劉翠華　何金洋

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405）

牽牛子不同提取物對(duì)小鼠急性毒性的比較研究

劉翠華何金洋

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405）

目的：探討中藥牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物對(duì)小鼠急性毒性。方法：制備牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物，采用急性毒性替代法-上下法進(jìn)行毒性比較。結(jié)果：牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物均不同程度表現(xiàn)出了急性毒性癥狀，按生藥量計(jì)算的半數(shù)致死量（LD50）分別是455g/kg，32g/kg，9g/kg。結(jié)論：牽牛子不同提取物對(duì)小鼠的急性毒性強(qiáng)度為正丁醇部位＞牽牛子氯仿部位＞石油醚部位。

牽牛子；不同提取物；小鼠；急性毒性

牽牛子（學(xué)名：Pharbitisnil （Linn.） Choisy）為旋花科植物裂葉牽牛（Pharbitisnil L. Choisy） 或圓葉牽牛的干燥成熟種子，又名黑丑、白丑、二丑等。性寒，味苦；有毒，具有瀉水、消痰滌飲、殺蟲攻積等功效［1］。迄今為止，有關(guān)學(xué)者對(duì)牽牛的化學(xué)成分和藥理作用等方面進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)牽牛子主要含有牽牛苷、生物堿類、糖類及蛋白質(zhì)、甾醇類化合物、色素及脂肪油等［2-4］；陳麗娜等［5］還發(fā)現(xiàn)了蒽醌、酚酸和二萜類有效成分。

牽牛子具有瀉下及利尿，抑菌、興奮子宮、抗腫瘤、抗高血脂等藥理作用［6-11］。王燕等［12］報(bào)道牽牛子提取物對(duì)朱砂葉螨具有生物活性。李佳桓等［13］發(fā)現(xiàn)牽牛子酒提取物有對(duì)抗腫瘤抗轉(zhuǎn)移作用。

現(xiàn)代對(duì)中藥的毒性分級(jí)主要以半數(shù)致死量（LD50）為依據(jù)，分為大毒、有毒、小毒和無(wú)毒［14］。WHO頒布的化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為劇毒、高度、中毒、低毒和微毒［15］。牽牛子生用偏用于逐水消腫、殺蟲。炮制后可降低毒性、緩和藥性、免傷正氣。

然而有關(guān)牽牛子提取物急性毒性和毒性癥狀研究報(bào)道卻很少。前期筆者已篩選出牽牛子抗病毒中藥提取物有效部位，本研究以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用急性毒性替代法-上下法，測(cè)得牽牛子提取物的LD50值及95%可信區(qū)間，同時(shí)觀察牽牛子不同提取物灌胃后的急性毒性反應(yīng)，對(duì)牽牛子不同提取物進(jìn)行毒性強(qiáng)度比較，進(jìn)而為開展?fàn)颗Ｗ觼喖毙浴⒙远拘匝芯康於ɑA(chǔ)，這是后期抗病毒中藥復(fù)方研究必由之路。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)藥材

中藥材牽牛子購(gòu)自廣州杏林春藥房（20140625）。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均（廣州化學(xué)試劑廠）；3%苦味酸溶液（臺(tái)山市眾城化工有限公司）；羧甲基纖維素鈉溶液（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；0.9%生理鹽水（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

KQ-501E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH6-型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、R100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；DLSB-30低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)盛儀器有限公司）；TC-15套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）。

2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小白鼠，雌性30只，雄性15只，體重18～22g，共35只，全部購(gòu)于廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用標(biāo)準(zhǔn)化籠子喂養(yǎng)，隨機(jī)分組，每籠根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求飼養(yǎng)3～5只以適應(yīng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣州中醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的審核［實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0001粵監(jiān)證字00116824，嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

3　實(shí)驗(yàn)方法

3.1供試樣品的制備

中藥材粉碎，以75%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并乙醇提取液，真空抽濾，減壓回收乙醇提取物，并揮發(fā)盡殘余乙醇，得乙醇提取物浸膏。乙醇提取物用適當(dāng)比例按有機(jī)溶劑極性大?。菏兔?、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，先后依次進(jìn)行萃取，萃取至無(wú)色，分別減壓回收萃取溶液，得所需中藥材有效部位浸膏：石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位。

最終有效部位的萃取率分別是：牽牛子的石油醚部位0.83%，牽牛子氯仿部位0.99%，牽牛子正丁醇部位12%。

取適量牽牛子不同提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液作為溶劑超聲30min，配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

3.2預(yù)實(shí)驗(yàn)

牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的小鼠急性毒性參照OECD TG25 UDP限度試驗(yàn)［16］進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

取雌性昆明小鼠3只，分別給與2000mg/kg劑量的牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物。給與牽牛子氯仿、正丁醇提取物小鼠死亡，可開始主試驗(yàn)，給與牽牛子石油醚提取物的昆明小鼠48h內(nèi)未見(jiàn)死亡，順序?qū)?000mg/kg劑量牽牛子石油醚提取物給與2只小鼠，觀察48h后3只均存活，可預(yù)測(cè)牽牛子石油醚提取物L(fēng)D50≥2000mg/kg。再次取雌性昆明小鼠1只，分別給與5000mg/kg劑量的牽牛子石油醚提取物，小鼠12h內(nèi)死亡，解剖可見(jiàn)臟器有顏色改變，失禁，大便稀軟，可預(yù)測(cè)牽牛子石油醚提取物的LD50≤5000mg/kg，即牽牛子石油醚提取物的LD50在2000mg/kg到5000mg/kg之間。

3.3主試驗(yàn)（正式試驗(yàn)）

牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的急性毒性參照OECD TG25 UDP［16］進(jìn)行。

全部使用雌性昆明小鼠，默認(rèn)劑量級(jí)數(shù)因子3.2（斜率為2.0）。牽牛子氯仿、正丁醇提取物按劑量1.75、5.5、17.5、55、 175、550、2000mg/kg貫序進(jìn)行，牽牛子石油醚提取物按劑量1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）貫序進(jìn)行，三種提取物起始劑量均從175 mg/kg開始。每次按順序給藥1只老鼠，觀察48h，若存活，則提高一級(jí)劑量，再次觀察48h；若死亡，則降低一級(jí)劑量，每次給與劑量后可將動(dòng)物結(jié)局輸入AOT425StatPgm程序［16］中，軟件自動(dòng)給出下次給與劑量大小，直到出現(xiàn)終止試驗(yàn)的劑量，軟件將估算出LD50值和其95%的可信區(qū)間。試驗(yàn)期間，每次給藥后，及時(shí)觀察記錄小鼠的毒性表現(xiàn)，包括呼吸、運(yùn)動(dòng)功能、毛發(fā)、對(duì)外反應(yīng)，瞳孔大小，分泌物和排泄物以及小鼠的死亡等情況。

4　結(jié)果

牽牛子石油醚提取物給藥劑量5000mg/kg后觀察，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)雜亂，嗜睡，瞇眼，唾液分泌較多，眼內(nèi)濕潤(rùn)，有清稀分泌物，口周毛潮濕，籠內(nèi)有嘔吐物，肛門周圍毛潮濕，糞便稀且呈褐綠色，12h內(nèi)死亡。該毒性表現(xiàn)可能提示牽牛子石油醚提取物在此劑量時(shí)對(duì)睡眠中樞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、感官、神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng)系統(tǒng)，胃腸動(dòng)力、腎臟均有毒性作用。解剖未見(jiàn)內(nèi)臟顏色，大小變化，胃內(nèi)容物為油黃色，是溶劑玉米油顏色。給藥劑量1750mg/kg，給藥后2h內(nèi)，毛發(fā)稍顯毛糙，瞇眼，稍困倦，肛門周圍潮濕，觸摸有反應(yīng)，有驚跳反射，在存活/死亡之間轉(zhuǎn)換。175 mg/kg 、550 mg/kg劑量，除給藥第一天進(jìn)食稍微減少，存活14天以上，肉眼未見(jiàn)明顯毒性表現(xiàn)。該提取物動(dòng)物結(jié)局和LD50值，如表1所示。

牽牛子氯仿提取物給藥劑量2000mg/kg，給藥后，喘息，困倦，俯臥，嘔吐，后出現(xiàn)躁動(dòng)，行動(dòng)時(shí)顫抖，水樣便，1h內(nèi)死亡。該毒性表現(xiàn)可能提示牽牛子氯仿提取物在此劑量時(shí)對(duì)呼吸中樞，睡眠中樞，自主神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肌肉有毒性作用。550 mg/kg劑量，給藥后，反應(yīng)慢。俯臥，困倦，籠內(nèi)大便濕潤(rùn)，前肢抽搐死亡，在12h內(nèi)死亡，該毒性表現(xiàn)可能提示牽牛子氯仿提取物仍對(duì)睡眠中樞，自主神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肌肉有毒性作用。解剖未見(jiàn)內(nèi)臟顏色，大小變化，內(nèi)臟較濕潤(rùn)，胃內(nèi)容物為油黃色，是溶劑玉米油顏色。175 mg/kg劑量，糞便稍濕潤(rùn)，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食進(jìn)水正常，未見(jiàn)明顯毒性癥狀。該提取物動(dòng)物結(jié)局和LD50值，如表1所示。

牽牛子正丁醇提取物給藥劑量2000mg/kg，給藥后，反應(yīng)遲鈍，瞇眼困倦，腹式呼吸明顯，大便較濕潤(rùn)，漸漸無(wú)力，動(dòng)作不協(xié)調(diào)，失禁，12h內(nèi)死亡。該毒性表現(xiàn)牽牛子正丁醇提取物在此劑量可能對(duì)睡眠中樞，呼吸中樞，感官系統(tǒng)、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)乃至胃腸道系統(tǒng)有毒性作用。解剖可見(jiàn)胃部飽脹，內(nèi)臟稍濕潤(rùn)偏紅，肝臟、胃底部，小腸顏色偏深紅，提示牽牛子正丁醇提取物對(duì)整個(gè)內(nèi)臟系統(tǒng)均有毒性。550 mg/kg和175 mg/kg，給藥后幾天內(nèi)，飲食量相對(duì)減少，困倦，反應(yīng)稍慢，毛發(fā)稍無(wú)光澤，經(jīng)過(guò)14天觀察后，反應(yīng)靈敏，肉眼未見(jiàn)明顯的包括呼吸、運(yùn)動(dòng)功能、毛發(fā)、對(duì)外反應(yīng)，瞳孔大小，分泌物和排泄物等表現(xiàn)異常。該提取物動(dòng)物結(jié)局和LD50值，如表1所示。

表1　牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的急性毒性上下法（UDP）試驗(yàn)結(jié)果

5　討論

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明牽牛子對(duì)人體有毒，牽牛子服用不當(dāng)，出現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹瀉、大便有粘液和血、甚至昏迷等。急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物安全的第一環(huán)節(jié)，獲取藥物毒性資料能更好指導(dǎo)下一步的實(shí)驗(yàn)。

本文對(duì)牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物進(jìn)行急性毒性比較研究，發(fā)現(xiàn)灌胃牽牛子不同提取物后均有一定急性毒性癥狀，以生藥計(jì)，牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的按生藥量計(jì)算的半數(shù)致死量分別是455g/kg，32g/kg，9g/kg，表明3種提取物對(duì)小鼠的急性毒性強(qiáng)度：牽牛子氯仿部位＞牽牛子正丁醇部位＞牽牛子石油醚部位。對(duì)牽牛子不同提取物進(jìn)行急性毒性強(qiáng)度比較，進(jìn)而為開展?fàn)颗Ｗ犹崛∥锏膩喖毙浴⒙远拘匝芯康於ɑA(chǔ)，為藥用提取物的的開發(fā)提供安全性評(píng)價(jià)基礎(chǔ)，這是后期抗病毒中藥復(fù)方研究必由之路。

［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典，第一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］ 黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1994.

［3］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（下冊(cè)）［M］.上海：上海人民出版社，1977：1626.

［4］ 川崎敏男，宮原一元，水谷捷子，等.關(guān)于牽牛子的糖類成分［J］.生物學(xué)雜志，1965，19（1）：1.

［5］ 陳立娜，李萍.牽牛子化學(xué)成分研究（Ⅱ）［J］.林產(chǎn)業(yè)化學(xué)與工業(yè)2007，27（6）：105-108.

［6］ 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草［M］.上海.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：1599-1565.

［7］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上海人民出版社，1977：1626-1628.

［8］ 余東坡，王蘭菊，司芳，等.21種中草藥醇提物抑菌活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2008，36（3）：1086-1087.

［9］ 余黎，洪敏，朱荃.牽牛子效應(yīng)成分對(duì)動(dòng)物離體子宮的興奮作用研究［J］.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2004，4（7）：1883-1884.

［10］ 王三虎.燥濕相混致癌論［J］.柳州醫(yī)學(xué)，2006，19（1）：24-26.

［11］ 雷建華.恒春降脂丸治療高脂血癥60例［J］.中國(guó)民間療法，2007，15（10）：27-28

［12］ 王燕，師光祿.牽牛子提取物對(duì)朱砂葉螨的生物活性［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45（3）：79-84.

［13］ 李佳桓，杜鋼軍，劉偉杰，等.牽牛子酒提取物對(duì)Lewis肺癌的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移機(jī)制研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2014，39（5）：879-883.

［14］ 李永，段瓊輝.中藥的毒性研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2008，20（5）：65-67.

［15］ 翁維良.中藥臨床藥理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：205.

［16］ OECD.OECD guideline for the testing of chemicals guideline 425 acute oral toxicity-up-and-down-procedure［S］.Paris：OECD，2001：1-26.

Comparative study on mice's acute toxicity of different composition in Prepared Pharbitis nil

Objective： Objective to study of the acute toxicity of Petroleum etherextract， chloroform extract， N-butanol extracts of the traditional Chinese Pharbitis nil choisy. Methods： Prepared Pharbitis nil choisy Petroleum ether extract， chloroform extract， N-butanol extract. To compare the acute toxicity of different components in accordance with up and down procedure（UDP） of alternative methods for acute oral toxicity testing. Results： Petroleum ether extract， chloroform extract and N-butanol extract of Pharbitis nil choisy showed obvious symptoms of acute toxicity in different extent. According to calculation of crude drugs，median lethal dose （LD50）respectively of three kinds of extracts was 455 g/kg， 32 g/kg， 9 g/kg. Conclusion ：the acute toxicity of three kinds of extracts of Pharbitis nil choisy in mice was chloroform extract ＞N-butanol extract＞Petroleum ether extract.

Pharbitis nil choisy； different extracts； mice； acute toxicity

R282；R285.5

A

1008-1151（2016）03-0073-03

2016-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（8117325，81573861）。

劉翠華（1988-），女，廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)治療艾滋病。

何金洋（1975-），男，廣東廣州人，廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所研究員，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)治療艾滋病。