姚曉霞 田文慧 李飛艷 袁 強(qiáng)?
MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)
姚曉霞田文慧李飛艷袁強(qiáng)?
目的 探討建立MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的方法。方法 取MRL/lpr狼瘡小鼠隨機(jī)分為兩組,模型組給予長(zhǎng)時(shí)間灌胃附子、肉桂、干姜(1∶1∶1)水煎液,空白對(duì)照組灌胃同次數(shù)等量生理鹽水,造模結(jié)束后,檢測(cè)MRL/lpr狼瘡小鼠血清中T3、T4、E2、T、COR的變化。結(jié)果 造模結(jié)束后,模型組MRL/lpr狼瘡小鼠血清中T3、T4、E2、COR的含量均高于空白對(duì)照組,T的含量低于空白對(duì)照組,出現(xiàn)中醫(yī)虛熱證的臨床表現(xiàn)。結(jié)論 利用溫?zé)嶂兴幩鍎┕辔冈炷?fù)制MRL/lpr狼瘡虛熱證小鼠模型的方法是可行的。
虛熱證 MRL/lpr狼瘡小鼠 模型
虛熱證動(dòng)物模型是中醫(yī)證候動(dòng)物模型中研究較多的一種。虛熱證以陰液虧虛,虛熱內(nèi)生為主[1]。梁月華等[2]根據(jù)中醫(yī)理論探索給大鼠長(zhǎng)期大量服用溫?zé)崴帍?fù)制虛熱證動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行大量基礎(chǔ)研究[2-4],結(jié)果顯示溫?zé)崴幱刑岣呓桓猩窠?jīng)-腎上腺系統(tǒng)機(jī)能的作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種全身性自身免疫性疾病,活動(dòng)期約99%的患者在病程過(guò)程中出現(xiàn)各種熱型的發(fā)熱,其臨床表現(xiàn)與伏氣溫病“邪伏陰分、陰虛化熱”的病機(jī)相合,屬陰虛型發(fā)熱。2014年4月至5月作者在MRL/lpr狼瘡小鼠陰虛發(fā)熱的基礎(chǔ)上采用溫?zé)嶂兴幵炷?,探討虛熱證對(duì)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。
1.1動(dòng)物 清潔級(jí)雌性MRL/lpr小鼠20只,體重27~31g,購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室。
1.2藥品與試劑 附子,肉桂,干姜均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋捷民教授鑒定。小鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)ELISA試劑盒,小鼠甲狀腺素(T4)ELISA試劑盒,小鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒,小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒,大鼠皮質(zhì)醇(COR)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司。
1.3儀器 80-2B型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;Power wave 340型酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek儀器有限公司;HH-S型水浴鍋,鞏義市英峪予華儀器廠;DL-1型電子體溫計(jì),江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。
1.4方法 (1)造模方法:將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型組,每組各10只,適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,均無(wú)異常表現(xiàn)即納入實(shí)驗(yàn)。模型組中附子、肉桂、干姜以1∶1∶1比例,常規(guī)制成200%濃度水煎劑(附子先煎),灌胃1.6ml/(100g·d),連續(xù)給藥28d。空白對(duì)照組灌胃同次數(shù)等量生理鹽水。(2)指標(biāo)檢測(cè)方法:體溫為肛溫。飲水和進(jìn)食量以組為單位,計(jì)量給飼料和飲水,過(guò)若干天后減去剩余量,再平均為這段時(shí)間本組每只動(dòng)物每天飲水量和進(jìn)食量。于造模結(jié)束后采眼眶血0.3ml,分離血清,用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中T3、T4、E2、T、COR。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以(x±s)表示,采用方差分析及t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,空白對(duì)照組整體外觀良好,毛色干凈,反應(yīng)靈敏。模型組MRL/lpr狼瘡小鼠脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重,較狂躁,灌胃時(shí)掙扎明顯,腋下淋巴結(jié)腫大較空白組明顯,受激排便較空白對(duì)照組增多,且舌象較空白對(duì)照組偏紅。
2.2MRL/lpr狼瘡小鼠體重、體溫的變化 空白對(duì)照組和模型組MRL/lpr狼瘡小鼠在實(shí)驗(yàn)前體重和體溫?zé)o明顯差異,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,空白對(duì)照組體重增長(zhǎng)較快,模型組體重下降,空白對(duì)照組小鼠體重明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);造模結(jié)束時(shí),模型組體溫明顯高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P<0.01)。見(jiàn)表1、表2。
中醫(yī)證候動(dòng)物模型是現(xiàn)代中醫(yī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的代表,其在受試動(dòng)物身上體現(xiàn)中醫(yī)理論和證候特點(diǎn)。虛熱證是中醫(yī)證候動(dòng)物模型中研究較多的一種,關(guān)于虛熱證造模的方法研究較多,主要分為中藥水煎劑灌胃造模、注射致熱物質(zhì)造模、形勞傷陰造模、氣候造模等。本實(shí)驗(yàn)選用的中藥水煎劑灌胃造模,是目前較常用的中醫(yī)虛熱證造模方法,造模后動(dòng)物不僅有熱證表現(xiàn),且有一定的虛證表現(xiàn)。通過(guò)多次溫?zé)崴帍?fù)方進(jìn)行虛熱證預(yù)試造模后,本實(shí)驗(yàn)最終選用陳氏復(fù)方,采用附子、肉桂、干姜水煎液按1∶1∶1比例灌胃給藥,確定灌胃給藥劑量及造模時(shí)間。
造模結(jié)束后,驗(yàn)證虛熱證模型是否成功是很重要的。在中醫(yī)辨證論治的基礎(chǔ)上,從不同層面不同角度對(duì)虛熱證模型進(jìn)行探討,才能準(zhǔn)確的反映虛熱證的本質(zhì)??陀^上的中醫(yī)指標(biāo)主要有毛色、外觀、大小便、舌象、體溫、體重、飲水量、進(jìn)食量等,這些指標(biāo)體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀,為虛熱證提供了一定的依據(jù),但其不足之處是在觀測(cè)過(guò)程中容易受人為因素和實(shí)驗(yàn)條件的影響。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)血液生化指標(biāo)T3、T4、E2、T、COR的檢測(cè),分析相關(guān)指標(biāo)的含量變化,進(jìn)一步說(shuō)明該造模方法的可靠性。
虛熱證是在“虛證”的基礎(chǔ)上,又有“熱證”的表現(xiàn),主要表現(xiàn)為形體消瘦、口燥咽干、發(fā)熱、舌紅等癥狀[5]。造模結(jié)束時(shí),與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠長(zhǎng)期大量灌胃溫?zé)嶂兴幐阶印⒏山?、肉桂后出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重,較狂躁,舌象偏紅,體重降低,飲水量增加,進(jìn)食量減少等現(xiàn)象。此外,模型組體溫較空白對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以上結(jié)果均與虛熱證的臨床表現(xiàn)相符。
有研究表明[6],虛熱證時(shí)內(nèi)分泌變化以甲狀腺功能變化為主,主要表現(xiàn)為甲狀腺功能亢進(jìn),并提示血清T3、T4含量的變化可以作為中醫(yī)虛熱證的有效指標(biāo)。甲狀腺激素T3、T4主要調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝,能促進(jìn)體內(nèi)絕大多數(shù)組織細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝氧化,提高耗氧率,增加產(chǎn)熱,使基礎(chǔ)代謝增高,體溫升高。陳群等[7]臨床觀察血清甲狀腺激素與中醫(yī)實(shí)熱證、虛熱證的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)虛熱證組患者的T3、T4水平均明顯高于正常對(duì)照組。徐志偉等[8]研究發(fā)現(xiàn),虛熱證造模大鼠血清中T3、T4水平顯著升高。崔淑蘭等[9]研究結(jié)果表明,模型對(duì)照組大鼠血漿T3、T4明顯高于空白對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模結(jié)束后,模型組MRL/ lpr狼瘡小鼠血清中T3、T4的含量均高于空白對(duì)照組,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中E2、COR含量升高,T含量降低。模型組小鼠COR、E2升高,T降低,這主要表現(xiàn)為下丘腦-垂體-性腺軸或下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸失調(diào)致使E2在體內(nèi)增多,通過(guò)負(fù)反饋抑制腺垂體的分泌功能,從而影響下丘腦-垂體-性腺軸或下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能,致使T相對(duì)不足[10]。
綜上所述,MRL/lpr狼瘡小鼠長(zhǎng)期大量灌胃溫?zé)嶂兴幐阶?、干姜和肉桂,可出現(xiàn)與中醫(yī)虛熱證患者相一致的表現(xiàn)癥狀,表明該方法可以成功的復(fù)制MRL/ lpr狼瘡虛熱證小鼠模型。
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Objectives This project established defi ciency-heat syndrome model in MRL/lpr lupus mouse. Methods MRL/lpr lupus mouse were randomly divided into two groups:in model group the mouse were given the decoction of three Chinese medicines,aconite,cinnamon and dried ginger by gavage for a long time,and in blank control group the mouse were given the same times and equivalent normal saline by gavage.Then detected the change of T3、T4、E2、T、COR in MRL/lpr lupus mouse serum. Results After modeling,T3、T4、E2、COR of model group mouse wwere higher than blank control group,and T of model group mouse was lower than blank control group. The MRL/lpr lupus mouse had the clinical manifestations of defi ciency-heat syndrome. Conclusions Using warm-heat TCM decoction to establish the defi ciency-heat syndrome model of MRL/ lpr lupus mouse is feasible.
Defi ciency-heat syndrome MRL/lpr lupus mouse Model
國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173570)
310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院*通信作者
表1造模藥物對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠體重的影響[ g,(x±s)]
注:與空白對(duì)照組比較,#P<0.01
組別n0d7d14d21d28d模型組1029.2±1.5729.6±2.3128.9±1.9127.7±1.79#27.6±1.63#空白對(duì)照組1029.3±1.6029.5±1.7530.0±2.8831.3±1.8332.5±1.56
表2造模藥物對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠體溫的影響[℃,(x±s)]
注:與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01
組別n0d7d14d21d28d模型組1036.6±0.9837.6±0.6038.1±0.55*38.0±0.46* 38.5±0.56#空白對(duì)照組1036.3±0.8036.9±0.9536.3±0.3737.4±0.4237.3±0.43
2.3MRL/lpr狼瘡小鼠進(jìn)食量、飲水量的變化 實(shí)驗(yàn)前MRL/lpr狼瘡小鼠進(jìn)食量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白對(duì)照組和模型組均有減少趨勢(shì),且模型組下降明顯。實(shí)驗(yàn)前MRL/lpr狼瘡小鼠飲水量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組飲水量明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.4造模后MRL/lpr狼瘡小鼠血清T3、T4含量的變化 模型組MRL/lpr狼瘡小鼠T3、T4含量均明顯高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。
表3造模藥物對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠血清T3、T4含量的變化(x±s)
注:與空白對(duì)照組比較,#P<0.01
組別nT3(pmol/L)T4(μg/L)模型組106.53±2.57#86.70±23.41#空白對(duì)照組104.82±1.2358.29±11.40
2.5造模后MRL/lpr狼瘡小鼠血清E2、T、COR含量的變化 與空白對(duì)照組比較,模型組MRL/lpr狼瘡小鼠血清E2含量升高,T含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),COR的含量升高,但與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。
表4造模藥物對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠血清E2、T、COR含量的變化(x±s)
注:與空白對(duì)照組比較,#P<0.01
組別nE2(μg/L)T(nmol/L)COR(μg/L)模型組1072.87±20.54#99.65±23.17#99.78±15.59空白對(duì)照組1053.53±15.36125.52±17.5089.72±17.53