潘留蘭　賈勝男　馬靜婷　太京華　金珍婧

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，長春130041)

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人DcR3表達載體的構(gòu)建及驗證①

潘留蘭賈勝男馬靜婷太京華金珍婧②

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，長春130041)

目的：構(gòu)建人DcR3表達載體并驗證其在體外細胞表達情況。方法：從人血液組織中擴增出DcR3中長度915 bp的CDS區(qū)，將其克隆到帶有紅色熒光的真核表達載體pEF1a-IRES-DsRed-Express2上，用FuGene HD轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到肝星狀細胞(LX-2)中，用RT-PCR以及Western blot檢測其mRNA表達量和蛋白表達量。結(jié)果：通過RT-PCR和Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)染DcR3表達載體質(zhì)粒的肝星狀細胞中DcR3的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著性提高。結(jié)論：成功構(gòu)建出人DcR3表達載體并在LX-2細胞中高效表達。

誘騙受體3；肝星狀細胞；真核表達；克隆

誘騙受體3(DcR3)也被稱為腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員6b(TNFRSF6B)/ TR6 / M68，DcR3是一個以配體身份出現(xiàn)于腫瘤壞死因子受體家族(TNFRSF)的新成員，其于 1998 年由 Robert.MPitti等發(fā)現(xiàn)并命名。DcR3 屬于分泌性蛋白，可作為免疫調(diào)節(jié)因子參與免疫調(diào)節(jié)的過程，DcR3 是一種具有免疫抑制作用的分子。DcR3的主要功能是競爭性地結(jié)合 FasL[1]、LIGHT[2]及 TL1A[3]，使由 FasL、LIGHT及 TL1A 誘導(dǎo)的各種功能受到抑制，進而產(chǎn)生阻斷上述配體所介導(dǎo)的細胞凋亡等作用。其在免疫調(diào)節(jié)功能方面發(fā)揮著重要的作用。肝纖維化是對慢性肝損傷的愈合反應(yīng)，是肝硬化的早期病變，是由各種慢性肝病引起的慢性肝損傷。Fas 與 FasL 的相互作用是細胞凋亡的重要途徑之一[4]。有研究表明Fas/FasL系統(tǒng)是酒精性肝病中誘導(dǎo)肝細胞凋亡的主導(dǎo)因素，可進一步促進酒精性肝炎/纖維化的發(fā)生與進展[5]。DcR3可以通過Fas/FasL途徑參與免疫調(diào)節(jié)[6]。因此本試驗?zāi)康氖菢?gòu)建人DcR3的表達載體，讓其在肝星狀細胞中高效表達，為進一步研究DcR3在肝炎以及肝纖維化的作用提供技術(shù)支持及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品在吉林大學(xué)第一醫(yī)院采取人血液組織樣本，LX-2細胞購于上海康朗生物科技有限公司。質(zhì)粒pEF1α-IRES-DsRed-Express2購于Clontech生物公司。DH5α感受態(tài)細胞購于TIANGEN生物公司。

1.1.2實驗試劑和耗材DEPC水、乙醇、異丙醇(購于TaKaRa公司)； FuGene HD (購于Promga公司)；Trizol、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(均購自Invitrogen生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自ToYoBo 生物公司)；限制性內(nèi)切酶(NheⅠ和EcoRⅠ)(購自NEB生物公司)；LA保真酶、T4連接酶、DNA凝膠回收試劑盒、PMD18-T Simple vector、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒(均購自TaKaRa生物公司)；質(zhì)粒小提試劑盒(購自TIANGEN生物公司)；BCA蛋白含量檢測試劑盒(購于凱基生物公司)；兔抗DcR3 (購于Santa Cruz公司)；兔抗β-actin多克隆抗體、山羊抗兔IgG(均購自Abcam生物公司)；實時熒光定量儀(購于Agilent生物公司)；酶標(biāo)儀(購于BioTek生物公司)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(購于Tanon儀器公司)。

1.2方法

1.2.1人血液組織總RNA提取及cDNA合成采取人血液用Trizol法提取組織的總RNA,按照ToYoBo 生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而獲取cDNA。

1.2.2引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI中人的DcR3基因序列(GenBank Number: NM_003823.3)，利用Primer5引物設(shè)計軟件設(shè)計可以特異性擴增人的DcR3 cDNA全長的引物序列，同時分別在上游引物和下游引物的5′端加上限制性內(nèi)切酶SalⅠ和BamHⅠ的酶切位點，引物由吉林省庫美生物有限公司合成。上游引物：5′-GTCGACATGAGGGCGCTG-GAGG-3′，下游引物：5′-GGATCCTCAGTGCACAGGGAGGAA-3′。

1.2.3人DcR3基因TA克隆與測序分析以人的DcR3的cDNA為模板，使用合成的上下游引物進行PCR擴增，擴增使用50 μl反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，LA Taq 0.5 μl，2×GC BufferⅠ 25 μl，dNTP Mixture 8 μl，ddH2O 14.5 μl。反應(yīng)程序：94℃ 1 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min；16℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA凝膠回收試劑盒純化回收特異性的目的片段。將回收純化的DcR3基因片段連接到pMD18-T Simple vector上，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，涂板培養(yǎng)后挑取陽性單克隆菌落，進行菌液PCR，質(zhì)粒小提試劑盒提取TA克隆質(zhì)粒，并由上海生物工程公司測序檢測。

1.2.4pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3真核表達載體的構(gòu)建對質(zhì)粒pEF1α-IRES-DsRed-Express2 Vector和TA克隆質(zhì)粒分別進行SalⅠ和BamHⅠ雙酶切。將酶切產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳實驗，然后切膠回收pEF1α-IRES-DsRed-Express2 Vector約6 kb的片段和TA克隆質(zhì)粒約915 bp的片段，將兩個回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)后挑取陽性單克隆菌落，搖菌擴增后進行菌液PCR及質(zhì)粒測序鑒定。

1.2.5pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3真核表達載體及空表達載體轉(zhuǎn)染LX-2細胞轉(zhuǎn)染前24 h將LX-2細胞接種到6孔板中，等細胞達到80%～90%融合時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時用不含血清和抗生素的培養(yǎng)基，用150 μl上述培養(yǎng)基混合4 μg的質(zhì)粒和7.5 μl的FuGene HD，混勻室溫孵育15 min。同時，將傳代的六孔板中的培養(yǎng)基吸出，用不含血清和抗生素的培養(yǎng)基清洗兩遍后，加入1.5 ml的無血清和無抗生素的培養(yǎng)基。最后沿孔周圍將DNA-FuGene HD 混合物輕輕加入到六孔板中，24 h后換液除去死細胞，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 Real-time QPCR檢測DcR3基因的mRNA表達水平收集轉(zhuǎn)染 pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3真核表達載體及空表達載體的細胞，用Trizol破碎收集細胞，提取細胞總RNA，通過分光光度計和凝膠電泳檢測提取的總RNA的質(zhì)量后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計豬的IFI30基因和內(nèi)參基因β-actin的定量引物。具體引物序列為：DcR3-F:CGCTGGTTTCTGCTTGGAG，DcR3-R:AGCTGCTGGCTGAGAAGGTG；β-actin-F:CGGGCA-GCAGCTCGTAGCTCTTC，β-actin-R:CGGCTACA-GCTTCACCACCA。以提取的cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒進行Real-Time QPCR檢測。

1.2.7Western blot檢測DcR3基因蛋白的表達收集轉(zhuǎn)染pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3真核表達載體質(zhì)粒和pEF1α-IRES-DsRed-Express2空載體質(zhì)粒的LX-2細胞，提取細胞總蛋白。利用BCA檢測法通過酶標(biāo)儀檢測蛋白濃度，按10 μg/孔蛋白質(zhì)上樣量進行SDS-PAGE電泳。使用150 mA恒流轉(zhuǎn)90 min將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。 用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按1∶1 000濃度加入一抗兔抗DcR3抗體和1∶2 000濃度加入兔抗β-actin的一抗，置于搖床上4℃孵育過夜。TBST清洗3次后，用1∶2 000濃度山羊抗兔IgG二抗孵育1 h。再用TBST清洗3次后，加Thermo生物公司的ECL發(fā)光試劑孵育，用全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀拍照檢測。使用軟件進行灰度分析，檢測DcR3基因蛋白表達量。

2　結(jié)果

2.1總RNA 的提取及RT-PCR擴增提取的人血液組織的總RNA經(jīng)分光光度計檢測分析，提取的RNA 的OD260/OD280為2.00，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，RNA未降解，純度良好(圖1)。提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板經(jīng)PCR擴增得到一條約915 bp的DNA片段，與預(yù)期長度相符(圖2)。

2.2人DcR3基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定回收純化2.1中的PCR產(chǎn)物與pMD18-T Simple vector連接，挑陽性單克隆搖菌經(jīng)菌液PCR擴增，提取質(zhì)粒雙酶切后得到長度為915 bp的DNA片段。將此片段與pEF1α-IRES-DsRed-Express2 Vector進行連接，陽性單克隆搖菌經(jīng)菌液PCR擴增后，得到915 bp的DNA片段。將小量提取的質(zhì)粒用SalⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，雙酶切得到915 bp和6 022 bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。測序結(jié)果表明，目的片段與NCBI上公布的序列一致 (圖4)，證明真核表達載體pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3構(gòu)建成功。

圖1　人血液總RNA提取產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from human blood

圖2　人DcR3基因cDNA擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2　Agarose gel electrophoresis of cDNA amplified product of human DcR3 gene

2.3人DcR3基因真核表達載體轉(zhuǎn)染LX-2細胞將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染LX-2細胞24 h后，觀察熒光發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEF1α-IRES-DsRed-Express2空載體和真核表達載體pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3細胞呈現(xiàn)熒光，其中陽性細胞可達60%，而未轉(zhuǎn)染的細胞不能觀察到任何熒光(圖5)。

2.4人DcR3基因Real-Time QPCR檢測采用Real-Time QPCR的實驗方法檢測LX-2細胞中的DcR3基因mRNA相對表達量。結(jié)果如圖6所示。與轉(zhuǎn)染pEF1α-IRES-DsRed-Express2 Vector空載體及空白對照組相比，轉(zhuǎn)染真核表達載體的實驗組細胞中的DcR3基因的mRNA表達量顯著上升(P<0.05)。

圖3　重組質(zhì)粒pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3的酶切鑒定結(jié)果Fig.3　Results of enzyme digestion of recombinant plasmid pEF1-IRES-DsRed-Express2-DcR3Note: M.DNA Mark DL 15 000;1.Double-enzyme digestion of pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3.

圖4　重組質(zhì)粒pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3的測序比對鑒定結(jié)果Fig.4　Sequencing comparison of recombinant plasmid pEF1-IRES-DsRed-Express2-DcR3

圖5　pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3載體及空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察LX-2細胞的結(jié)果Fig.5　Results about LX-2 cells were observed by transfection with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3 vector and empty vector under fluoresc-ence microscopeNote: A.The LX-2 cells of expression fluorescent after transfection with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3 plasmid;B.LX-2 cells transfected with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3 plasmid were observed under ordinary light microscope;C.The LX-2 cells of expression fluorescent after transfection with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-Vector plasmid;D.LX-2 cells transfected with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-Vector plasmid were observed under ordinary light microscope.

圖6　表達產(chǎn)物的Real-Time QPCR檢測分析結(jié)果Fig.6　Expression of Real-time QPCR product detection result

2.5Western blot檢測結(jié)果提取細胞總蛋白進行Western blot檢測，結(jié)果表明表達產(chǎn)物能與DcR3抗體結(jié)合并在NC膜上產(chǎn)生特異性反應(yīng)條帶，表達組的條帶明顯強于對照組 (如圖7)，灰度分析結(jié)果也表明，DcR3基因的蛋白表達量在真核表達載體實驗組中顯著高于對照組(P<0.01)。

圖7　表達產(chǎn)物的Western blot 檢測結(jié)果Fig.7　Western blot detection results of expression productNote: A:1.Protein expression of DcR3 gene in non-transfected cells as control;2.Protein expression of DcR3 gene after transfection with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-Vector plasmid;3.Protein express-ion of DcR3 gene after transfection with pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3 plasmid.

3　討論

DcR3是一種缺乏跨膜結(jié)構(gòu)的可溶性受體，能夠與Fas、HVEM、DR3競爭結(jié)合其相應(yīng)配體FasL、LIGHT及TL1A，調(diào)節(jié)其生物效應(yīng)但并不介導(dǎo)細胞凋亡。最早的研究表明DcR3基因在原發(fā)肺部腫瘤和結(jié)腸腫瘤組織中有擴增表達[1,7]。大多數(shù)研究表明DcR3介導(dǎo)的免疫抑制主要集中在它與FasL的相互作用，DcR3的生物學(xué)功能尤其體現(xiàn)在腫瘤疾病中。DcR3在腫瘤細胞的高表達可以通過抑制Fas/FasL誘導(dǎo)的凋亡而使細胞逃避細胞毒性攻擊作用[8]。Roth等[9]發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細胞表達可溶性DcR3，抑制FasL誘導(dǎo)的凋亡。此外Connolly等[10]發(fā)現(xiàn)給小鼠注射重組DcR3可以減輕FasL介導(dǎo)的爆發(fā)性肝細胞凋亡和阻斷FasL誘導(dǎo)的細胞死亡。許多研究也證明DcR3可以通過阻斷LIGHT-HVEM相互作用而抑制同種抗原的T細胞反應(yīng)[11]。其可以阻斷LIGHT和TL1A誘導(dǎo)的胰島細胞和癌細胞的凋亡[2,12]。除了中和TL1A、LIGHT和FasL的作用，DcR3還可以作為效應(yīng)分子直接調(diào)節(jié)許多細胞類型的活動。

本實驗中，我們從人血液組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以其為模板，克隆了人DcR3基因的基因序列，成功構(gòu)建了帶有紅色熒光的真核表達載體pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3，并通過Real-Time QPCR和Western blot驗證人DcR3基因mRNA和蛋白的表達量變化。Real-Time QPCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了人DcR3真核表達載體的LX-2細胞中人DcR3的mRNA水平顯著高于正常的LX-2細胞(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染了人DcR3表達載體后的細胞DcR3的蛋白表達量明顯高于正常LX-2細胞中DcR3的表達。實驗證明我們所構(gòu)建的pEF1α-IRES-DsRed-Express2-DcR3真核表達載體可以在LX-2細胞中高效表達。這為進一步研究DcR3的表達對減輕肝炎癥狀、延緩肝纖維化進程是否有直接影響和作用奠定了基礎(chǔ)。具體DcR3對肝纖維化的作用機制有待我們繼續(xù)探討研究。

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[收稿2016-02-26修回2016-03-17]

(編輯倪鵬)

Over-expression vector construction of human DcR3 gene and its validation

PAN Liu-Lan,JIA Sheng-Nan,MA Jing-Ting,TAI Jing-Hua,JIN Zhen-Jing.

Department of Internal Medicine,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China

Objective:To construct the human DcR3 expression vector and verify its expression in vitro.Methods: 915 bp human DcR3 gene CDS was amplified from porcine lung tissues,and was cloned into eukaryotic expression vector pEF1a-IRES-DsRed-Express2 which show red fluorescence.And then pEF1a-IRES-DsRed-Express2-DcR3 was transfected into LX-2 cells by FuGene HD.Expression of mRNA and protein lever of Human DcR3 were detected by RT-PCR and Western blot.Results: The levels of DcR3 gene transcription and translation in the hepatic stellate cells were significantly increased after transfection with pEF1a-IRES-DsRed-Express2-DcR3 by RT-PCR and Western blot analysis.Conclusion: DcR3 expression vector was successfully constructed and highly expressed in LX-2 cells.

DcR3 ;LX-2;Eukaryotic expression;Clone

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.018

，E-mail: jinyu0429@sina.com。

潘留蘭(1959年-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事慢性肝病的診斷、治療與預(yù)防方面的研究， E-mail: woshipanliulan@126.com。

R392

A

1000-484X(2016)10-1491-05

①本文為吉林省科學(xué)技術(shù)委員會面上基金課題(201115083)。