于秀艷　李　鋌　吳雪峰　劉曉峰

(吉林省腫瘤醫(yī)院，長(zhǎng)春130012)

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異土木香內(nèi)酯通過(guò)介導(dǎo)ROS產(chǎn)生及線粒體損傷誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡①

于秀艷李鋌吳雪峰劉曉峰

(吉林省腫瘤醫(yī)院，長(zhǎng)春130012)

目的：探討異土木香內(nèi)酯通過(guò)介導(dǎo)ROS產(chǎn)生及線粒體損傷誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡機(jī)制。方法：不同終濃度異土木香內(nèi)酯體外誘導(dǎo)Hela細(xì)胞24 h及加入抑制劑NAC作為實(shí)驗(yàn)組，以正常細(xì)胞作為對(duì)照組，MTT測(cè)定細(xì)胞活性；Hoechst 33258染色觀察Hela細(xì)胞凋亡細(xì)胞核變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期和ROS產(chǎn)生變化和MMP水平；Western blot方法測(cè)定細(xì)胞色素C蛋白、Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：異土木香內(nèi)酯以濃度依賴性抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)；20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，細(xì)胞核出現(xiàn)典型的核固縮及核碎裂凋亡形態(tài)，細(xì)胞凋亡率增加，可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)于S期，細(xì)胞內(nèi)均可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。ROS抑制劑NAC可以明顯阻斷異土木香內(nèi)酯對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，降低細(xì)胞凋亡率；20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)Caspase-3蛋白也被活化，出現(xiàn)cleaved Caspase蛋白，線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白釋放增加。結(jié)論：異土木香內(nèi)酯在體外可通過(guò)介導(dǎo)ROS產(chǎn)生及線粒體損傷來(lái)抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)且誘導(dǎo)其凋亡，且伴隨Bax蛋白表達(dá)上調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)及Caspase-3活化相關(guān)變化。

異土木香內(nèi)酯；ROS；線粒體損傷；Hela細(xì)胞

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的健康及生活質(zhì)量，其在我國(guó)乃至全球惡性腫瘤發(fā)病率屈居第二，全球每年死于宮頸癌的女性高達(dá)25萬(wàn)之多，死亡率排第四位[1]。其高發(fā)病率和死亡率與女性對(duì)宮頸癌的認(rèn)知水平和預(yù)防息息相關(guān)[2]。而隨著越來(lái)越多中草藥植物的發(fā)現(xiàn)及其天然提取物藥理作用的研究，特別是在抗腫瘤方面[3,4]，天然提取物的研發(fā)已經(jīng)備受關(guān)注。

異土木香內(nèi)酯(Isoalantolactone)是從系菊科旋覆花屬植物土木香(Inula helenium L)中分離出來(lái)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、驅(qū)蟲(chóng)、降血糖和鎮(zhèn)痛等多種活性[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是異土木香內(nèi)酯自身[6,7]還是其修飾后的產(chǎn)物[8]，都可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有一定的抗腫瘤活性。我們也報(bào)道過(guò)其抗腫瘤活性[9]。國(guó)內(nèi)外[6,10]有研究發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯可以顯著抑制體外Hela細(xì)胞增殖，并推測(cè)11，13-去氫內(nèi)酯基團(tuán)與其抗腫瘤活性有關(guān)系，而異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡細(xì)胞內(nèi)ROS變化和線粒體損傷機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡細(xì)胞內(nèi)ROS變化和線粒體損傷機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要試劑RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；異土木香內(nèi)酯(色譜純度>99%)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司；MTT、DMSO購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33258染料、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、兔抗cytochrome C多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體和兔抗多克隆Caspase-3均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；羅丹明123熒光染料購(gòu)于Sigma公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG美國(guó)Proteintech公司；其他儀器及化學(xué)分析純由吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.1Hela細(xì)胞培養(yǎng)及活性測(cè)定Hela細(xì)胞由吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存，用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入雙抗100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素，1 g/L 葡萄糖和L-谷氨酸，10% 的胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2細(xì)胞孵箱中。每3～4 d胰蛋白酶消化傳代1 次，按1∶6比例傳代。

根據(jù)1983年Mosmann[11]報(bào)道的MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第二天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，MTT粉末溶解于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，滴加入培養(yǎng)有細(xì)胞的96孔板中(終質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml)，37℃孵育1 h，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200 μl DMSO溶解細(xì)胞中還原的甲臜藍(lán)顆粒，酶標(biāo)儀(Thermo scientific)測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm處的吸光度值，參考波長(zhǎng)為690 nm，計(jì)算細(xì)胞活性。IC50數(shù)值使用軟件GraphPad Prism 5測(cè)定。

1.2.2Hoechst 33258核染實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第二天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌后加入終濃度為50 μg/ml的Hoechst 33258 37℃避光孵育20 min，PBS洗滌后用熒光顯微鏡(Olympus 1×71)觀察。

1.2.3細(xì)胞凋亡率測(cè)定取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第二天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯和終濃度為3 mmol/L抑制劑NAC，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2～3次，最后使用含有5 μl Annexin V的PBS 200 μl重懸細(xì)胞，室溫避光孵育10 min后，離心，棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Beckman Coulter,Epics XL)。

1.2.4細(xì)胞凋亡周期的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第二天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌。用70%乙醇4 ℃過(guò)夜固定。第二天PBS洗滌2遍，加入含有50 μg/ml PI和100 μg/ml RNase A的染色液200 μl，室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定(Beckman Coulter,Epics XL)。

1.2.5活性氧(Reactive oxygen species，ROS)測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第二天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯和終濃度為3 mmol/L抑制劑NAC，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集細(xì)胞后懸浮于稀釋好的終濃度為10 μmo/L的DCFH-DA染液中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。PBS洗滌、離心細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，流式細(xì)胞儀測(cè)定(Beckman Coulter,Epics XL)。

1.2.6線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第2天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯和終濃度為3 mmol/L抑制劑NAC，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集細(xì)胞后加入10 μg羅丹明123，避光孵育30 min后PBS洗滌、重懸后上機(jī)測(cè)定(Beckman Coulter,Epics XL)。

1.2.7凋亡相關(guān)蛋白測(cè)定

1.2.7.1蛋白樣本制備測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，第二天加入不同終濃度的異土木香內(nèi)酯，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集細(xì)胞。應(yīng)用蛋白裂解液(30 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，25℃,2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，50 mg/ml亮肽素，50 mg/ml胃蛋白酶抑制劑A，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和50 mg/ml抑肽酶)裂解細(xì)胞，同時(shí)超聲粉碎3～4次，每次3～4 s，形成細(xì)胞裂解液。用BCA方法定量計(jì)算蛋白質(zhì)含量。將裂解后的細(xì)胞加入樣本緩沖液(62.5 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，4% SDS，10%丙三醇，10%β-巰基乙醇，0.002%溴酚藍(lán))，沸水中煮6 min，-20 ℃保存。

下面我通過(guò)比喻、夸張、對(duì)比和反問(wèn)四種修辭手法，分別闡述在《哈利·波特》小說(shuō)的翻譯過(guò)程中，修辭法準(zhǔn)確的翻譯與我們的習(xí)俗與文化相互結(jié)合幫助讀者真正理解《哈利·波特》的內(nèi)容，地道準(zhǔn)確的融合提高讀者對(duì)《哈利·波特》的理解力。

1.2.7.2SDS-PAGE電泳和Western blot實(shí)驗(yàn)按不同蛋白分子量配膠，每孔加入50 μg的蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂奶粉4 ℃過(guò)夜封閉；第二天TBST洗膜3次，5 min/次，抗體稀釋液稀釋一抗Bcl-2(1∶1 000)、Bax (1∶300)、Caspase-3(1∶1 000)、β-Actin(1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育3 h；TBST洗膜3次，5 min/次；加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1.5 h；TBST洗膜3次，5 min/次。進(jìn)入暗室操作，甩干NC膜上的液體，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)5 min，壓片后膠片經(jīng)過(guò)顯影液，雙蒸水，定影液洗片曝光。

2　結(jié)果

2.1MTT實(shí)驗(yàn)及Hoechst 33258核染異土木香內(nèi)酯對(duì)Hela的細(xì)胞毒性采用MTT方法測(cè)定。不同濃度的異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，以濃度依賴的方式使細(xì)胞活性降低，80 μmol/L的土木香內(nèi)酯可使Hela細(xì)胞活性抑制率高達(dá)80%以上，IC50抑制率濃度值為40.36 μmol/L(圖1)；而加入3 mmol/L抑制劑NAC可以顯著提高細(xì)胞活性。20 μmol/L和40 μmol/L的土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞后，熒光顯微鏡可以觀察到Hela細(xì)胞核出現(xiàn)典型的核固縮及細(xì)胞凋亡核碎裂形態(tài)(圖2 箭頭所示)。以上說(shuō)明異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡與ROS的產(chǎn)生相關(guān)。

2.2異土木香內(nèi)酯可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡且抑制細(xì)胞生長(zhǎng)于S期細(xì)胞凋亡和周期是反映細(xì)胞抑制生長(zhǎng)的兩個(gè)主要條件。數(shù)據(jù)表明，用20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組(2.31±0.56)(圖3A1)相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加，分別為19.56±3.41(圖3A2)、48.72±4.25(圖3A3)，P<0.05，可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)；而加入抑制劑NAC預(yù)處理后，再0加入異土木香內(nèi)酯，可以有效地抑制Hela細(xì)胞凋亡(4.35±1.24)。數(shù)據(jù)也表明，異土木香內(nèi)酯以濃度依賴抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)于S期。20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，S期細(xì)胞數(shù)(P<0.05)從18.43±1.34增加到28.89±1.73和41.53±1.78；而相應(yīng)的G0/G1期細(xì)胞數(shù)(P>0.05)從58.18±3.63變化到58.33±1.72和59.36±0.97，G2/M期細(xì)胞數(shù)(P<0.05)從23.5±1.71遞減到15.16±0.78和5.16±0.63(圖4)?？梢钥闯霎愅聊鞠銉?nèi)酯可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡依賴于ROS的產(chǎn)生。

圖1　MTT方法測(cè)定不同濃度異土木香內(nèi)酯對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響Fig.1　MTT assay were used to test effect of different concentrations of isoalantolactone (IALT) on Hela cell viabilityNote: Compared with control group，*.P<0.05，**.P<0.01.

圖2　熒光顯微鏡和Hoechst 33258染色觀察異土木香內(nèi)酯對(duì)Hela細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞核變化Fig.2　Fluorescence microscope and Hoechst 33258 staining were used to observe nuclear morphological changes of apoptosis induced by isoalantolactone in Hela cellsNote: A.Control；B.20 μmol/L；C.40 μmol/L.Scale bar=20 μmol/L.

圖3　流式細(xì)胞儀測(cè)定異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡率Fig.3　Flow cytometry analysis of apoptosis induced by isoalantolactone(IALT) in Hela cellsNote: A1.Control;A2.20 μmol/L;A3.40 μmol/L;A4.40 μmol/L isoalantolactone+3 mmol/L NAC；B.Data are showed with ±s(n=3).Compared with control group，*.P<0.05.

圖4　流式細(xì)胞儀測(cè)定異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡各周期分布Fig.4　Flow cytometry analysis of cell cycle phase distribution induced by isoalantolactone(IALT) in Hela cellsNote: A.Control;B.20 μmol/L;C.40 μmol/L；D.).Compared with control group，*.P<0.05.

2.3異土木香內(nèi)酯可使Hela細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平通過(guò)DCFH-DA染料來(lái)測(cè)定。數(shù)據(jù)表明(圖5)，20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組相比有不同程度的增加，從2.02±0.47分別增加到20.63±3.45和25.14±4.70，P<0.05；而加入抑制劑NAC預(yù)處理后，再加入異土木香內(nèi)酯可以明顯減少ROS的產(chǎn)生。

2.4異土木香內(nèi)酯可使Hela細(xì)胞內(nèi)MMP水平降低為了測(cè)定異土木香內(nèi)酯對(duì)線粒體細(xì)胞膜的損傷，我們使用羅丹明123熒光染色檢測(cè)MMP水平變化。數(shù)據(jù)表明(圖6)，20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，Hela細(xì)胞MMP水平與對(duì)照組相比有不同程度的降低，從(93.14±0.57)%分別降低到(80.17±3.69)%和(67.32±4.41)%，P<0.05；而加入抑制劑NAC預(yù)處理后，再加入異土木香內(nèi)酯可以明顯提升MMP水平。

圖5　流式細(xì)胞儀測(cè)定異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS的生成Fig.5　Flow cytometry analysis of ROS generation induced by isoalantolactone(IALT) in Hela cellsNote: A1.Control;A2.20 μmol/L;A3.40 μmol/L;A4.40 μmol/L isoalantolactone+3 mmol/L NAC；B.Data are showed with ±s(n=3).Compared with control group，*.P<0.05.

圖6　流式細(xì)胞儀測(cè)定異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞MMP水平變化Fig.6　Flow cytometry analysis of changes of mitochond-rial membrane potential induced by isoalantolactone(IALT) in Hela cellsNote: A1.Control;A2.20 μmol/L;A3.40 μmol/L;A4.40 μmol/L isoalantolactone+3 mmol/L NAC；B.Data are showed with ±s(n=3).Compared with control group，*.P<0.05.

2.5異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡對(duì)相關(guān)蛋白的影響為了進(jìn)一步測(cè)定異土木香內(nèi)酯對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響，我們從蛋白水平測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的變化。如圖6A所示，20 μmol/L和40 μmol/L終濃度異土木香內(nèi)酯處理Hela細(xì)胞24 h后，Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)Caspase-3蛋白也被活化，細(xì)胞色素C釋放增加(P<0.05)。

圖7　免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)Fig.7　Protein expressions of apoptosis induced by isoalantolactone(IALT) in Hela cells were detected by Western blotNote: A.The protein expressions of Bcl-2，Bax，Caspase-3，Cytochrome C and β-actin；B.Data are showed with ±s(n=3).Compared with control group，*.P<0.05.

3　討論

宮頸癌作為全球排名第二位的女性惡性腫瘤[12]，其主要的致病因素是高危HPV持續(xù)感染導(dǎo)致的上皮內(nèi)瘤樣病變[13]。研究宮頸癌分子靶點(diǎn)的治療藥物仍然是當(dāng)前一大熱點(diǎn)，而天然提取物用于抗腫瘤治療的研究也越來(lái)越廣泛[14]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的許多天然藥物單體化合物如土木香內(nèi)酯和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯等都具有良好的抗腫瘤活性[15,16]。異土木香內(nèi)酯是從系菊科旋覆花屬植物土木香中分離出來(lái)的倍半萜內(nèi)酯類化合物單體，也具有良好的抗腫瘤活性[17]，在此，我們主要研究其誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的初步機(jī)制。凋亡一直是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)話題[14]。從我們的實(shí)驗(yàn)可知，異土木香內(nèi)酯抑制Hela細(xì)胞增殖呈明顯的濃度依賴性。Hoechst 33258核染后，在熒光顯微鏡下觀察到明顯的細(xì)胞核固縮及核碎裂形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)同樣顯示，異土木香內(nèi)酯濃度增加，Hela細(xì)胞凋亡率也增加，也具有濃度依賴性；通過(guò)測(cè)定細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，異土木香內(nèi)酯可以抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)于細(xì)胞周期S期，說(shuō)明異土木香內(nèi)酯是通過(guò)抑制Hela細(xì)胞內(nèi)DNA合成而阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)；且異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡伴隨著ROS產(chǎn)生。ROS過(guò)多可產(chǎn)生氧化應(yīng)激，可使線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化、膜蛋白氧化和DNA損傷，對(duì)線粒體膜產(chǎn)生損害，導(dǎo)致線粒體通透性增加，從而使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。我們也發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯可以使Hela細(xì)胞線粒體膜電位水平降低，同時(shí)也檢測(cè)到大量細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Caspase-3作為Caspase家族成員在凋亡中的關(guān)鍵酶，異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡也被激活，出現(xiàn)cleaved Caspase蛋白。ROS作為第二信使進(jìn)入線粒體，可以激活線粒體內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中蛋白Bcl-2家族[17]。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白如Bcl-2和促凋亡蛋白如Bax等蛋白，在線粒體外膜穩(wěn)定性和凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)Bcl-2/Bax蛋白比例失調(diào)后，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)，異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡后，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)明顯升高。

綜上所述，ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞膜電位的改變和細(xì)胞色素C的釋放是線粒體損傷凋亡的特征性改變，由此可見(jiàn)異土木香內(nèi)酯是通過(guò)介導(dǎo)ROS產(chǎn)生和線粒體損傷來(lái)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的，同時(shí)伴隨著上調(diào)Bax蛋白表達(dá)而下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，激活Caspase-3蛋白酶。異土木香內(nèi)酯對(duì)其他腫瘤的作用及更多機(jī)制和體內(nèi)藥理作用有待進(jìn)一步研究，有望開(kāi)發(fā)成為以線粒體凋亡途徑為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥。

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[收稿2016-05-29]

(編輯張曉舟)

Isoalantolactone induces apoptosis in human cervical cancer Hela cells through ROS generation and Mitochondrial dysfunction

YU Xiu-Yan，LI Ting，WU Xue-Feng，LIU Xiao-Feng.

Cancer Hospital of Jilin Province，Changchun 130012，China

Objective:To investigate the induction of apoptosis by isoalantolactone in human cervical cancer Hela cells is mediated through ROS generation and Mitochondrial dysfunction.Methods: Cells were treated with isoalantolactone in a dose-dependent manner in the presence or absence of NAC for 24 h as the experimental group,and the normal cells were used as control group.Cell viabilities were determined by the MTT assay；the nuclear morphology of Hela cells were observed under fluorescence microscope using the Hoechst 33258 staining；apoptosiscell cycle and reactive oxygen species(ROS) and mitochondrial membrane potential(MMP) were measured by flow cytometry；the protein expression levels of cytochrome C，Bcl-2，Bax and Caspase-3 were detected by Western blot.Results: In the present study,we found that isoalantolactone inhibits growth in a dose-dependent manner in Hela cells.Further studies revealed that Hela cells were treated with 20 and 40 μmol/L isoalantolactone for 24 h,after which we could observe the fragmented nuclei and the increased apoptosis rate.And we also found that isoalantolactone arrested the cell cycle at S phase and increased generation of reactive oxygen species and dissipation of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in Hela cells.While pretreatment with NAC obviously blocked the apoptotic and inhibition effect of isoalantolactone indicating that induction of apoptosis is ROS-dependent，Western blot study showed that isoalantolactone increased the expression of Bax and cleaved Caspase-3 and decreased the expression of Bcl-2 with concomitant release of cytochrome C from mitochondria into cytosol.Conclusion: Isoalantolactone could inhibit the proliferation and induce the apoptosis of human cervical cancer Hela cells in vitro through mediating ROS generation and Mitochondrial dysfunction,the mechanism of which is also accompanied by up-regulation of Bax expression，down-regulation of Bcl-2 expression,activation of Caspase-3 and release of cytochrome C.

Isoalantolactone；ROS；Mitochondrial dysfunction；Hela cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.013

于秀艷(1968年-)，女，碩士，主任技師，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail:yuxiuyan1968@sohu.com。

及指導(dǎo)教師：劉曉峰(1972年-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail:liuyang7406@sohu.com。

R737.33

A

1000-484X(2016)10-1467-06

①本論文受吉林省衛(wèi)生計(jì)生委課題(20142021)資助。