岳會敏　劉　飛　李范林　馬菲雅　沈蘇南　侯亞義

(南京大學醫(yī)學院和生物醫(yī)藥技術(shù)國家重點實驗室，南京210093)

?

冬蟲夏草菌絲體提取物通過抑制炎性因子及Treg細胞功能緩解肺纖維化

岳會敏劉飛李范林馬菲雅沈蘇南侯亞義

(南京大學醫(yī)學院和生物醫(yī)藥技術(shù)國家重點實驗室，南京210093)

目的：觀察冬蟲夏草菌絲體(Hirsutella sinensis mycelium，HSM)提取物對盲腸穿孔結(jié)扎(CLP)小鼠的炎癥反應(yīng)和肺纖維化程度的影響。方法：建立CLP誘導(dǎo)膿毒癥5 d和10 d小鼠模型，分別分為假術(shù)組(sham,n=5)、模型組(CLP,n=11)、治療組(HSM,n=11)。冬蟲夏草菌絲體組在術(shù)前2 h和術(shù)后給予HSM提取物200 mg/(kg·d)(低于人體用量0.27 g/kg),假術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。利用Q-PCR檢測了肺組織中炎性因子TNF-α和IL-1β及纖維化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9的表達；利用流式細胞術(shù)分析了小鼠外周血和脾臟中Th1細胞以及脾臟組織中Treg細胞的數(shù)量；另外，還對肺組織切片進行了HE染色以及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和纖連蛋白(fibronection)免疫組化染色。結(jié)果：模型組外周血和脾臟中Th1細胞以及脾臟組織中Treg細胞的數(shù)量較假術(shù)組顯著降低,而HSM提取物治療能上調(diào)上述細胞的數(shù)量。5 d時，模型組肺組織中IL-1β及纖維化因子TGF-β1、MMP9和TIMP1表達顯著上調(diào)，到第10天時有所降低但仍高于sham組，而治療組上述因子表達明顯降低；各組肺組織TNF-α表達無顯著差異；HE染色顯示模型組肺部炎性樣變明顯，到第10天時炎性樣變比5 d時減輕，而治療組均有改善；免疫組化顯示與假術(shù)組比，模型組肺內(nèi)間質(zhì)α-SMA和fibronection表達明顯增多，而治療組肺內(nèi)間質(zhì)表達低于模型組。結(jié)論：HSM提取物具有抑制炎癥、平衡免疫及緩解肺纖維化的功能。

冬蟲夏草菌絲體；炎癥反應(yīng)；肺纖維化

肺纖維化是一種慢性的、不可逆的肺部間質(zhì)性疾病，可造成肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，進而導(dǎo)致病人呼吸困難，最終因呼吸衰竭而死亡[1]。此類疾病病因尚不明確，但被普遍認為與暴露于職業(yè)危害、環(huán)境因素及基因易感性相關(guān)[2]。肺纖維化預(yù)后較差，通常在患病早期啟動炎癥反應(yīng)，以上皮細胞轉(zhuǎn)分化、成纖維細胞大量增殖、纖維化病灶的形成以及肺結(jié)構(gòu)破壞為特征[3]。上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)標志vimentin表達伴隨著E-cadherin的表達消失都是肺纖維化的標志[4]。肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展與TGF-β1活化密切，TGF-β1誘導(dǎo)過多的膠原和ECM產(chǎn)生積聚以及基底膜MMP/TIMP失衡。由于其病理機制復(fù)雜，目前為止現(xiàn)代醫(yī)學仍缺乏良好的臨床治療手段[5]。

冬蟲夏草菌絲體是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，它是由冬蟲夏草菌寄生于蝙蝠蛾幼蟲而形成的幼蟲尸體和干燥子座的復(fù)合體。冬蟲夏草現(xiàn)在常被用來治療呼吸系統(tǒng)疾病，也有報道稱其可作為抗氧化劑和血管生成抑制劑。近年來有研究表明冬蟲夏草菌絲體可通過抑制TGF-β1表達及促進膠原降解緩解肝腎肺纖維化等功能[6-9]。Keshar等[10]證實，膿毒癥誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)可能誘發(fā)持續(xù)的纖維化病變，本實驗構(gòu)建了CLP誘導(dǎo)膿毒癥模型，主要目的是明確冬蟲夏草菌絲體緩解肺纖維化的作用，探討其作用的潛在機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物4～6周齡的C57BL/6小鼠，雄性,體重18～20 g,購自南京大學模式動物所，飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，保證飲食和飲水，晝夜循環(huán)，使用前飼養(yǎng)不少于1周。

1.1.2藥物與試劑冬蟲夏草菌絲體提取物由南京中科藥業(yè)有限公司提供(批號：20140778)；免疫組化所用fibronectin抗體購自SANTA CRUZ公司，1∶50稀釋 ；α-SMA抗體是abcam公司產(chǎn)品，1∶200稀釋；DAB顯示試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(產(chǎn)品編號：AR1022)；SABC-AP免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(產(chǎn)品編號：SA1050)；實驗用流式抗體均為eBioscience產(chǎn)品。

1.1.3實驗動物處理兩種模型各27只小鼠在SPF級動物房飼養(yǎng)1周后，隨機分組，實驗分組如下：(1)sham組：小鼠腹腔注射100 μl/10 g生理鹽水，2 h后用4%水合氯醛(200 μl/每只)麻醉小鼠打開腹腔暴露盲腸，不結(jié)扎不穿刺，然后將盲腸放入腹腔，逐層關(guān)閉腹腔，縫好傷口；每組5只小鼠；(2)實驗組：①CLP組：小鼠腹腔注射100 μl/10 g生理鹽水，2 h后用4%水合氯醛(200 μl/每只)麻醉小鼠打開腹腔抽出盲腸結(jié)扎穿刺，之后將盲腸放入腹腔逐層關(guān)閉腹腔，縫好傷口；每組11只小鼠；②治療組：冬蟲夏草菌絲體液(200 mg/kg)預(yù)處理2 h，隨后進行CLP手術(shù)，術(shù)后每天菌絲體液(200 mg/kg)灌胃，每組11只小鼠，術(shù)后5 d或10 d處死小鼠。

1.2方法

1.2.1流式細胞術(shù)將收集的細胞用PBS洗3遍，然后用PBS重懸并轉(zhuǎn)移至標準BD流式管中，按抗體說明書加入相應(yīng)用量的流式抗體，4℃避光孵育30 min， PBS洗2遍，重懸細胞后使用流式細胞儀檢測。標記胞內(nèi)因子的，PBS洗兩遍后，加500 μl 4%的PFA室溫固定20 min，離心去上清；加500 μl 含0.1%saponin的PBS，破膜15 min，離心去上清；按抗體說明書加入相應(yīng)用量的流式抗體，4℃避光孵育30 min，然后用含0.1% saponin的PBS洗2遍，重懸細胞后上流式細胞儀檢測。

1.2.2Q-PCR將肺組織勻漿后，加入Trizol，提總RNA，核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度和濃度后，取1 g RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系(20 μl)：4 μl 5×RT buffer，2 μl dNTP，0.5 μl RNase inhibitor，0.5 μl Oligo dT，0.5 μl ReverTra Ace，1 μg RNA，加DEPC水至20 μl；采用三步法進行Q-PCR反應(yīng)，反應(yīng)在Applied BioSystems 7300 Sequence Detection System中進行，得到各個基因的Ct值，然后以GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt進行計算確定目的基因的表達。其中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP9和TIMP1引物均按primer bank查詢設(shè)計合成，GAPDH引物根據(jù)文獻合成。

1.2.3組織學觀察肺組織取出后用4%多聚甲醛固定，常規(guī)HE染色，切片在光學顯微鏡10×20視野下觀察肺組織形態(tài)變化。

1.2.4免疫組化染色石蠟切片脫蠟、水化后，熱修復(fù)；冷卻后，3%H2O2阻斷過氧化氫酶；PBS洗3遍，然后按抗體說明書滴加適當濃度的一抗，4℃孵育過夜；按說明書滴加適量二抗，37℃孵育45 min后，用PBST洗3遍，加底物SABC 37℃孵育20 min；隨后用PBST洗4遍，DAB(武漢博士德生物公司)顯色；復(fù)染透明后封片；在光學顯微鏡10×20視野下觀察。

2　結(jié)果

2.1冬蟲夏草菌絲體對肺組織炎性反應(yīng)的影響Q-PCR結(jié)果顯示，與sham組相比，5 d CLP組小鼠肺組織重要的炎性因子IL-1β的mRNA的表達升高(P<0.05)，而HSM治療組IL-1β的mRNA表達相比CLP組明顯降低(P<0.05)；此外，TNF-α也有與IL-1β相似的變化趨勢，但改變不明顯，見圖1A。10 d CLP組小鼠肺組織重要的炎性因子IL-1β的mRNA的相比5 d 模型組有所降低但仍高于sham組，而給予HSM治療后降低(P<0.05)；此外，TNF-α也有與IL-1β相似的變化趨勢，但改變不明顯，見圖1B。

肺組織HE染色顯示，模型組小鼠的肺組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤、系膜基質(zhì)增生,血管充血等變化；給予HSM提取物治療后，上述癥狀減輕。見圖1C。以上結(jié)果說明肺組織炎性樣變隨病程進展而減輕，而冬蟲夏草菌絲體改善了小鼠肺組織炎性病變。

2.2冬蟲夏草菌絲體對小鼠免疫細胞的影響本實驗利用流式細胞術(shù)研究了HSM提取物對小鼠脾臟中Treg 細胞以及PBMC和脾臟中Th1細胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示：與sham組相比，5 d CLP組小鼠脾臟中Treg細胞數(shù)量均顯著增多(P<0.05)，而與CLP組相比，給予HSM提取物治療后，小鼠脾臟中Treg細胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)，見圖2A；10 d組各組間變化趨勢與5 d組相似，見圖2B；與sham組相比，5 d CLP組小鼠脾臟中Th1細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，而與CLP組相比，給予HSM提取物治療后，小鼠脾臟中Th1細胞數(shù)量有顯著增加(P<0.05)，見圖3A；10 d組各組小鼠脾臟中Th1細胞數(shù)量變化趨勢與5 d組相似，見圖3B ；與sham組相比，5 d和10 d CLP組中小鼠PBMC中Th1細胞數(shù)量均有下降趨勢，而給予HSM提取物治療后Th1細胞數(shù)量有增多的趨勢，見圖3A和圖3B。

2.3冬蟲夏草菌絲體對肺組織纖維化分子表達的影響Q-PCR結(jié)果顯示，5 d CLP組小鼠肺組織TGF-β1、金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP9)和金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP1)的mRNA表達均顯著上調(diào)；而HSM治療組小鼠肺組織TGF-β1和MMP9的表達與CLP組相比均有顯著下降(P<0.05)，TIMP1有下降趨勢；見圖4A；10 d CLP組小鼠肺組織TGF-β1的mRNA表達有上調(diào)趨勢， MMP9和TIMP1的mRNA表達相比第5天時有所降低但仍顯著高于sham組，而與CLP組相比，給予HSM提取物治療后，TGF-β1和MMP9的表達均明顯下調(diào)，見圖4B；提示CLP組小鼠肺部可能出現(xiàn)纖維化病變且纖維化病變在發(fā)病后期有減輕的趨勢，經(jīng)HSM提取物治療后小鼠肺部ECM的合成和降解失衡得到控制、肺纖維化病變可能得到改善。

圖1　HSM改善小鼠肺部炎性反應(yīng)(n=3)Fig.1　HSM can improve inflammation in mice′s renal sections(n=3)Note: HE staining was performed on renal sections.Original magnification,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2　HSM對小鼠脾臟Treg細胞數(shù)量的影響(n=3)Fig.2　HSM influences amounts of mice′s Treg in spleen(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.001.

圖3　HSM對小鼠外周血和脾臟中Th1細胞數(shù)量的影響(n=3)Fig.3　HSM influences amounts of mice′s Th1 cells in PBMC and spleen(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖4　HSM改善小鼠肺纖維化情況(n=3)Fig.4　HSM can improve mice′s pulmonary fibrosis(n=3)Note: Immunohistochemical staining was performed on lung sections.Original magnification×20.*.P<0.05，**.P<0.01,***.P<0.001.

2.4冬蟲夏草菌絲體對肺組織α-SMA和fibrone-ctin蛋白表達影響α-SMA和fibronectin在sham組小鼠肺組織內(nèi)表達很弱；經(jīng)過CLP手術(shù)后表達增強，其主要表達于肺上皮細胞和肺內(nèi)間質(zhì)中；而給予HSM提取物治療后，兩種蛋白的表達明顯減少見圖4C和圖4D。它們在不同時間點的表達也有不同。

3　討論

在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中，肺組織受到損傷，由于炎癥區(qū)域會出現(xiàn)明顯的巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的浸潤，這些浸潤的炎癥細胞可以產(chǎn)生IL-1、TNF-α和MCP-1等細胞因子，進而形成復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控間質(zhì)成纖維細胞和肺泡上皮細胞的增殖和凋亡，導(dǎo)致ECM活化增殖，最終促進肺纖維化的發(fā)生。Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ可以抑制TGF-β表達，抑制膠原產(chǎn)生而減輕肺纖維化損傷，本實驗中CLP組脾臟中Th1細胞數(shù)量較sham組減少，給予HSM治療后有明顯上調(diào)。此外，肺組織炎性因子TNF-α和IL-1β的mRNA水平表達量以及肺HE染色結(jié)果顯示，進行CLP處理第5天時炎癥因子表達升高較為顯著且肺組織損傷較明顯，而到第10天時炎癥因子有所改善；給予冬蟲夏草菌絲體治療能夠顯著改善小鼠肺間質(zhì)炎性細胞浸潤情況和降低肺組織炎性因子的表達。證實在CLP誘導(dǎo)膿毒癥早期肺組織以炎癥改變?yōu)橹?，隨病程向晚期發(fā)展，炎性改變減弱；冬蟲夏草菌絲體具有抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫的功能。

為了進一步探討HSM發(fā)揮作用的機制，我們分析了脾臟中Treg細胞比例以及外周血和脾臟中Th細胞比例，發(fā)現(xiàn)HSM能夠顯著降低CLP引起的脾臟中Treg細胞比例增多，對Th細胞也有部分影響。

纖維母細胞異常轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，進而產(chǎn)生大量ECM并分泌因子影響相鄰細胞的功能[11]。金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs) 是分解胞外基質(zhì)的主要酶類，而金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)可以特異性的抑制其對ECM的分解作用，兩者對維持ECM合成和降解的平衡至關(guān)重要。除了纖維化細胞過表達MMP/TIMPs，上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)也是肺纖維化的顯著特征；在EMT過程中，細胞失去胞間接合蛋白E-cadherin并表達α-SMA和vimentin等間質(zhì)標志。本實驗中肺組織纖維化相關(guān)因子TGF-β1 、MMP9和TIMP1的mRNA水平表達量在進行CLP處理第5天時升高較為顯著，到第10天時有所下降但仍高于sham組，而給予HSM治療后均有相應(yīng)改善。免疫組化結(jié)果也表明α-SMA和fibronectin在進行CLP處理第5天時升高較為顯著，到第10天時有所下降但仍高于sham組，給予HSM提取物治療后小鼠肺部α-SMA和fibronectin 表達均下降，說明冬蟲夏草菌絲體具有抗肺纖維化的功能。

本研究結(jié)果證實冬蟲夏草菌絲體具有抑制炎癥及平衡免疫緩解肺纖維化的功能，且這種作用可能是通過抑制炎性因子及Treg細胞功能達到的；對此進行進一步研究將有利于闡明其抗纖維化的作用機制，為尋找抗肺纖維化藥物提供新視角。

[1]Chen M,Cheung FW,Chan MH，etal.Protective roles of Cordyceps on lung fibrosis in cellular and rat models[J].J Ethnopharmacology,2012,143(2):448-454.

[2]Antoniou KM,Pataka A,Bouros D，etal.Pathogenetic pathways and novel pharmacotherapeutic targets in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Pulm Pharmacol Ther,2007,20(5):453-461.

[3]Verma S,Slutsky AS.Idiopathic pulmonary fibrosis-new insights[J].N En J Me,2007,356(13),1370-1372.

[4]Willis BC,du Bois RM,Borok Z .Epithelial origin of myofibroblasts during fibrosis in the lung[J].Proc Am Thorac Soc,2006,3(4):377-382.

[5]Coward WR,Saini G,Jenkins G.The pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Ther Adv Respir Dis,2010,4(6):367-388.

[6]Das SK,Masuda M,Sakurai A，etal.Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris:current state and prospects[J].Fitoterapia,2010,81(8):961-968.

[7]Chai JJ,Chen YP,Rui HL.Effects of Hirsutella sinensis on TGF-beta1 and Snail expressions and transdifferentiation of tubular epithelial-myofibroblast in renal tissue of rats with chronic aristolochic acid nephropathy[J].Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Za Zhi,2009,29(4):325-329.

[8]Xu H,Li S,Lin Y，etal.Effectiveness of cultured Cordyceps sinensis combined with glucocorticosteroid on pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2011,36(16):2265-2270.

[9]Li SP,Yang FQ,Tsim KW.Quality control of Cordyceps sinensis,a valued traditional Chinese medicine[J].J Pharmaceutical Biomedical Analysis,2006,41(5):1571-1584.

[10]Keshari RS,,Silasi-Mansat R,Zhu H，etal.Acute lung injury and fibrosis in a baboon model of Escherichia coli sepsis[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,50(2):439-450.

[11]Nakasaki M,Hwanq Y,Xie Y，etal.The matrix protein Fibulin-5 is at the interface of tissue stiffness and inflammation in fibrosis[J].Nat Commun,2015,6:8754.

[收稿2016-03-02修回2016-04-25]

(編輯張曉舟)

Hirsutella sinensis mycelium (HSM) extract relieves pulmonary fibrosis though suppress inflammation and function of Treg cells

YUE Hui-Min ,LIU Fei ,LI Fan-Lin,MA Fei-Ya,SHEN Su-Nan,HOU Ya-Yi.

Medical School & State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology,Nanjing University,Nanjing 210093,China

Objective:To investigate the effect of HSM on the inflammation and pulmonary fibrosis in mice with cecal ligation and puncture (CLP) .Methods: Both 5 day and 10 day timepoint pulmonary fibrosis were induced by CLP;mice were randomly divided into three groups,including sham group (sham,n=5),model group (CLP,n=11),therapy group (HSM,n=11).HSM extract (200 mg/kg，less than human dose of 0.27 g/kg) was orally administered to HSM group 2 hour before surgery and repeated everyday,while sham group and model group were given the same dose of normal saline.We used Q-PCR assay to analyze the expression of inflammatory molecules (IL-1β and TNF-α) and fibrogenic cytokines (TGF-β,MMP9 and TIMP1) from lung tissues ,we used FACS assay to analyze the amount of Th1 cells in PBMC and spleen sections,as well as Treg in spleen sections.Besides,lung sections were subjected to HE stain and immunohistochemical staining with α-SMA and fibronectin.Results: The amount of model group′s Th1 cells in PBMC and spleen sections,as well as Treg in spleen sections were significantly lower than sham group′s,whereas HSM succeeded in raising them.By day 5, the expression of inflammatory molecules IL-1β and fibrogenic cytokines (TGF-β,MMP9 and TIMP1) from CLP group′s lung sections were remarkably improved,by day 10,the expression had decreased but was higher than sham group′s ;HSM inhibited these cytokines′ expression.The expression of TNF-α of CLP group and HSM group had no significant changes.The CLP group′s HE results showed obvious pulmonary inflammatory damage,by day 10,the situation had improved,whereas HSM reduced the histopathologic alterations;contrast to sham group,model group′s expression of α-SMA and fibronectin was remarkably improved,while HSM group showed lower expression.Conclusion: HSM extract can suppress inflammation,balances immune system and relieves pulmonary fibrosis.

Hirsutella sinensis;Inflammation;Pulmonary fibrosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.014

岳會敏(1991年-)，女，碩士,主要從事細胞與分子免疫研究，E-mail: yuehuimin914@126.com。

及指導(dǎo)教師：侯亞義(1960年-),男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細胞與分子免疫方面的研究,E-mail: yayihou@nju.edu.cn。

R392

A

1000-484X(2016)10-1472-05