喻丹丹　吳　瓊　羅蘭芳　余為一　陳芳芳

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

?

雞B-FA分子中結(jié)合Ii鏈功能片段特性的研究①

喻丹丹吳瓊羅蘭芳余為一陳芳芳

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

目的：研究雞Ii鏈結(jié)合的B-FA分子的功能片段及其特征。方法：將克隆的B-FA基因片段(α1α2、sα1α2和α3TC)分別插入原核或真核表達(dá)質(zhì)粒，然后分別轉(zhuǎn)染或與Ii共轉(zhuǎn)染工程菌E.coli(BL-21)或293T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化和SDS-PAGE鑒定后，分別用Pull-down法觀察B-FA片段與Ii結(jié)合與在細(xì)胞內(nèi)的共定位特征。結(jié)果：首先，構(gòu)建了3個(gè)重組原核表達(dá)質(zhì)粒和4個(gè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒。原核表達(dá)的B-FA片段經(jīng)親和層析純化可獲得單一蛋白分子。其次，用Pull-down從共轉(zhuǎn)染工程菌表達(dá)的蛋白分子中分別檢測(cè)到Ii/B-FA-α1α2和Ii/B-FA-sα1α2，而未能檢測(cè)到Ii與α3TC的結(jié)合物，而免疫印跡結(jié)果也表明該兩片段是結(jié)合Ii鏈形成復(fù)合物的功能片段。最后，在真核表達(dá)的293T中，B-FA-α1α2具有同B-FA相同的細(xì)胞定位特性。結(jié)論：雞B-FA-α1α2片段是結(jié)合Ii的功能片段，并保持了B-FA的細(xì)胞定位的作用。本研究結(jié)果首次提供了B-FA分子與Ii的互相作用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

恒定鏈；B-FA片段；Pull-down；表達(dá)；復(fù)合物

在特異性免疫應(yīng)答中主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC) 起了重要作用。MHCⅠ類分子遞呈內(nèi)源性，而Ⅱ類分子則遞呈外源性抗原肽。Ⅰ類和Ⅱ類分子均由α和β鏈組成異聚體，其中Ⅰ類分子的β鏈和Ⅱ類分子的α鏈呈高度保守性，而Ⅰ類分子的α鏈和Ⅱ類的β鏈則呈高度多態(tài)性[1]，而且它們的多態(tài)性主要發(fā)生在肽結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)域[2,3]。

恒定鏈(Invariant chain,Ii)是MHCⅡ類分子的伴侶分子，不僅參與Ⅱ類分子成熟、裝配，還影響MHCⅡ類分子在細(xì)胞內(nèi)遷移以及轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面[4-8]，特別是Ii鏈協(xié)助遞呈外源性抗原肽。期間，Ii占據(jù)MHCⅡ類分子的肽結(jié)合區(qū)的凹槽，阻止內(nèi)源性肽的進(jìn)入[9,10]，并與之結(jié)合形成三聚體(αβIi)[11]，而且在體外Ii與MHCⅡ類分子的α或β鏈形成二聚體[12,13]。

近年來(lái)，許多證據(jù)表明Ii也結(jié)合MHCⅠ類分子，并參與對(duì)內(nèi)源性抗原肽的交叉遞呈[14,15]。Neumann等[16]發(fā)現(xiàn)，小鼠(Musmusculus)不同型的Ⅰ類分子與Ii廣泛結(jié)合。在人的MHCⅠ類分子不同型與Ii的結(jié)合中也表現(xiàn)出差異[17]。作者在過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)，不僅雞(Gallusgallus)Ii鏈[18]，而且草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)Ii鏈均可與相應(yīng)MHCⅠ類分子結(jié)合[19]，其中在用真核細(xì)胞共表達(dá)發(fā)現(xiàn)，雞Ii與Ⅰ類分子(B-F)的結(jié)合表現(xiàn)為型依賴性[18]，而且在進(jìn)一步用原核表達(dá)和Pull-down法檢測(cè)中證實(shí)了這兩個(gè)分子之間的結(jié)合[20]。盡管根據(jù)MHCⅡ分子X(jué)線衍射發(fā)現(xiàn)在結(jié)合肽區(qū)存在凹槽，推測(cè)該凹槽是Ii分子也同時(shí)是抗原肽結(jié)合的部位[21,22]，但是還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)確定。為此，本研究在Ii結(jié)合雞B-FA分子和已建立Pull-down方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建B-FA分子的片段，以此確定B-FA與Ii結(jié)合的功能區(qū)，為揭示Ii與MHCⅠ類分子互相作用的機(jī)理提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，美國(guó))；大腸桿菌(E.coli) BL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根公司；廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自康為世紀(jì)公司(北京)；小鼠抗GST和山羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司(北京)；質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自捷倍斯生物科技有限公司(廣州)；PlusMixs酶、DNA Marker、 蛋白Marker購(gòu)自東盛生物科技有限公司(廣州)；DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司(美國(guó))；GST純化柱(Gluttathione sepharose 4B)和鎳柱均購(gòu)自GE heathcare公司(瑞典)。

1.1.2引物與質(zhì)粒自行設(shè)計(jì)的引物及其內(nèi)切酶如表1所示，由華大科技生物有限公司合成。質(zhì)粒PET-28a、pGEX-4T-1和重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-C-Ii、PET-39b-C-Ii和pEGFP-C1-Ii由實(shí)驗(yàn)室保存[20]。

1.2方法

1.2.1目的基因的克隆、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定用表1中的引物從實(shí)驗(yàn)室保存的cDNA中分別克隆雞B-FA-α1α2、B-FA-sα1α2和B-FA-α3TC基因片段(圖1)[18]，PCR反應(yīng)體系:Plus Mixs (25 μl)、上下游引物 (20 μmol/ml)各0.5 μl、重組質(zhì)粒 (63 μg/ml)各0.5 μl，加ddH2O至終體積50.0 μl；PCR反應(yīng)程序:熱變性94℃5 min、94℃ 30 s、54℃ 45 s、72℃ 1 min、30個(gè)循環(huán)和72℃ 8 min延伸。經(jīng)凝膠回收的B-FA-α1α2、B-FA-sα1α2和B-FA-α3TC片段與空載體分別經(jīng)以下酶切體系(質(zhì)?！? 500 ng、限制性內(nèi)切酶各1.5 μl、×10緩沖液3.0 μl，加ddH2O至終體積30.0 ml，37℃ 1.5 h反應(yīng))進(jìn)行雙酶切，目的片段與質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒。使用的限制性內(nèi)切酶與所構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別如表1和圖1所示。這些重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR(體系條件同上)、雙酶切(同上)結(jié)果經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后送上海華大基因科技有限公司測(cè)序。

經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒(包括實(shí)驗(yàn)室保存的2個(gè)含Ii基因的質(zhì)粒)，以單一質(zhì)?；蜿P(guān)聯(lián)的雙質(zhì)粒方式轉(zhuǎn)染重組菌 BL-21，構(gòu)建8個(gè)重組菌BL-21(PET-28a-B-FA-α1α2)、BL-21(PET-28a-B-FA-sα1α2)、BL-21(pGEX-4T-1-B-FA-α3TC) 、BL-21(pGEX-4T-1-C-Ii)、BL-21(PET-39b-C-Ii)、BL-21(PET-28a-B-FA-α1α2+pGEX-4T-1-C-Ii)、BL-21 (PET-28a-B-FA-sα1α2+pGEX-4T-1-C-Ii) 和BL-21(pGEX-4T-1-B-FA-α3TC+PET-39b-C-Ii)，然后再次經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序。以異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG) 0.5 mmol/L、5 h于37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體用180 W、5 s，間隔10 s超聲波破碎菌體，12 000 r/min，離心15 min后收集的沉淀(包涵體)，用8 mol/L尿素變性溶解，加入到透析袋于PBS中4℃透析48 h，期間更換4～6次透析液，使蛋白復(fù)性，然后SDS-PAGE電泳鑒定。

表1引物序列與構(gòu)建的重組質(zhì)粒

Tab.1Primer sequences and recombinant plasmids

Primersequences(5'-3')RecombinantplasmidsUp:(EcoRⅠ)Down:(SalⅠ)5'-cggaattcatggagctccataccctgc-3'5'-acgcgtcgacctatctcctgcccagctca-3'PET-28a-B-FA-α1α25'-cggaattcatggggccgtgcgggg-3'5'-acgcgtcgacctatctcctgcccagctca-3'PET-28a-B-FA-sα1α25'-cggaattcatggagcggcccgaggtgc-3'5'-acgcgtcgactcagatggaggggttg-3'pGEX-4T-1-B-FA-α3TC5'-cccgaattcatatggagctccataccctgc-3'5'-gcgtcgacactctcctgcccagctca-3'pEGFP-N1-B-FA-α1α25'-gcgtcgacactctcctgcccagctca-3'5'-gcgtcgacactctcctgcccagctca-3'pEGFP-N1-B-FA-sα1α25'-cccgaattcatatggagcggcccaggtgc-3'5'-gcgtcgacacgatggaggggttg-3'pEGFP-N1-B-FA-α3TC5'-cccgaattcatatggggccgtgcgggg-3'5'-gcgtcgacacgatggaggggttg-3'pEGFP-N1-B-FA

1.2.2Pull-down純化與檢測(cè)目的蛋白間相互作用由BL-21(pGEX-4T-1-C-Ii)、BL-21(pGEX-4T-1-B-FA-α3TC) 表達(dá)復(fù)性的GST-Ii和GST/B-FA-α3TC經(jīng)GST親和層析柱(Gluttathione sepharose 4B)進(jìn)行純化，用10 mmol/L的還原型谷胱甘肽進(jìn)行蛋白的解離洗脫，洗脫后蛋白即為GST/Ii和GST/B-FA-α3TC純化后的蛋白。從BL-21(PET-28a-B-FA-α1α2)、BL-21(PET-28a-B-FA-sα1α2) 、BL-21(PET-39b-C-Ii)獲得的His/B-FA-α1α2、His/B-FA-sα1α2、His/Ii用結(jié)合His標(biāo)簽的鎳柱進(jìn)行蛋白純化。目的蛋白的洗脫按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。由重組菌BL-21 (PET-28a-B-FA-α1α2/pGEX-4T-1-C-Ii)、BL-21 (PE T-28a-B-FA-sα1α2/pGEX-4T-1-C-Ii)和BL-21(pGE X-4T-1-B-FA-α3TC/PET-39b-C-Ii)表達(dá)的可溶性蛋白復(fù)合物(His/B-FA-α1α2+GST/Ii；His/B-FA-sα1α2+GST/Ii；GST/B-FA-α3TC+His/Ii)用結(jié)合His標(biāo)簽的鎳柱進(jìn)行Pull-down拉下，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)；最后用PAGE和SDS-PAGE檢測(cè)蛋白復(fù)合物分子間的相互作用。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與熒光顯微鏡觀察293T細(xì)胞的培養(yǎng)、重組質(zhì)粒pEGFP-C1-Ii、pEGFP-N1-B-FA-α1α2、 pEGFP-N1-B-FA-sα1α2、pEGFP-N1-B-FA-α3TC和 pEGFP-N1-Ⅰα轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以及熒光顯微鏡觀察表達(dá)物在細(xì)胞內(nèi)的定位均按孟凡濤等[21]操作。

1.2.4免疫印跡將1.2.2收集解離洗脫的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳后，半干法轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用小牛血清封閉1 h處理后按照1∶5 000比例加入小鼠抗GST抗體孵育過(guò)夜，次日用山羊抗鼠IgG抗體孵育1 h后，用電化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated chemiluminescence,ECL)顯色方法檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1B-FA基因片段和重組質(zhì)粒的鑒定首先，根據(jù)B-FA分子的結(jié)構(gòu)，用自行設(shè)計(jì)的引物從實(shí)驗(yàn)室保存的雞B-FA基因(GenBank No：KF274030)克隆了三個(gè)片段，分別為B-FA-α1α2(64～600 bp)、B-FA-sα1α2(1～600 bp)和B-FA-α3TC(601～1 068 bp)，見(jiàn)圖1。其次，經(jīng)電泳和DNA測(cè)序鑒定后，分別插入表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建了PET-28a-B-FA-α1α2、PET-28a-B-FA-sα1α2和pGEX-4T-1-B-FA-α3TC三個(gè)重組質(zhì)粒。雙酶切鑒定(圖2)和DNA測(cè)序結(jié)果表明，這些質(zhì)粒中均含有相應(yīng)的目的片段。

圖1　構(gòu)建B-FA片段示意圖Fig.1　A schematic diagram of structured B-FA segmentsNote: S.Signal peptide;α1α2.Peptide binding region;α3.Imm-unoglobulin domain;T.Transmembrane domain;C.Cytoplasmic domain.

圖2　重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2　Identification of products of double enzyme digestion recombinant plasmidsNote: M.DL2000;1，4，7.Recombinant plasmids PET-28a-B-FA-α1α2,PET-28a-B-FA-sα1α2,pGEX-4T-1-B-FA-α3TC;2，5，8.Digested products of PET-28a-B-FA-α1α2,PET-28a-B-FA-sα1α2,pGEX-4T-1-B-FA-α3TC;3，6，9.PCR products of B-FA-α1α2,B-FA-sα1α2,B-FA-α3TC.

圖3　表達(dá)和經(jīng)親和層純化的B-FA片段和Ii的融合蛋白分子Fig.3　Fusion proteins of B-FA segments and Ii expressed and purified via affinity chromatographyNote: A.Fusion proteins of B-FA segments and tags.M.Protein MW;1.His/B-FA-α1α2;2.His/B-FA-sα1α2;3.GST/B-FA-α3TC.B.Fusion proteins of Ii and tags；M.Protein MW;1.GST/Ii;2.His/Ii；3.GST control;4.His (and other tags) control.

2.2B-FA基因片段的原核表達(dá)及其產(chǎn)物的純化為獲得具有結(jié)合活性的目的蛋白，將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒(PET-28a-B-FA-α1α2、PET-28a-B-FA-sα1α2和pGEX-4T-1-B-FA-α3TC)分別轉(zhuǎn)染工程菌E.coli(BL21)。誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)親和層析柱純化。如圖3A所示，實(shí)驗(yàn)所需的重組融合蛋白不僅被表達(dá)，而且還可以與親和層析柱結(jié)合而被純化。其中，His/B-FA-α1α2大小為26.9 kD，His/B-FA-sα1α2為28.6 kD(His為6.2 kD，B-FA-α1α2和B-FA-sα1α2分別為 20.7 kD和22.4 kD)，GST/B-FA-α3TC為42.6 kD(GST為26 kD，B-FA-α3TC為16.6 kD)。此外，如圖3B所示，實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-C-Ii和PET-39b-C-Ii分別表達(dá)的GST/Ii為50.8 kD(含GST 26.0 kD和Ii 24.8 kD)和His/Ii為54.8 kD(含PET-39b-C中His和其他載體標(biāo)簽蛋白30.0 kD)。

2.3B-FA的肽結(jié)合區(qū)是結(jié)合Ii的功能片段為檢測(cè)表達(dá)的B-FA片段是否與Ii結(jié)合，將三個(gè)重組質(zhì)粒分別同含Ii的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工程菌E.coli(BL-21)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，分別用Pull-down方法檢測(cè)B-FA片段/Ii聚合分子。在PAGE和SDS-PAGE電泳中，三個(gè)樣品出現(xiàn)不同的結(jié)果。

首先，在PAGE電泳后，His/B-FA-α1α2與GST/ Ii形成可見(jiàn)的分子量為77.7 kD(His/B-FA-α1α2與GST/ Ii)的復(fù)合物(圖4A泳道1)，它的解離物則是GST/Ii(50.8 kD)和His/B-FA-α1α2(26.9 kD)；經(jīng)SDS-PAGE電泳后只有兩個(gè)解離的分子(His/B-FA-α1α2和GST/Ii，圖4C泳道2)。表明這兩個(gè)分子能互相結(jié)合形成復(fù)合物，同時(shí)在SDS作用下完全被解離。

其次，共表達(dá)產(chǎn)物His/B-FA-sα1α2與GST/Ii在直接電泳中未被發(fā)現(xiàn)蛋白條帶(圖4B泳道1)，而在SDS電泳中，則出現(xiàn)相應(yīng)的條帶(圖4C泳道4)。由于共表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析柱處理，只有復(fù)合物(His/B-FA-sα1α2與GST/Ii)才能被留在柱內(nèi)，并最后在被解離液洗脫。推測(cè)洗脫的復(fù)合物形成大的聚合物而不能進(jìn)入凝膠，而經(jīng)SDS處理后則被解離。表明His/B-FA-sα1α2與GST/Ii能夠形成復(fù)合物，但其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。

再次，共表達(dá)產(chǎn)物GST/B-FA-α3TC與His/Ii在PAGE中只出現(xiàn)結(jié)合于層析柱的His/Ii(圖4B泳道2)，既無(wú)聚合物，也沒(méi)有GST/B-FA-α3TC。為驗(yàn)證共表達(dá)產(chǎn)物中GST/B-FA-α3TC的存在，將洗脫液進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)該分子的條帶(圖4C泳道7)，表明這兩個(gè)分子均被表達(dá)，但未形成復(fù)合物。

2.4復(fù)合分子中的解離分子或未被結(jié)合的分子均可被特異性抗體識(shí)別在SDS-PAGE電泳中，與B-FA片段結(jié)合的Ii被解離形成單一蛋白條帶。為證實(shí)該解離的分子性質(zhì)，進(jìn)一步用免疫印跡做了檢測(cè)。如圖5A的結(jié)果所示，與His/B-FA-α1α2(泳道1)或His/B-FA-sα1α2(泳道3)結(jié)合的GST/Ii均可被特異性抗體識(shí)別與結(jié)合。由于共表達(dá)產(chǎn)物GST/B-FA-α3TC和His/Ii中是His標(biāo)簽的鎳柱層析的，所以在免疫印跡中用抗GST抗體檢測(cè)GST/B-FA-α3TC。結(jié)果表明，單一GST/B-FA-α3TC表達(dá)物(泳道1)、空載體(泳道2)、層析前的共表達(dá)物(泳道3)、層析過(guò)程中的洗脫液(泳道4)中均存相應(yīng)條帶，唯獨(dú)共表達(dá)的解離物中不存在GST/B-FA-α3TC(泳道5)，提示GST/B-FA-α3TC并未與His/Ii結(jié)合而被直接洗脫，表明GST/B-FA-α3TC與His/Ii并未形成復(fù)合物。

圖4　共表達(dá)和經(jīng)Pull-down拉下的B-FA片段/Ii復(fù)合物的鑒定Fig.4　Identification of complexes (B-FA-α1α2/Ii) coexpressed and obtained by pull-downNote: A.PAGE identification of complexes (B-FA segments/Ii).M.Protein MW;1.Coexpressed products of GST/ Ii+His/B-FA-α1α2；B.PAGE identification of dissociated complex (B-FA-α1α2/Ii and B-FA-α3 TC/Ii);M：Protein mus;1.GST/Ii+His/B-FA-sα1α2;2.His/Ii+GST/B-FA-α3TC.C.SDS-PAGE identification of complexes (B-FA-α，α2/Ii and B-FA-α3 TC/I)；M；Protein Mus；1.GST/Ii+His/B-FA-sα1α2；2.His/Ii.GST/B-FA-α3TC.M.protein MW;1.GST/Ii;2.Coexpressed products of GST/Ii+His/B-FA-α1α2;3.His/B-FA-α1α2;4.Coexpressed products of His/B-FA-sα1α2+GST/Ii;5.His/B-FA-sα1α2;6.GST/Ii;7.GST/B-FA-a3TC;8.His;9.GST.

圖5　免疫印跡鑒定Pull-down中解離或未被結(jié)合的分子Fig.5　Identification of molecules dissociated or no bound in Pull-down by Western blotNote: A.Detection of GST/Ii；M.Protein MW;1,3.Eluant disscociation solution of coexpression with GST/Ii;2,4.Sinple expression;5.GST/Ii control;6.Negative control.B.Detection of GST/B-FA-α3TC；M.Protein MW;1.Sinple expression;2.GST control;3.Coexpression with His/Ii and no chromatography;4.Wash solution of the chromatography of coexpression with His/Ii;5.Eluant disscociation solution of coexpression with His/Ii.

圖6　B-FA片段和Ii分子在真核細(xì)胞的定位(×1 000)Fig.6　Localization of B-FA segments and Ii molecule in eukaryotic cells (×1 000)

2.5在真核細(xì)胞內(nèi)B-FA片段具有不同的定位特征為了解B-FA片段和Ii在真核細(xì)胞的定位，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察比較表達(dá)的B-FA、Ii、B-FA-sα1α2、B-FA-α1α2和B-FA-α3TC在真核細(xì)胞內(nèi)的定位特點(diǎn)。如圖6所示，空質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)分布于整個(gè)細(xì)胞，而B(niǎo)-FA和Ii則均分布于細(xì)胞的漿膜系統(tǒng)。B-FA-sα1α2、B-FA-α1α2保持了B-FA定位于漿膜系統(tǒng)，但是同時(shí)也表現(xiàn)出在局部聚集的特點(diǎn)。但是B-FA-α3TC失去了B-FA的定位特性，分布于整個(gè)細(xì)胞。上述結(jié)果表明B-FA-sα1α2、B-FA-α1α2不僅保持了與Ii分子結(jié)合的特性，也保持在細(xì)胞內(nèi)的定位特性。進(jìn)一步收集細(xì)胞，用免疫印跡檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)存在相應(yīng)的特異性蛋白帶(圖7)。其中GFP/B-FA-α1α2為47.7 kD、GFP/B-FA-sα1α2為49.4 kD、GFP/B-FA-α3TC為43.6 kD和GFP/B-FA為86.6 kD(GFP為27 kD和GFP/B-FA為59.6 kD，其他分子大小見(jiàn)結(jié)果2.2)。

3　討論

MHCⅠ類分子的肽結(jié)合區(qū)是與Ii結(jié)合的功能區(qū)。MHC分子的高度多態(tài)性主要存在于Ⅰ類分子的α鏈和Ⅱ類分子的β鏈，它們均由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即B-FA的信號(hào)肽α1、α2、α3、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，以及B-LB的β1、β2、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。其中，α1、α2和β1分別是肽結(jié)合區(qū)，呈高度多態(tài)性[2]；而α3和β2又稱免疫球蛋白樣區(qū)，呈保守性[2]。肽結(jié)合區(qū)是該分子遞呈抗原肽的功能區(qū)。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析推測(cè)，Ii鏈通過(guò)占據(jù)Ⅱ類分子肽結(jié)合區(qū)中凹槽而防止內(nèi)源性多肽進(jìn)入肽結(jié)合區(qū)[9,10,22,23]。近年來(lái)，Ⅰ類分子與Ii的結(jié)合多有報(bào)道[16-18]，并且表明Ii在交叉遞呈中起重要作用[14,15]。我們以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明這種結(jié)合[18-20]，但是不清楚與Ii結(jié)合的Ⅰ類分子功能區(qū)。在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Ⅰ類分子的肽結(jié)合區(qū)(α1和α2)是與Ii鏈結(jié)合的區(qū)域(圖4和5)，而其他結(jié)構(gòu)域在原核表達(dá)系統(tǒng)并不具有結(jié)合功能。這些說(shuō)明Ⅰ類分子內(nèi)存在與Ⅱ類分子相似的結(jié)構(gòu)，也提示了Ⅰ類分子與Ⅱ類分子同源性和功能的同一性。

MHCⅠ類分子與Ii的結(jié)合受到多種因素的影響。盡管實(shí)驗(yàn)證明，B-FA的α1和α2是結(jié)合Ii的功能區(qū)，但是這種結(jié)合受到多因素的影響。特別是受到空間結(jié)構(gòu)的影響。比如在用標(biāo)簽蛋白GST連接B-FA-α1α2時(shí)，難以在原核中表達(dá)，只有改變His標(biāo)簽蛋白后，才得到表達(dá)。還比如GST/Ii+His/B-FA-α1α2能形成復(fù)合物，并在PAGE中進(jìn)入凝膠被觀察到(圖4A)。但是GST/B-FA-sα1α2在與Ii結(jié)合后，卻不能形成His/Ii+GST/B-FA-sα1α2復(fù)合物，而是以多聚合物出現(xiàn)，以至于在PAGE中不能進(jìn)入凝膠；只有在經(jīng)SDS處理后，在PAGE中觀察到它們被解離后的單一分子?？傊?，這些原核表達(dá)分子即使保持了相應(yīng)的活性，在空間結(jié)構(gòu)方面還是受到諸多因素的影響。這可能是過(guò)去在研究Ii與MHC分子的關(guān)系方面難有突破的原因。

[1]Mona AS,Crestanello B,Bankhead-Dronnet S,etal.Disentangling the effects of recombination,selection,and demography on the genetic variation at a major histocompatibility complex class II gene in the alpine chamois[J].Mol Ecol,2008,17(18):4053-4067.

[2]Dai Y,Chen FF,Liu XL,etal.cDNA cloning and antigen-binding sites of the MHC class I in Chinese native chicken (Qingyuan Partridge chicken) [J].JFAE,2010,8(1):91-97.

[3]Chen F,Pan L,Wu C,etal.Character of chicken polymorphic major histocompatibility class Ⅱ alleles of three Chinese local breeds[J].Poultry Sci，2012，91(5):1097-1104.

[4]Jasanoff A,Wagner G,Wiley DC.Structure of a trimeric domain of the MHC class II-associated chaperonin and targeting protein Ii[J].EMBO J,1998,17(23):6812-6818.

[5]Strubin M,Berte C,Mach B.Alternative splicing and alternative initiation of translation explain the four forms of the Ia antigen-associated invariant chain[J].EMBO J,1986,5(13):3483-3488.

[6]Warmerdam PA,Long EO,Roche PA.Isoforms of the invariant chain regulate transport of MHC class II molecules to antigen processing compartments[J].J Cell Biol,1996,133(2):281-291.

[7]Sillé FC,Martin C,Jayaraman P,etal.Requirement for invariant chain in macrophages for Mycobacterium tuberculosis replication and CD1d antigen presentation[J].Infect Immun,2011,79(8):3053-3063.

[8]Karakikes I,Morrison IE,O′Toole P,etal.Interaction of HLA-DR and CD74 at the cell surface of antigen-presenting cells by single particle image analysis[J].Faseb J,2012,26(12):4886-4896.

[9]Romagnoli P,Germain RN.The CLIP region of invariant chain plays a critical role in regulating major histocompatibility complex class Ⅱ folding,transport,and peptide occupancy[J].J Exp Med,1994,180(3):1107-1113.

[10]Dixon AM,Stanley BJ,Matthews EE,etal.Invariant chain transmembrane domain trimerization:a step in MHC class II assembly[J].Biochemistry,2006,45(16):5228-5234.

[11]Frauwirth K,Shastri N.Mutation of the invariant chain transmembrane region inhibits Ⅱ degradation,prolongs association with MHC class Ⅱ,and selectively disrupts antigen presentation[J].Cell Immunol,2001,209(2):97-108.

[12]Arneson LS,Miller J.Efficient endosomal localization of major histocompatibility complex class II-invariant chain complexes requires multimerization of the invariant chain targeting sequence[J].J Cell Biol,1995,129(5):1217-1228.

[13]Roche PA,Cresswell P.Proteolysis of the class II-associated invariant chain generates a peptide binding site in intracellular HLA-DR molecules[J].J Immunol,2011,187(13):1076-1080.

[14]Germain RN.Uncovering the role of invariant chain in controlling MHC class II antigen capture[J].J Immunol,2011,187(3):1073-1075.

[15]Basha G,Omilusik K,Chavez-Steenbock A,etal.A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway[J].Nat Immunol,2012,13(3):237-245.

[16]Neumann J,Koch N.Assembly of major histocompatibility complex class Ⅱ subunits with invariant chain[J].Febs Lett,2005,579(27):6055-6059.

[17]van Lith M,McEwen-Smith RM,Benham AM.HLA-DP,HLA-DQ,and HLA-DR have different requirements for invariant chain and HLA-DM[J].J Biol Chem,2010,285(52):40800-40808.

[18]Chen F,Pan L,Zhang JG,etal.Allele-dependent association of chicken MHC class I molecules with the invariant chain[J].Vet immunol Immunopathol,2014,160(3-4):273-280.

[19]林海斌,張婭菲,楊聰鶯,等.應(yīng)用pull-down方法檢測(cè)草魚(yú)恒定鏈與MHC分子的結(jié)合[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2015,23(6):722-778.

[20]羅蘭芳,余為一,陳芳芳.雞Ii與B-L基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞定位與結(jié)合活性特征[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2015,31(7):879-883.

[21]孟凡濤，陳芳芳，余為一.兩種恒定鏈活性片段載體在增強(qiáng)抗體分泌中的作用比較[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2012,28(8):728-732.

[22]Koutsogiannouli EA,Moutou KA,Sarafidou T,etal.Major histocompatibility complex variation at class II DQA locus in the brown hare (Lepus europaeus) [J].Mol Ecol,2009,18(22):4631-4649.

[23]Günther S,Schlundt A,Sticht J,etal.Bidirectional binding of invariant chain peptides to an MHC class Ⅱ molecule[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(51):22219-22224.

[收稿2016-05-10]

(編輯許四平)

Research of functional segments of chicken B-FA molecule binding with Ii chain

YU Dan-Dan,WU Qiong,LUO Lan-Fang,YU Wei-Yi,CHEN Fang-Fang.

Key Laboratory of Zoonoses of Anhui Province,Anhui Agricultural University,Hefei 230036，China

Objective:To research the functional segments of B-FA molecule binding invariant chain and their characters.Methods: The DNA segments (α1α2，sα1α2 andα3TC) of B-FA genes were respectively cloned and inserted into prokaryotic or eukaryotic expression plasmids,then they were singly or co-transfected with Ii gene into the engineering bacteriaE.coli(BL-21)or 293T cells.After induction of expression,affinity chromatography and SDS-PAGE identification,the binding between B-FA segments and Ii molecule and co-localization in cells were observed with Pull-down and Western blot.Results: First three recombinant prokaryotic expression plasmids and four recombinant eukaryotic expression plasmids were constructed.The single molecules expressed by B-FA segments were observed after an affinity chromatography.Secondly the complexes of Ii/B-FA-α1α2 and Ii/B-FA-sα1α2 were detected by a Pull-down from the co-transfected corresponding prokaryotic expression plasmids,but no complex of Ii and α3TC,also in the western blot it was detected that B-FA-α1α2 or B-FA-sα1α2 as functional segment could bind Ii to form complex.Finally in eukaryotic expression 293T cells B-FA-sα1α2 kept localization,the same as B-FA.Conclusion: Chicken B-FA-α1α2 is function segment to bind with Ii molecule and keeps the location characters same as B-FA.The results of this research first time provide experimental evidence about B-FA functional region binding segment to Ii molecule.

Invariant chain;B-FA segment;Pull-down;Expression;Complex

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.002

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31572496；31372417)。

喻丹丹(1995年-)，女，主要從事微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：1397201703@qq.com。

及指導(dǎo)教師：陳芳芳(1982年-) ，女，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：fang7828887@126.com。

S852.4

A

1000-484X(2016)10-1413-06