對去勢雌鼠骨質疏松的療效及機理研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011，17(2)：158-160.

[12] 甘國興，莫新民，李勁平，等.壯骨止痛方石油醚提取A部位對去勢雌鼠骨質疏松的療效及機理研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16(12)：1169-1170，1185.

[13] 甘國興，莫新民，李勁平，等.壯骨止痛方無水乙醇提取A部位對去勢雌鼠骨質疏松的療效及機制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(17)：147-150.

[14] 李勁平，林清，王小靜，等.壯骨止痛膠囊A部分抗骨質疏松有效成分研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24(5)：1049-1051.

[15] 李勁平，王小靜，曾英，等.補骨脂定抗實驗性絕經后骨質疏松的效應及作用機理研究[J].中國中藥雜志，2013，11(6)：1816-1819.

[16] Fernandez-Galaz MC., Fernandez-Agullo T, Carrascosa JM, et al.Leptin accumulation in hypothalamic and dorsal raphe neurons is inversely correlated with brain serotonin content[J]. Brain Res, 2010,1329(1): 194-202.

[17] Sato S, Hanada R, Kimura A, et al. Central control of bone remodeling by neuromedin U[J]. Nat Med, 2007, 13(10): 1234-1240.

[18] Driessler F, Baldock P A. Hypothalamic regulation of bone [J].Journal of molecular endocrinology, 2010, 45(4): 175-181.

中和醫(yī)派基本學術觀點

中醫(yī)定義：中醫(yī)，是以中醫(yī)基本理論為指導，以望聞問切“四診”為主要手段采集臨床信息，通過四診合參，運用辨證論治診斷疾病及其證候，采用天然藥物組方或采用非藥物療法，實施預防、治療、保健的醫(yī)學行為主體。

中醫(yī)藥五大特色：個性化的辨證論治 求衡性的防治原則 人性化的治療方法 多樣化的給藥途徑 天然化的用藥取向

中醫(yī)藥六大優(yōu)勢：臨床療效確切，用藥相對安全，服務方式靈活，文化底蘊深厚，創(chuàng)造潛力巨大，發(fā)展空間廣闊。

養(yǎng)生總則三個字： 和則安

養(yǎng)生要訣三個詞： 上善 中和 下暢

養(yǎng)心法則三句話：是非審之于己 毀譽聽之于人 得失安之于數

養(yǎng)生方法四點：童心 蟻食 猴行 龜欲

中醫(yī)藥文化核心理念：以人為本 效法自然 和諧平衡 濟世活人

中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)藥文化建設三點:主題是突出中醫(yī)藥文化核心價值 關鍵是充實中醫(yī)藥文化內涵 重點是彰顯中醫(yī)藥文化特征

臨床學術觀點：扶正祛邪益中和 存正抑邪助中和 護正防邪固中和

臨床基本原則：慈悲為本 仁愛為先 一視同仁 中和乃根

臨床思辨特點：調氣血 平升降 衡出入 達中和

臨床基本處方：調氣活血抑邪湯

中和醫(yī)派臨床三要：一要善于調氣血 二要善于平升降 三要善于衡出入

中醫(yī)“治未病”“三強調”特征：強調以人為本，防重于治，強調形與神俱，和諧平衡，強調天人合一，效法自然。

中醫(yī)藥文獻研究“四有”原則：有淵源 有依據 有類比 有歸納

中醫(yī)藥文獻研究要有“四強”：可信性強 導向性強 實用性強 拓展性強

——摘自《明醫(yī)薪傳——北京同仁堂中醫(yī)大師孫光榮教授學術經驗傳承》

Effect of Zhuanggu Zhitong Prescription on Leptin and OB-Rb in the Hypothalamus of Ovariectomized Rats with Osteoporosis

YI Zhongyuan1GAN Guoxing1△LI Jingping2GUO Xiaoling1LIU Yu1RAO Jianhua1

(1.Department of Pharmacy, Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangdong, Qingyuan 511500, China；2.College of Pharmacy, Central South University, Hunan, Changsha 410013, China)

Objective To explore the effect of Zhuanggu Zhitong prescription on the Leptin and OB-Rb in the hypothalamus of ovariectomized rats with osteoporosis, and to investigate its mechanism in anti-osteoporosis. Method 72 rats were randomly divided into sham group (12) and model group (60). The model group rats were ovariectomized, and the sham group rats were excised equal weight fat. After the modeling, the rats were randomly divided into model group, Zhuanggu Zhitong prescription high-dose group, Zhuanggu Zhitong prescription middle-dose group, Zhuanggu Zhitong prescription low-dose group and estradiol valerate group, with 12 rats in every group. After 5 days of the operation, rats started to receive drug therapy for 13 weeks. The model group and the sham group rats were given equal volume water. After the test, the content of Leptin and OB-Rb in the hypothalamus was detected. Results The content of Leptin and OB-Rb in the hypothalamus of ovariectomized rats with osteoporosis was significantly declined (P<0.05). After drug therapy, the content of OB-Rb in the hypothalamus and BMD of ovariectomized rats with osteoporosis were significantly increased (P<0.05). Conclusion Promoting the expression of OB-Rb may be one mechanisms of Zhuanggu Zhitong prescription in anti-osteoporosis.

Osteoporosis; Zhuanggu Zhitong prescription; Leptin; OB-Rb

國家自然科學基金項目(No.30873291)；清遠市科技計劃項目(No.2015B055)

1.廣東省清遠市中醫(yī)院藥學部(清遠 511500)；2.湖南省中南大學藥學院(長沙 410013)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.19.018

1003-8914(2016)-19-2803-04

?衛(wèi)星

2016-06-29)