范玲玲　李彩霞　黃黎俐　蔡曉平

GeneXpert系統(tǒng)在肺結(jié)核中的診斷價值

范玲玲李彩霞黃黎俐蔡曉平

目的 評價GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)在肺結(jié)核中的診斷價值。方法 對408例疑診肺結(jié)核的患者痰樣本分別進行痰抗酸鏡檢（AFB）、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（MTB）和GeneXpert MTB/RIF檢測，并進行比較。結(jié)果 以臨床確診為金標(biāo)準(zhǔn)，抗酸涂片鏡檢、TB培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感性分別為85.7%、99.0%、100%；以臨床確診+臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，抗酸涂片鏡檢、TB培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感性分別為38.0%%、43.9%、45.1%；GeneXpert敏感性高于抗酸涂片鏡檢（P＜0.05），等同于結(jié)核培養(yǎng)；GeneXpert菌量梯度與抗酸涂片鏡檢等級呈一定正相關(guān)（r=0.672）；GeneXpert利福平耐藥測定與傳統(tǒng)比例法藥敏測定具有明顯相關(guān)性（kappa=0.951）。結(jié)論 GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)在肺結(jié)核診斷、療效觀察及預(yù)后評估具有重要價值。

肺結(jié)核 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù) 抗酸染色 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)

結(jié)核病實驗診斷是為結(jié)核病的確診提供病原學(xué)證據(jù)唯一手段，目前實驗室診斷主要依賴抗酸染色和TB培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法，但抗酸涂片檢查存在檢出率低、無法區(qū)分結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌等問題，TB培養(yǎng)亦存在污染率高、檢測時間長等缺點，致使部分結(jié)核患者無法及時準(zhǔn)確診斷。世界衛(wèi)生組織向全球結(jié)核病防治領(lǐng)域推薦利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)（GeneXpert Mtb/RIF，以下簡稱GeneXpert）分子生物學(xué)檢測方法，既能檢測結(jié)核病又能檢測耐利福平結(jié)核病，且能在＜2.5h獲得結(jié)果，明顯縮短結(jié)核病的檢測時間［1-3］。本文探討GeneXpert系統(tǒng)在肺結(jié)核中的診斷價值。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2014年7月至2015年12月本院感染科和呼吸科收治的疑診結(jié)核患者408例，其中男288例，女120例；年齡9～88歲，平均年齡（43.3±19.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：咳嗽、咯痰時間＞2周，因呼吸道癥狀接受檢查的初治結(jié)核病疑似患者，排除抗結(jié)核藥物治療患者。根據(jù)《WS 288-2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》分為4類，分別為確診病例、臨床診斷病例、非結(jié)核病病例；在患者出院時仍無法明確診斷歸為無法診斷病例。

1.2儀器與試劑 GeneXpert檢測系統(tǒng)和檢測試劑盒購自美國Cepheid公司；酸性改良羅氏培養(yǎng)基由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司提供；抗酸染色液試劑由珠海貝索生物有限公司提供。

1.3方法 （1）抗酸涂片鏡檢：所有患者均取隨機痰標(biāo)本進行涂片、抗酸染色、鏡檢，痰涂片檢查按《痰涂片鏡檢實驗室質(zhì)量保證手冊》操作。（2）結(jié)核培養(yǎng)：每個患者痰涂片后剩余的樣本取1ml用40g/L的NaOH處理后接種至酸性羅氏培養(yǎng)基上，35℃孵育，每周觀察TB生長情況，連續(xù)觀察8周，無TB生長為培養(yǎng)陰性。（3）結(jié)核桿菌藥敏試驗：對結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性者，挑取培養(yǎng)基上3周新鮮的菌落，采用比例法做藥敏試驗。菌液最終接種量為10-4mg和10-6mg，利福平在培養(yǎng)基內(nèi)的最終濃度為40μg/ml。藥敏試驗按《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》嚴(yán)格操作。（4）GeneXpea 系統(tǒng)檢驗：每個患者痰涂片后剩余的樣本取1ml進行 GeneXpert 系統(tǒng)檢驗，2.5h后觀察檢測結(jié)果。

1.4結(jié)果判定 （1）抗酸涂片染色鏡檢：根據(jù)AFB結(jié)果分為陰性、≤9條/300視野、+、++、+++、++++。（2）結(jié)核培養(yǎng)：根據(jù)羅氏培養(yǎng)基斜面菌落數(shù)占斜面面積多少，分為陰性、+、++、+++、++++。（3）GeneXpert系統(tǒng)檢測：MTB數(shù)量以MTB DNA拷貝的高低分為未檢出、極低、低、中、高5個量級。利福平檢測結(jié)果為敏感或耐藥。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)采用配對χ2檢驗、等級相關(guān)檢驗和kappa檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1患者診斷情況 408例患者確診結(jié)核病105例（25.7%），臨床診斷結(jié)核病132例（32.4%），162例（39.7%）排除結(jié)核病，9例（2.2%）患者無法明確診斷。2.2 實驗室檢測結(jié)果 105例確診結(jié)核病患者的痰樣本中結(jié)核涂片和培養(yǎng)同時陽性89例，89例患者GeneXpert均陽性；結(jié)核培養(yǎng)陽性涂片陰性患者15例，15例患者GeneXpert均陽性；涂片陽性培養(yǎng)陰性1例，1例患者GeneXpert陽性；臨床診斷為肺結(jié)核的132例患者結(jié)核涂片、培養(yǎng)均陰性，GeneXpert陽性2例。162例臨床排除為結(jié)核的患者中有3例抗酸涂片和結(jié)核培養(yǎng)陽性，GeneXpert為陰性，細菌鑒定證實這三株細菌均為非結(jié)核分支桿菌。

2.3三種實驗室結(jié)果比較 408例患者以結(jié)核確診病例為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核患者105例，抗酸涂片鏡檢結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為85.7%、99.0%、96.7%、95.2%；結(jié)核培養(yǎng)結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為99.0%、99.0%、97.2%、99.7%；GeneXpert結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為100%、100%、100%、100%。GeneXpert的敏感性100%高于抗酸涂片的85.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GeneXpe的敏感100%高于結(jié)核培養(yǎng)的99.0%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以結(jié)核確診病例+臨床診斷病例為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核患者237例，抗酸涂片鏡檢結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為38.0%、98.2%、96.8%、53.3%；結(jié)核培養(yǎng)結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為43.9%、98.2%、97.2%、55.8%；GeneXpert結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為45.1%、100%、100%、56.8%。GeneXpert的敏感性44.9%高于抗酸涂片的38.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GeneXpert的敏感性45.1%高于結(jié)核培養(yǎng)44.9%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4GeneXpert量級與抗酸涂片鏡檢結(jié)果等級的比較 將107例GeneXpert陽性結(jié)果標(biāo)本與其相對應(yīng)的鏡檢結(jié)果進行Spearnman等級相關(guān)比較，可知涂片結(jié)果等級與GeneXpert 結(jié)果量級呈現(xiàn)一定的正相關(guān)趨勢（r=0.672，P＜0.05）。有17例涂片鏡檢結(jié)果為陰性而GeneXpert 量級為極低11例、低6例；6例鏡檢結(jié)果為高倍鏡視野＜9條/300個時，GeneXpert相對應(yīng)的量級出現(xiàn)4例中、1例高2個量級；27例鏡檢結(jié)果為+時，GeneXpert相對應(yīng)的量級出現(xiàn)13例低、14例中2個量級；40例鏡檢結(jié)果為++時，GeneXpert相對應(yīng)的量級出現(xiàn)28例中、12例高2個量級；15例鏡檢結(jié)果為+++時，GeneXpert相對應(yīng)的量級出現(xiàn)15例中1個量級；2例鏡檢結(jié)果為++++時，GeneXpert相對應(yīng)的量級出現(xiàn)2例高1個量級。見圖1。

圖1　GeneXpert檢驗結(jié)果量級與抗酸涂片鏡檢量級的相互關(guān)系

2.5利福平耐藥的比較 GeneXpert檢測陽性的105例標(biāo)本中，93例利福平敏感，12例利福平耐藥；與培養(yǎng)后的藥敏結(jié)果比較，其中92例敏感標(biāo)本與金標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)藥敏方法完全符合，1例由于培養(yǎng)陰性未做藥敏而無法比較，12例利福平耐藥的標(biāo)本，其中11例與傳統(tǒng)藥敏方法比較完全符合，另外1例GeneXpert結(jié)果為耐藥而傳統(tǒng)方法為敏感，一致率為99.0%（103/104），kappa值0.951＞0.75，表明2種方法檢測利福平藥敏結(jié)果具有較好的一致性。

3　討論

GeneXpert使用了半定量的巢式熒光定量PCR，在理論上GeneXpert能獲得較高的檢測靈敏度［4］。在本資料中，以臨床確診為金標(biāo)準(zhǔn)時，105例患者中GeneXpert系統(tǒng)可檢測出100%的陽性，其敏感度高于抗酸涂片鏡檢85.7%（P＜0.05），且特異性也達100%，高于抗酸涂片鏡檢99.0%；在以臨床確診+臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時，237例病例中GeneXpert系統(tǒng)可檢測出45.1%的陽性結(jié)果，其敏感度高于抗酸涂片鏡檢的38.0%（P＜0.05），且特異性也達到100%，高于抗酸涂片鏡檢98.2%。與結(jié)核培養(yǎng)比較，以臨床確診為金標(biāo)準(zhǔn)時，105例比較中GeneXpert系統(tǒng)可檢測出100%的陽性，其敏感度高于結(jié)核培養(yǎng)的99.0%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在以臨床確診+臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)時，GeneXpert系統(tǒng)可檢測出45.1%的陽性結(jié)果高于結(jié)核培養(yǎng)的43.9%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明GeneXpert檢測結(jié)核的敏感性高于抗酸涂片鏡檢，等同于甚至略高于結(jié)核培養(yǎng)。在162例排除為結(jié)核患者的標(biāo)本中有3例患者結(jié)核培養(yǎng)和結(jié)核涂片均陽性，GeneXpert為陰性，菌株經(jīng)鑒定為非結(jié)核分支桿菌。表明抗酸涂片無法區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌，結(jié)核培養(yǎng)陽性需要經(jīng)細菌鑒定才能明確。碰到抗酸涂片陽性標(biāo)本而GeneXpert陰性時應(yīng)懷疑非結(jié)核分支桿菌感染。

本資料中GeneXpert量級與抗酸鏡檢呈現(xiàn)正相關(guān)，但是相關(guān)關(guān)系一般，相關(guān)系數(shù)為0.672。當(dāng)抗酸染色結(jié)果為陰性時，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)也能檢測出陽性結(jié)果，甚至當(dāng)抗酸涂片鏡檢結(jié)果為高倍鏡視野＜9條/300個時，GeneXpert相對應(yīng)的量級可出現(xiàn)低、中、高三個量級?？赡芤驗镚eneXpert選取較多標(biāo)本量且經(jīng)預(yù)處理使菌量均勻分布，而抗酸涂片鏡檢制片時隨機挑取部分少量標(biāo)本導(dǎo)致涂片的假陰性或涂片局部菌量分布不均。

GeneXpert系統(tǒng)能快速檢測出利福平耐藥株，而MTB培養(yǎng)和抗酸涂片鏡檢無法獲得其耐藥性的信息。GeneXpert針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計引物、探針（A、B、C、D、E），檢測是否發(fā)生突變，進而診斷患者是否出現(xiàn)利福平耐藥［5-6］。本資料GeneXpert檢測耐利福平突變位點與傳統(tǒng)的結(jié)核藥敏的比例法一致性為99.0%（103/104），kappa值0.951＞0.75，表明兩種方法檢測利福平藥敏結(jié)果具有較好的一致性。但傳統(tǒng)的結(jié)核培養(yǎng)和結(jié)核藥敏耗時近8周，而GeneXpea系統(tǒng)可在2 h快速完成對利福平的敏感檢測，有利于結(jié)核病的早期治療。

綜上所述，GeneXpert 系統(tǒng)檢測結(jié)核具有快速簡單、操作自動化、敏感性、特異性高、結(jié)果準(zhǔn)確、可半定量顯示標(biāo)本帶菌量、可檢測利福平藥敏等優(yōu)點，非常適合我國結(jié)核病的快速診斷和早期治療。

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Objective To evaluate the diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF system in patients with pulmonary tuberculosis. Methods Total of 408 cases of sputum samples from the pulmonary tuberculosis and suspected pulmonary tuberculosis patients were collected，and tested by acid fast staining（AFB），Mycobacterium tuberculosis（MTB）culture and GeneXpert MTB/RIF system，the Results were compared. Results Clinical confi rmed diagnosis as gold standard，the susceptibility of acid fast staining 、TB culture and GeneXpert MTB/RIF was 85.7%%、99.0%、100% respectively；Clinical confi rmed diagnosis+Clinical diagnosis as gold standard，the sensitive was 38.0%、43.9%、45.1% respectively；the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF was higher than acid fast staining（P＜0.05），equivalent to tuberculosis culture；GeneXpert MTB/RIF bacterial content gradient was positively correlated with acid fast staining（r=0.672）；GeneXpert determination of rifampin resistance and the proportion of drug sensitivity with good correlation（kappa=0.951）. Conclusion GeneXpertMTB/RIF system has important value in the diagnosis，assessment of curative effect and prognosis of pulmonary tuberculosis.

Pulmonary tuberculosis GeneXpertMTB/RIF Acid fast staining Mycobacterium tuberculosis culture

323000 浙江省麗水市人民醫(yī)院