吳湛霞，潘江球，楊子明，陳 松，黃盛東，李普旺，楊錫洪，李思東

（1.廣東海洋大學理學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；3.中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所，廣東 湛江 524001；4.青島科技大學化學與分子工程學院，青島 山東 266061）

混合分子質量殼聚糖結合臭氧殺菌處理對羅非魚片的冷藏保鮮作用

吳湛霞1，潘江球2，楊子明3，陳 松1，黃盛東1，李普旺3，楊錫洪4，李思東1

（1.廣東海洋大學理學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；3.中國熱帶農業(yè)科學院農產品加工研究所，廣東 湛江 524001；4.青島科技大學化學與分子工程學院，青島 山東 266061）

以感官評分、細菌總數、pH、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）等作為其保鮮效果的評價指標，研究混合分子質量的殼聚糖結合臭氧殺菌處理對羅非魚片4℃冷藏保鮮效果的影響。結果表明：混合分子質量殼聚糖結合臭氧水殺菌處理能減少羅非魚片的菌落總數并抑制細菌的生長繁殖，減緩pH的變化，保持羅非魚片的感官品質，延緩TVB-N值的升高，延長羅非魚片的保鮮期，其保鮮效果優(yōu)于單一分子質量的殼聚糖。

羅非魚片；冷藏保鮮；殼聚糖；臭氧水

羅非魚（Tilapia）又名福壽魚、非洲鯽魚等，現已成為世界性的養(yǎng)殖魚類［1-2］。因其水分含量高和營養(yǎng)成分豐富而極易腐敗變質，導致羅非魚及其相關產品的貨架期較短，這在一定程度上制約了其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。通過添加保鮮劑仍是延長羅非魚冷藏貨架期的重要途徑［3］，安全、高效和低成本是人們對防腐劑提出的新要求。殼聚糖作為一種天然、無毒、無味、高效的生物防腐劑，在食品保鮮領域得到了廣泛應用［4-11］。前期研究表明［12］，殼聚糖雖對羅非魚具有較好的保鮮效果，但保鮮效果的提升仍顯有限。

臭氧水具有極強的氧化能力和殺菌消毒能力［13］。利用臭氧水處理魚肉，不僅可改善羅非魚片的色澤，還可減少其初始菌落總數，從而延長產品貨架期［11-16］。殼聚糖的成膜性、滲透性和抑菌性受分子質量的影響；相對分子質量高的殼聚糖具有更好的成膜特性，而低分子質量的殼聚糖具有更好滲透性和抑菌性［17］。將高低兩種分子質量的殼聚糖按不同配比混合制得新型保鮮劑其效果要好于單一分子質量的殼聚糖［18-19］。本研究以羅非魚片為原料，結合臭氧水殺菌處理，以不同分子質量的兩種殼聚糖不同比例混合液作為保鮮劑，探討其對羅非魚片的冷藏保鮮品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：新鮮羅非魚，平均每尾約500 g，購于湛江市沃爾瑪超市。

試劑：南通生物興成制品廠殼聚糖（食品級，分子質量為4 ku、200 ku，脫乙酰度≥90%），sigma公司甲醇（色譜純），上海源葉生物科技有限公司ATP關聯物ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx標準品，其余試劑均為分析純。

儀器：日本日立HIMAC CR22GII 冷凍離心機，日本島津公司 LC-20AT高效液相色譜，北京恒瑞天創(chuàng)機電設備有限公司 HR/TYJ-2A 型菌落計數器，上海佑科儀器儀表有限公司 722S型可見光分光光度計，青島海爾股份有限公司BCD-215KS冰箱，上海博迅實業(yè)有限公司BPH-9272型恒溫培養(yǎng)箱，上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-50FBS不銹鋼立式壓力滅菌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同比例混合殼聚糖抑菌性能的測定 將分子質量分別為4 ku與200 ku殼聚糖配制成質量濃度為10.0 g/L的醋酸溶液（溶劑醋酸溶液的質量濃度為1%）。分別量取0.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0mL分子質量4 ku殼聚糖溶液和100.0、80.0、70.0、60.0、50.0、40.0、30.0、0.0分子質量200 ku殼聚糖進行兩兩混合，制得4 ku的殼聚糖比率分別為0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、100%（以混合殼聚糖中4 ku殼聚糖體積分數計）的殼聚糖混合液。參照文獻［20-22］的方法，測定不同比例混合殼聚糖的抑菌活性。

1.2.2 不同質量濃度臭氧水對羅非魚初始附生菌菌落總數的影響 將鮮活羅非魚采用碎冰冰凍至死，去除鱗、頭、尾、內臟（“四去”處理）后，用冰水清洗干凈，取其背部肉片并切成小塊。通過控制臭氧通入冷水的持續(xù)時間，制備不同濃度的臭氧水。每份取羅非魚片20 g，反復使用臭氧水浸泡3次，每次使用臭氧水80mL，浸泡5 min。參考文獻 ［23］的方法來測定不同處理羅非魚片的初始菌落總數。

1.2.3 混合殼聚糖結合臭氧水殺菌處理對羅非魚的冷藏保鮮效果

1.2.3.1 試樣的處理 將鮮活羅非魚采用碎冰冰凍至死，經“四去”處理后，用冰水清洗干凈，取羅非魚背部肉片，并切成長約為5cm、寬約為3 cm、厚約為1 cm的魚片。然后混勻、瀝干，取出其中500g不做任何處理，作為空白對照組。再將剩余的羅非魚片浸泡于4L臭氧水中5 min，重復3次。取出其中 500 g，記作臭氧水處理組。最后將剩余的羅非魚片分為兩組，每組均不少于 500 g。將其中一組浸泡于質量濃度為1%、分子質量為4ku的殼聚糖溶液中，記作4 ku殼聚糖組；另外一組浸泡于質量濃度為 1%的混合殼聚糖溶液中，其中分子質量為4 ku和200 ku殼聚糖的比例為2∶3，記作混合殼聚糖組。隨后，將各組羅非魚片濾干并進行真空包裝和標記，每個包裝袋羅非魚片的質量約為50 g，然后平鋪于 4℃的冰箱中進行冷藏保鮮。在貯藏過程中，每天隨機取出袋裝樣品對其進行感官評分、細菌總數、 pH和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N 值）的測定。本實驗使用的溶液和臭氧水均預先冷卻至4℃，臭氧水由臭氧發(fā)生器產生的臭氧通入4℃的純凈水5 min所制得的。

1.2.3.2 測定方法 主要測定羅非魚片在貯存過程中的感官評分值、菌落總數、pH值以及揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N），各指標的測定方法同文獻［12］。

2 結果與討論

2.1 不同比例混合殼聚糖的抗菌性能

分子質量4 ku和200 ku的殼聚糖按不同比例混合后的抑菌圈大小見圖1。隨著4 ku分子質量殼聚糖比率的逐漸升高，其抑菌圈先增大后減小，當4 ku分子質量殼聚糖的比率為40%時，抑菌圈最大，達到19.7mm，比4 ku分子質量殼聚糖的大11%，比200 ku分子質量殼聚糖的大55%。此時混合殼聚糖的抑菌圈大于單一分子質量的，說明混合殼聚糖的抗菌性可以強于單種分子質量的殼聚糖，更能發(fā)揮不同分子質量殼聚糖抗菌性能的優(yōu)勢。有研究表明，高分子質量的殼聚糖易在微生物表面形成一層薄膜，阻礙了微生物的物質轉化和呼吸基質的消耗［24，25］；小分子質量殼聚糖具有較強的滲透力，滲入到微生物的細胞體內，擾亂微生物的正常生理活動［26，27］。兩種分子質量的殼聚糖混合，可以充分發(fā)揮它們各自的優(yōu)勢，從而增強其抑菌效果。

圖1 不同比例混合殼聚糖的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of mixed chitosan with different proportion

2.2 臭氧水質量濃度對羅非魚片菌落總數的影響

由圖2可知，隨著臭氧通入時間的增加，臭氧水的濃度在增大。用不同濃度的臭氧水處理羅非魚片，羅非魚片的菌落總數隨著臭氧水濃度的增大而減小。將臭氧通入冷水5 min所制得的臭氧水質量濃度可達4.48 mg/L，用該臭氧水處理羅非魚片，可將羅非魚片上附生菌的菌落總數降低至初始值的19.0%。因此可知，將臭氧通入4℃的純凈水5 min所制得的臭氧水用于羅非魚片保鮮的殺菌預處理方法可行，效果明顯。

2.3 混合殼聚糖結合臭氧水殺菌處理對羅非魚的冷藏保鮮效果

2.3.1 羅非魚片在冷藏過程中感官評分的變化由圖3可知，在整個保鮮過程中，未經殼聚糖處理組別的感官評分相對下降得較快，呈先快后慢的趨勢，而經殼聚糖處理后的組別的下降速度則相對較為平緩，表明殼聚糖能有效延緩羅非魚的腐敗變質，延長羅非魚的冷藏保鮮期。新鮮羅非魚片可在4℃的條件下保持一級鮮度1 d，二級鮮度3 d。經臭氧水處理后，羅非魚片的初始菌落總數有所下降，冷藏保鮮期為4 d，比對照組延長了1 d。而羅非魚片經臭氧水殺菌處理后，配合殼聚糖進行保鮮的效果更佳，均能使羅非魚片的冷藏保鮮期延長至10 d以上。與4 ku殼聚糖組相比，混合殼聚糖組的感官評分更高，說明混合殼聚糖更能保持羅非魚的品質，具有更好的保鮮效果。

圖2 臭氧水處理對羅非魚片菌落總數的影響Fig.2 The effect of ozone water on total bacterial count of Tilapia Fillets

圖3 羅非魚片在冷藏過程中感官評分的變化Fig.3 Sensory scores of Tilapia fillets during cold storage

2.3.2 羅非魚片在冷藏保鮮過程中pH的變化 在死魚體整個冷藏保鮮過程中，糖原酵解產生乳酸及ATP、磷酸肌酸而使 pH逐漸降低，但達到最小值后，隨著魚體鮮度的下降，氨和胺類化合物的生成，pH又逐漸回升。由圖4可知，未經殼聚糖處理的組別的pH變化較快，幅度也較大，而經殼聚糖處理后的組的pH變化則較為平緩，表明殼聚糖能有效延緩魚體酸性物質和堿性物質的生成，延長羅非魚的冷藏保鮮期。其次，與空白對照組相比，臭氧水處理組的變化及其變化幅度均較小，說明臭氧水殺菌處理可在一定程度上延長羅非魚的冷藏保鮮期。與4 ku殼聚糖組相比，混合殼聚糖組的變化速度及其變化幅度較4 ku殼聚糖組小，pH出現的最低值也相對較高，這表明混合殼聚糖更能延緩魚體酸性物質和堿性物質的生成，具有更佳的冷藏保鮮效果。在整個保鮮過程中，殼聚糖組的pH均低于空白對照組，這可能與醋酸殘留于魚體外表有關，尚需進一步實驗證明。此外，pH達到最低值的時間依次是空白對照組、臭氧水處理組、4 ku殼聚糖組和混合殼聚糖組，這表明臭氧水和殼聚糖可在一定程度上延緩pH達到最低值的時間，這可能是由于臭氧水殺菌和殼聚糖處理能延緩糖原酵解產生乳酸、磷酸肌酸等酸性物質。由于酸性物質的生成被延緩了，而堿性物質也一直在生成，因此魚體pH值的變化速度和變化幅度就變得較為平緩。

圖4 羅非魚片的pH值與貯藏時間的關系Fig.4 pH values of Tilapia fillets during cold storage

2.3.3 殼聚糖濃度對羅非魚片揮發(fā)性鹽基氮

（TVB-N）的影響 揮發(fā)性鹽基氮是通過測定蛋白質在酶和細菌作用下分解產生的揮發(fā)性氮等堿性含氮化合物的鮮度指標。隨著羅非魚冷藏保鮮時間的延長、鮮度的下降，其TVB-N值也逐漸升高。TVB-N值越小，說明保鮮效果越好。由圖5可知，保鮮效果由劣至好依次為空白對照組、臭氧水處理組、4 ku殼聚糖組和混合殼聚糖組。臭氧水處理組的TVB-N值基本上比空白對照組的小，說明臭氧水殺菌處理可在一定程度上延緩魚肉的腐敗。殼聚糖處理組的TVB-N值均低于空白對照組，說明殼聚糖能有效延緩魚體蛋白質的分解、變性、腐敗，延長羅非魚的貨架期。混合殼聚糖的TVB-N值最小，變化速度也最為緩慢，說明其保鮮效果最好。此外，空白對照組可保持一級鮮度1 d，到4 d時，TVB-N值已達到33.05×10-2mg/g，超過了二級鮮度的閾值（30 mg/100g），而殼聚糖組TVB-N值均沒超過二級鮮度的閾值（30 mg/100g），這表明殼聚糖配合臭氧水殺菌處理可延長羅非魚的冷藏保鮮期至10 d以上。

圖5 羅非魚片的揮發(fā)性鹽基氮值與貯藏時間的關系Fig.5 Total volatile basic nitrogen（TVB-N）values of Tilapia fillets during cold storage

2.3.4 混合殼聚糖與羅非魚片菌落總數的關系

隨著冷藏保鮮時間的延長，魚體鮮度的下降，羅非魚的細菌總數也逐漸增加。羅非魚片在冷藏保鮮過程中的細菌總數的對數值由大到小依次為空白對照組、臭氧水處理組、4 ku殼聚糖組和混合殼聚糖組。微生物的生命活動是導致水產品腐敗變質的主要因素，細菌總數是判斷羅非魚鮮度的重要指標之一。由圖6可知，臭氧水處理組可減少羅非魚的初始菌落總數，并延長羅非魚的貨架期，并且臭氧水殺菌處理配合殼聚糖的保鮮效果更佳。保鮮10 d，殼聚糖處理組菌落總數的對數值仍未超過6。與4 ku殼聚糖組相比，混合殼聚糖組的細菌總數更少，說明其保鮮效果更好。因此，混合殼聚糖能有效抑制微生物的生長繁殖，保持羅非魚的品質，延長羅非魚的冷藏保鮮期，配合臭氧水殺菌處理，效果更佳。

圖6 羅非魚片的菌落總數與貯藏時間的關系Fig.6 Total bacterial count of Tilapia fillets during cold storage

3 結 論

混合殼聚糖配合臭氧水殺菌處理能有效抑制細菌的生長繁殖，減緩蛋白質的自溶和分解，保持羅非魚片的品質，延緩羅非魚片的腐敗變性，延長羅非魚的保鮮期，且其保鮮效果優(yōu)于單純殼聚糖。采用臭氧水殺菌處理并結合混合分子質量殼聚糖處理羅非魚片的保鮮鮮果要好于單一分子質量的殼聚糖或臭氧水，操作方便、效果好，具有較好的應用前景。

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（責任編輯：陳莊）

Effect of Different Molecular Weight of Chitosan Mixture Combined with Ozone Water Sterilization on Preservation of Tilapia Fillets During Cold Storage

WU Zhan-xia1，PAN Jiang-qiu2，YANG Zi-ming1，CHEN Song1，HUANG Sheng-dong1，LI Pu-wang3，YANG Xi-hong4，LI Si-dong1
（1.College of science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；3.Agricultural Products Processing Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524001，China；4.College of Chemistry and Molecular Engineering，Qingdao University of Science & Technology，Qingdao 266061，China）

The current study investigated the preservative effects of different molecular weight of chitosan mixture combined with ozone water sterilization for extending the shelf-life of filleted tilapia during refrigerated.The results showed that tilapia fillets treated with mixture chitosan can keep the better sensory score，slow down the change of pH and total volatile basic nitrogen（TVB-N），and decrease total bacteria count，which indicate a better preservative effect.

Tilapia fillets；cold storage；chitosan；ozone water

S983

A

1673-9159（2016）03-0071-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.012

2016-02-19

國家自然科學基金（ 31271938） ； 廣東省教育廳創(chuàng)新強校工程項目（ GDOU2013050330，2014KZDXM038）

吳湛霞（1967—），女，實驗師，研究方向為海洋應用化學。

李思東（1960—），男，本科，教授，研究方向為海洋應用化學。E-mail： lisidong2210491@163.com