潘曉艷，鄭 哲，田榮榮，焦 鈺，杜曉東

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025）

miR-210在馬氏珠母貝外套膜礦化機制中的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

潘曉艷，鄭 哲，田榮榮，焦 鈺，杜曉東

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524025）

為進一步探究Pm-miR-210在馬氏珠母貝貝殼形成的作用，利用miR-RACE技術(shù)驗證Pm-miR-210的成熟體序列并進行序列分析，通過生物信息學(xué)分析來獲得Pm-miR-210的前體序列，并進行組織定量和靶位點預(yù)測。結(jié)果表明，Pm-miR-210的miR-RACE結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫與Pm-miR-210成熟體序列比對，獲得的前體序列長度為80 bp并具有典型的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。多序列比對結(jié)果顯示，Pm-miR-210成熟體序列的種子區(qū)域在不同物種間具有極高的保守性。熒光定量結(jié)果得出，Pm-miR-210在外套膜邊緣膜和中央膜中均有表達，但表達量差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。靶向預(yù)測分析結(jié)果顯示，鈣調(diào)蛋白（calmodulin）、鈣調(diào)磷酸酶-A亞基（calcineurin A subunit）、N19以及Shematrin-3為Pm-miR-210的候選靶基因。

馬氏珠母貝；Pm-miR-210；靶向預(yù)測；貝殼形成

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)生性、在序列結(jié)構(gòu)上具有很大保守性、長度為21～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA［1-2］。miRNA 主要是通過其種子序列（5' 端第2—8 nt）與靶mRNA 的3'UTR進行完全或不完全互補配對，從而抑制mRNA的翻譯或直接使其降解或沉默，行使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能［3-6］。如果miRNA與其靶mRNA完全互補，作用方式和功能與siRNA非常類似，則最后切割靶mRNA［7］。目前，發(fā)現(xiàn)的數(shù)以千計的 miRNA通過對靶基因的調(diào)控［8-10］，參與了包括生長發(fā)育、細胞分化、細胞調(diào)亡等幾乎所有己知細胞生理過程［11-14］，并與生物體的感染、腫瘤、代謝性疾病等多種病理過程有關(guān)［15］。

miRNA-210是miRNA中的一種類型，作為一種靶基因的沉默子，主要與癌癥及癌細胞轉(zhuǎn)移的研究有關(guān)［16-17］。有研究報道，miRNA-210位于人體染色體的11p15.5位點上［18］，通過參與機體的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［19］，使得癌細胞和干細胞一樣具有了浸染和轉(zhuǎn)移的能力。但最新研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-210還可能與骨髓間充質(zhì)干細胞分化有關(guān)［20］。

馬氏珠母貝（Pinctada martensii），又稱合浦珠母貝（Pinctada fucata），屬軟體動物門珠母貝屬，是我國南方沿海地區(qū)人工培育海水珍珠的最常用貝類［21］。在前期的實驗中本課題組發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝中也存在miR-210［22］，鑒于miR-210在調(diào)節(jié)成骨細胞礦化以及調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞分化中發(fā)揮作用，推測miR-210在貝殼形成過程中行使了相應(yīng)的功能。為了進一步探究miR-210在馬氏珠母貝礦化中的作用機制，本研究利用miR-RACE、生物信息學(xué)及實時熒光定量PCR技術(shù)對Pm-miR-210進行序列驗證和分析以及組織定量檢測，并進行Pm-miR-210靶位點基因的篩選，為貝類礦化機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用馬氏珠母貝取自湛江市徐聞縣廣東岸華集團珍珠養(yǎng)殖基地，選取活力旺盛、生長狀況良好的貝體進行實驗。馬氏珠母貝外套膜邊緣膜和中央膜材料離體后立即放入液氮速凍，之后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNAiso for Small RNA購自Takara，Trizol購自Invitrogen公司，SYBR? Select Master Mix 購自Applied Biosystems公司，GeneJET PCR Purification Kit 購自Thermo公司、DNA Marker、Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq 聚合酶、pMD19-T vector購自大連寶生物工程有限公司，大腸桿菌DH5α為本實驗室自備。

1.2 方法

1.2.1 Small RNA提取和模板 cDNA制備 采用RNAiso for Small RNA試劑盒及說明書提取馬氏珠母貝外套膜的small RNA，得到的small RNA需經(jīng)過0.01 g/mL 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并使用紫外分光光度計來檢測其濃度。選取質(zhì)量較好的small RNA，參照TaKaRa Poly（A） Polymerase說明書進行后續(xù)的3' 端加Poly A尾和5' 端加接頭實驗，然后通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶以及通用引物制備cDNA模板。整個實驗過程所用耗材均要求RNase-free。

1.2.2 miR-RACE的擴增 分析已獲得的馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中 Pm-miR-210，采用上述步驟合成的cDNA模板，通過Primer Premier 5.0軟件分別對Pm-miR-210設(shè)計3' miR-RACE、5' miR-RACE特異性引物GSP1和GSP2，結(jié)合3' miR-RACE和5' miR-RACE所對應(yīng)的通用引物進行PCR擴增，引物序列如表1。采用莖環(huán)法［23］，設(shè)計莖環(huán)引物。PCR擴增體系及反應(yīng)程序均參照TaKaRa公司提供的說明書進行。依據(jù)不同引物的退火溫度Tm值調(diào)整。PCR擴增產(chǎn)物通過0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的基因片段連接到pMD19-T載體上，16℃放置16 h。之后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，菌落PCR后挑取陽性單克隆送往上海生工測序［24］。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequences and application

1.2.3 Pm-miR-210序列分析 經(jīng)測序驗證 PmmiR-210的成熟體序列后，通過Clustal W2在線軟件進行序列同源性分析，然后從馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)庫找到包含Pm-miR-210在內(nèi)的scaffold序列，利用 M-fold 軟件在線預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，得到Pm-miR-210前體序列及頸環(huán)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 熒光定量PCR檢測Pm-miR-210的表達

利用 Trizol法提取馬氏珠母貝外套膜邊緣膜和中央膜的總RNA，經(jīng)0.01g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并使用紫外分光光度計測定A260/A280值，之后對總RNA進行篩選，使用質(zhì)量較好且條帶完整無損的總 RNA進行熒光定量PCR模板的制備。在此過程中使用莖環(huán)引物對Pm-miR-210進行特異性反轉(zhuǎn)錄。把反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA模板稀釋100倍，以U6作為內(nèi)參［22］，按照如下反應(yīng)體系進行熒光定量 PCR：SYBR Mix 5 μL，cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 3.7 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 7 min ，95℃15 s，Tm 10 s，72℃35 s，40個循環(huán)。采用 2-△△Ct法計算Pm-miR-210在馬氏珠母貝外套膜邊緣膜和中央膜中的相對表達量，并且根據(jù)SPSS 20.0進行兩組間的差異性統(tǒng)計分析［25］。

1.2.5 生物信息學(xué)進行Pm-miR-210的靶位點基因預(yù)測 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載具有完整3' UTR序列的馬氏珠母貝礦化相關(guān)基因，利用靶位點預(yù)測軟件RNA-hybrid預(yù)測Pm-miR-210的靶位點與礦化相關(guān)基因的3'UTR作用位點，以自由能小于-20 kcal/mol 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得Pm-miR-210的靶基因。

2 結(jié) 果

2.1 Pm-miR-210的序列克隆及分析

利用miR-RACE技術(shù)擴增得到Pm-miR-210的3'端序列和5'端序列，測序結(jié)果顯示，測序結(jié)果與預(yù)測序列完全一致，說明高通量測序的準(zhǔn)確度很高。通過Clustal W2在線軟件，將人類（Homo sapiens）、家鼠（ Mus musculus）、果蠅（ Drosophila pseudoobscura）和海蠕蟲（Capitella teleta）的miR-210成熟體序列同馬氏珠母貝Pm-miR-210序列進行同源性比較，結(jié)果顯示物種間miR-210在種子區(qū)域（5'端第2-8nt）完全一致，Pm-miR-210與果蠅的成熟體同源性達到82%，只有4個堿基的差異。與人類和家鼠的成熟體同源性也高達73%，雖與海蠕蟲相比較，同源性較低，但也達到了64%。說明Pm-miR-210與其他物種的miR-210序列具有較高的保守性（圖1）。并且，采用M-fold在線軟件獲得了Pm-miR-210前體序列的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其與典型的miRNA一樣，具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1 序列比對結(jié)果Fig.1 Sequence alignment results

圖2 前體序列及二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Precursor sequence and two-stage structure

2.2 Pm-miR-210的外套膜表達量分析

提取馬氏珠母貝外套膜邊緣膜和中央膜的RNA后，使用莖環(huán)引物特異性反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板進行實時熒光定量 PCR。熒光定量結(jié)果顯示，Pm-miR-210在外套膜邊緣膜和中央膜都有較高表達，CT值分別為11.9和11.1，而且在邊緣膜的含量比在中央膜的含量高出0.442631，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 馬氏珠母貝Pm-miR-210靶基因的篩選

將馬氏珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中礦化相關(guān)的unigene序列靶點篩選后得出Pm-miR-210對多個靶位點都具有不同程度的調(diào)控作用，結(jié)合miR-210的文獻報道及在線預(yù)測軟件 RNAhybrid顯示的最小自由能，最終確定鈣調(diào)蛋白（calmodulin）、鈣調(diào)磷酸酶-A亞基（calcineurin A subunit）、N19以及shematrin-3為Pm-miR-210的候選靶基因（圖3）。

圖3 候選靶基因Fig.3 Candidate target genes

3 討 論

本實驗以課題組前期研究中構(gòu)建的馬氏珠母貝miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中miR-210的序列為基礎(chǔ)，通過高通量測序后獲得Pm-miR-210序列，通過與其他物種的成熟體序列比對得出，Pm-miR-210成熟體的序列的保守性較高，在種子區(qū)域（miRNA 5'端第2-8個核苷酸）完全一致，說明miR-210在進化過程中比較保守。研究表明，“種子”序列［26］和靶基因的堿基互補配對對于miRNA發(fā)揮調(diào)控功能至關(guān)重要。從熒光定量結(jié)果來看，Pm-miR-210在外套膜中央膜和邊緣膜中均有表達，證實了Pm-miR-210在外套膜中的存在，初步推測它參與了棱柱層和珍珠層的生物礦化。

馬氏珠母貝的貝殼及珍珠的形成是一個十分復(fù)雜的生物礦化過程，外套膜是礦化作用中最關(guān)鍵的組織。外套膜細胞分泌的有機基質(zhì)（基質(zhì)蛋白）和鈣離子等前驅(qū)物經(jīng)過沉淀最終形成貝類的貝殼和珍珠［27，28］。一般來說，外套膜邊緣區(qū)外表皮細胞主要分泌形成棱柱層，外套膜套膜區(qū)及中央?yún)^(qū)外表皮細胞主要分泌形成珍珠層［29］。從熒光定量結(jié)果得出，Pm-miR-210在外套膜的邊緣膜和中央膜有較高的表達量，CT值分別為11.9和11.1。因此推測miR-210可能參與了馬氏珠母貝的礦化過程，即參與了珍珠層和棱柱層形成的表達調(diào)控。

與貝類貝殼形成的礦化機制相似，生物體骨骼的形成也是一個礦化作用的過程。骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone Mesenehymal Stem Cells，BMSCs）具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為成骨細胞［30］，成骨細胞分泌的骨基質(zhì)與鈣離子經(jīng)過一系列的礦化作用，最終形成新骨。在這一過程中，一些miRNA的調(diào)控會影響成骨細胞的分化，進而干擾或抑制礦化生理過程。Mizuno等［31］利用實時定量PCR法得出，在間充質(zhì)干細胞ST2自然增殖過程中，miR-125b表達上調(diào)，且隨著表達量的增加，細胞的增殖作用逐漸減弱，由此推斷，miR-125b可能起到抑制ST2增殖的作用。Wang等［32］發(fā)現(xiàn)在hFOB1.19（人SV40轉(zhuǎn)染成骨細胞）成骨分化的過程中，miR-27表達水平上升，隨后將miRNA-27或其模擬物轉(zhuǎn)染hFOB1.19，實時定量PCR結(jié)果顯示ALP和骨鈣素mRNA表達水平顯著升高，提示 miR-27對成骨分化有正調(diào)控作用。同樣，在貝類珍珠層形成中，miRNA也參與了表達調(diào)控。鄭哲［33］等研究表明，miR-2305通過靶向調(diào)控馬氏珠母貝外套膜pif177和pearlin的表達而對珍珠質(zhì)的形成產(chǎn)生影響。

本研究中的Pm-miR-210是否參與貝類的礦化作用？許嘯等［20］研究表明，miR-210基因在成骨細胞分化過程中表達顯著性上調(diào)，且具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨的作用，分化形成的成骨細胞會分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)經(jīng)過礦化作用最終形成骨骼［34］。Mizuno等［35］用基因芯片分析BMP-4誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞ST2成骨分化過程中miRNA表達的差異性，發(fā)現(xiàn)miR-210表達顯著上調(diào)。另外，貝殼的形成受有機基質(zhì)控制比較復(fù)雜，由大約95%的文石碳酸鈣和5%的有機基質(zhì)交替疊加，層層復(fù)合而成，有機基質(zhì)的含量雖少，卻直接決定了整個貝殼的生物礦化過程［36］。鑒于miR-210參與了骨骼形成的相關(guān)靶基因的調(diào)控和有機基質(zhì)在生物礦化中的重要調(diào)控機制，因此，我們推測miR-210可能也是通過調(diào)控馬氏珠母貝外套膜分泌的有機基質(zhì)的靶基因，來影響其礦化作用的。本研究中預(yù)測的Pm-miR-210的候選靶基因為calmodulin、calcineurin A subunit、N19和shematrin-3。其中，calmodulin和calcineurin屬于鈣離子結(jié)合蛋白，通過調(diào)控鈣的攝取、轉(zhuǎn)運和吸收等新陳代謝過程，對貝殼的形成起到關(guān)鍵作用［37-38］；N19和shematrin-3屬于基質(zhì)蛋白，主要參與珍珠層和棱柱層形成。Shematrin家族在貝殼礦化過程中起到框架蛋白的作用，N19參與馬氏珠母貝的礦化結(jié)晶并負(fù)調(diào)控珍珠層礦化的形成過程［39-40］。此4種候選靶基因均在貝殼的生物礦化中發(fā)揮了有機基質(zhì)的調(diào)控作用，因此可以斷定Pm-miR-210參與了馬氏珠母貝貝殼形成的過程。

RNAhybrid是用來篩選靶位點基因快速有效的方法，但這種方法只是對miRNA靶基因的一個預(yù)測，要徹底研究miR-210對靶基因的調(diào)控機制，還需要進一步做基因的過表達實驗和基因功能驗證。對于篩選出來的miR-210的靶基因是如何參與馬氏珠母貝外套膜的礦化機制的，更需從激活靶蛋白的信號通路方面進行深入的研究。

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（責(zé)任編輯：陳莊）

The Structure and Function Prediction of miR-210 in the Mineralization Mechanism of Mantle in Pinctada martensii

PAN Xiao-yan，ZHENG Zhe，TIAN Rong-rong，JIAO Yu，DU Xiao-dong
（Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

To explore the structure and function of miR-210 and the regulation mechanism in Pinctada martensii，miR-RACE technology was used to verify and analyze the mature sequence of the Pm-miR-210.Bioinformatics analysis was performed to obtain the precursor of the sequence of Pm-miR-210 and predict target genes.The miR-RACE result was consistent with the result of high-throughput sequencing.We got the precursor sequence of Pm-miR-210 with 80 bp neck ring structure by the transcriptome data analysis and the mature sequence of the Pm-miR-210.Multiple sequence alignment revealed that the seeds of miR-210 mature sequence area among species are highly conservative.Pm-miR-210 is highly and similarly expressed in the mantle central and mantle edge（P ＞0.05）.Targeted forecast analysis indicated that calmodulin，calcineurin A subunit，N19 and Shematrin-3 are candidate target genes of Pm-miR-210.

Pinctada martensii；Pm-miR-210；Target prediction；mineralization

S917.4

A

1673-9159（2016）03-0009-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.002

2016-03-21

國家自然科學(xué)基金（31272635）；國家自然科學(xué)基金（41206141）；國家自然科學(xué)基金（31372526）

潘曉艷（1990—），女，碩士研究生，主要從事珍珠貝分子生物學(xué)研究。

焦鈺（1981—），女，博士，主要從海洋生物分子生物學(xué)研究。Tel.：0759-2383346，Email：jiaoyu1981@hotmail.com