邸　倩, 邱明才, 張　鑫, 楊　靜

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，太原　030001； 2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科)

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吡格列酮對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響

邸倩1, 邱明才2, 張?chǎng)?, 楊靜1

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，太原030001；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科)

目的探討不同劑量吡格列酮(PIO)對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響。 方法大鼠尾靜脈1次注射STZ(45 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，28只造模成功的大鼠被隨機(jī)分為PIO低劑量組[4 mg/(kg·d),n=10]、PIO高劑量組[20 mg/(kg·d),n=10]和模型組(n=8)。10只未造模大鼠為對(duì)照組。PIO治療組每日吡格列酮混懸液灌胃服用干預(yù)16周，股動(dòng)脈放血方法處死大鼠，取左側(cè)脛骨近端2/3制作大鼠不脫鈣骨切片，測(cè)量骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組及各PIO治療組骨小梁體積占全部骨組織體積的百分比(TBV/TTV)、平均骨小梁板厚度(Tb.Th)、平均骨小梁接點(diǎn)數(shù)(Tb.N)、四環(huán)素單標(biāo)表面(sLS/S)、四環(huán)素雙標(biāo)表面(dLS/S)、骨礦化表面(MS/BS)、組織水平的骨形成速率(Svf)、骨形成表面(O S/BS)均不同程度的減少(P<0.01)，平均骨小梁板間隙(Tb.Sp)均不同程度的增加(P<0.01)。與模型組相比，低劑量組各參數(shù)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組TBV/TTV、dLS/S、Svf減少(P<0.05)，Tb.Th、Tb.N、sLS/S、MS/BS、OS/BS減少(P<0.01)，Tb.Sp增加(P<0.01)。結(jié)論低劑量PIO[4 mg/(kg·d)]對(duì)于糖尿病大鼠骨計(jì)量沒有影響，高劑量PIO[20 mg/(kg·d)]可能通過使糖尿病大鼠骨形成速率減低引起糖尿病大鼠骨量減少，建議PIO宜小劑量使用。

吡格列酮;鏈脲佐菌素；糖尿病;骨計(jì)量學(xué)

噻唑烷二酮類藥物(TZDs)主要通過激活過氧化物酶酶體增殖受體(PPAR-γ)，增加多種基因編碼蛋白的表達(dá)，從而提高胰島素敏感性，降低血糖。吡格列酮是噻唑烷二酮類的主要藥物之一。既往研究表明，PPARγ可導(dǎo)致骨量減少,增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)[1]。也有研究認(rèn)為，骨髓干細(xì)胞膜上的PPARγ被配體激活后可在骨髓微環(huán)境中阻斷破骨細(xì)胞的生成[2]。目前，對(duì)于PPARγ影響糖尿病大鼠骨代謝和骨轉(zhuǎn)換的機(jī)制還不是十分清楚。在之前的文章[3]中已經(jīng)討論了PIO干預(yù)影響糖尿病大鼠骨密度及骨轉(zhuǎn)換的狀況，發(fā)現(xiàn)低劑量PIO干預(yù)糖尿病大鼠骨密度無(wú)變化，高劑量PIO干預(yù)可使糖尿病大鼠骨密度減低。本文將進(jìn)一步探討不同劑量PIO干預(yù)影響糖尿病大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的狀況。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性SD大鼠38只[清潔級(jí)，體重(240±13 g)]，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SGCK(京)2008-0001。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自然照明，室內(nèi)室溫20-25 ℃，相對(duì)濕度40%-70%。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由采食和飲水。

1.2主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)、微量血糖試紙(羅氏診斷有限公司)、PIO(北京太洋有限公司)、鹽酸四環(huán)素(上海制藥廠)、 Villaneuva骨染色劑，乙醇，丙酮，甲基丙稀酸甲酯，聚甲基丙稀酸甲酯，過氧化苯甲酰(均購(gòu)自天津化學(xué)試劑一廠)。ACCT-CHECK Active 血糖儀(羅氏診斷有限公司)、Roger Polycut Ⅲ切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、OLYMPUS IX70 倒置顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

1.3糖尿病大鼠模型建立與PIO治療

28只造模成功的大鼠被隨機(jī)分為PIO低劑量組[4 mg/(kg·d),n=10]、PIO高劑量組[20 mg/(kg·d),n=10]和模型組(n=8)。另選10只未造模大鼠為對(duì)照組。造模前夜，大鼠自由進(jìn)食水。造模方法為將大鼠置于鼠盒，尾靜脈1次注射STZ 45 mg/kg。給藥后72 h后和7 d后測(cè)定大鼠尾靜脈血糖，兩次測(cè)定血糖均大于16.7 mmol/L判定為糖尿病造模成功。尾靜脈注射STZ大鼠糖尿病成模率為96.4%，全部動(dòng)物于成模后干預(yù)16周，股動(dòng)脈放血處死。干預(yù)期間未應(yīng)用吡格列酮之外的降糖藥物。干預(yù)方法為每日上午9時(shí)給藥，吡格列酮混懸液灌胃服用。干預(yù)期間無(wú)因血糖原因死亡大鼠。

1.4四環(huán)素雙標(biāo)記法

利用四環(huán)素能與骨特異結(jié)合并沉積在骨礦化前沿的特性，把時(shí)間因素標(biāo)記在骨的重建過程中，四環(huán)素標(biāo)記反映骨重建活性，表明骨小梁表面的激活頻率。兩種標(biāo)記線增多，均是骨再建活躍的指標(biāo)，可直觀地反映骨形成和新骨生長(zhǎng)情況。

在處死動(dòng)物前14 d進(jìn)行第1次標(biāo)記，方法為：鹽酸四環(huán)素按每日50 mg/kg體重，每日1次灌胃，標(biāo)記2 d。停藥后11 d，進(jìn)行第2次標(biāo)記，方法同前。在第2次灌胃后3 d，處死動(dòng)物。

1.5大鼠不脫鈣骨切片的制備

取左側(cè)脛骨近端2/3為所用標(biāo)本，去除軟組織，將骨標(biāo)本兩側(cè)沿縱向用水砂紙磨平，暴露骨髓腔。0.5%的Villaneuva骨染色劑中染色4 d。按下列順序脫水脫脂：75%乙醇2 h，2次→80%乙醇2 h，2次→95%乙醇1 h，2次→100%乙醇40 min，2次→100%乙醇和丙酮1∶1混合液5 h→丙酮2 h，2次→丙酮和甲酯1∶1混合液4 h→甲酯24 h，脫水脫脂好的標(biāo)本可置于甲酯中保存。配置包埋劑：甲基丙稀酸甲酯250 ml，過氧化苯甲酰2.5 g，聚甲基丙烯酸甲酯75 g混合后，用磁力攪拌器攪拌至清亮透明，4 ℃冰箱保存。將標(biāo)本放入包埋盒，用包埋劑包埋標(biāo)本，置真空干燥箱中干燥，溫度25-30 ℃，約1周，包埋塊變硬取出。用德國(guó)POLYCUT硬質(zhì)骨切片機(jī)切成20 μm厚的切片，光學(xué)樹脂封膠片。

1.6骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)分析

將骨切片置于光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下，用KONTRON-IBA2.0全自動(dòng)圖像處理系統(tǒng)測(cè)量自骺板線遠(yuǎn)端1-5 mm范圍內(nèi)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。

骨形態(tài)學(xué)參數(shù)：全部骨組織體積(TTV,mm3)，海綿骨體積(SBV,mm3)，骨小梁體積(TBV,mm3)，骨小梁體積(TBV)占全部骨組織體積(TTV)的百分比(TBV/TTV,%)，平均骨小梁板厚度(Tb.Th,μm)，平均骨小梁板間隙(Tb.Sp,μm)，平均骨小梁接點(diǎn)數(shù)(Tb.N,個(gè)/視野)。骨動(dòng)力學(xué)參數(shù)：四環(huán)素單標(biāo)表面(sL.S/TBS,%)，四環(huán)素雙標(biāo)表面(dL.S/TBS,%)，骨礦化表面(MS/BS,%)，骨形成表面(OS/BS,%)，礦化沉積率(MAR,μm/d)，礦化延遲時(shí)間(MLT,d)，組織水平的骨形成速率(Svf,μm/d)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組大鼠骨形態(tài)學(xué)參數(shù)比較

與對(duì)照組相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型組及各PIO治療組TBV/TTV、Tb.Th、Tb.N均不同程度地減少，Tb.Sp不同程度地增加(均P<0.01)。與模型組相比，低劑量組各參數(shù)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組TBV/TTV減少(P<0.05)，Tb.Th、Tb.N減少，Tb.Sp增加(均P<0.01)。與低劑量組相比，高劑量組TBV/TTV、Tb.Th減少(P<0.05)，Tb.N減少(P<0.01)，Tb.Sp增加(P>0.05)。

2.2各組大鼠骨動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

與對(duì)照組相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型組及各PIO治療組sLS/S、dLS/S、MS/BS、Svf、OS/BS均不同程度地減少(均P<0.01)。與模型組相比，低劑量組各參數(shù)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組sLS/S、MS/BS、OS/BS減少(P<0.01)，dLS/S、Svf減少(P<0.05)，而MAR、MLT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與低劑量組相比，高劑量組sLS/S、dLS/S、MS/BS、Svf均減少(均P<0.01)，而MAR、MLT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別nTBV/TTV(%)Tb.Th(μm)Tb.Sp(μm)Tb.N(個(gè)/視野)低劑量組1013.95±2.26△94.21±12.33△428.78±13.54△2.78±0.65△高劑量組1013.76±1.22△#*92.95±15.71△##*430.84±23.99△##2.73±0.51△##**模型組814.11±2.48△94.46±12.00△427.25±27.17△2.81±1.39△對(duì)照組1017.26±1.16122.23±6.79187.73±41.055.22±0.58

與對(duì)照組相比，△P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01；與低劑量組相比，*P<0.05，**P<0.01

組別nsLS/S(%)dLS/S(%)MS/BS(%)MAR(μm/d)MLT(d)Svf(μm/d)OS/BS(%)低劑量組109.28±1.26△2.23±0.33△5.34±0.54△0.41±0.055.61±0.230.44±0.07△1.35±0.34△高劑量組109.24±0.85△##**2.19±0.25△#**5.29±0.99△##**0.36±0.095.02±0.510.42±0.04△#**1.32±0.05△##模型組89.31±1.49△2.25±0.10△5.35±0.17△0.42±0.035.73±0.40.45±0.01△1.36±0.02△對(duì)照組1012.47±4.974.04±0.247.24±0.050.45±0.065.81±0.520.86±0.024.02±0.03

與對(duì)照組相比，△P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01；與低劑量組相比，**P<0.01

3　討論

骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)(bone histomorphometry)簡(jiǎn)稱骨計(jì)量學(xué)，以形態(tài)學(xué)觀察到的骨組織結(jié)構(gòu)改變?yōu)榛A(chǔ)，用定性、定量的計(jì)量方法求得骨體積密度、骨小梁表面積、皮質(zhì)骨厚、骨小梁間距、骨小梁厚的平均值等，還能對(duì)類骨質(zhì)進(jìn)行分析，求得平均類骨質(zhì)體積、平均類骨質(zhì)表面、平均類骨質(zhì)寬、成骨細(xì)胞活躍表面、破骨細(xì)胞活躍表面和平均骨壁厚等指標(biāo)，并且還能通過活體四環(huán)素雙標(biāo)記的方法，測(cè)定多組骨動(dòng)力學(xué)組織參數(shù)[4]。

本研究中，TBV/TTV代表骨小梁體積(TBV)占全部骨組織體積(TTV)的百分比，反映骨小梁的骨量。結(jié)果表明，與模型組相比，低劑量組骨量沒有明顯變化，而高劑量組則骨量明顯減少。Tb.Th反映平均骨小梁板厚度，Tb.Sp反映平均骨小梁板間隙，Tb.N反映平均骨小梁接點(diǎn)數(shù)，反映骨小梁連接性。Tb.Th、Tb.Sp及Tb.N反映骨小梁的空間結(jié)構(gòu)。與模型組相比，高劑量組骨小梁板厚度減低，間隙增加，骨小梁連接性減低，從而使其阻抗外力的作用減低，而低劑量組則無(wú)明顯變化。sL.S/TBS代表沿骨小梁表面走行的四環(huán)素單標(biāo)記線長(zhǎng)度占骨小梁表面長(zhǎng)度的百分比，dL.S/TBS代表兩次標(biāo)記的四環(huán)素沉積于骨表面所形成的雙標(biāo)記線長(zhǎng)度占骨小梁表面長(zhǎng)度的百分比，MS/BS代表四環(huán)素單標(biāo)記線的1/2與雙標(biāo)記線之和占骨小梁表面的百分比，OS/BS代表骨小梁類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比。sL.S/TBS、dL.S/TBS、MS/BS及OS/BS都是形成參數(shù)，反映骨重建的活躍程度。Svf表示組織水平的骨形成速率，表明單位面積骨小梁表面每天新生成的礦化骨的多少。高劑量組較模型組骨小梁標(biāo)記表面減低，骨形成速率減低，提示高劑量PIO可能通過使糖尿病大鼠骨形成速率減低造成骨量減少，而低劑量組上述動(dòng)力學(xué)指標(biāo)則無(wú)明顯變化，這與形態(tài)學(xué)參數(shù)變化相一致。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)提示低劑量PIO[4 mg/(kg·d)]對(duì)于STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)無(wú)顯著影響。這個(gè)結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的[3]。也有一項(xiàng)研究顯示，小劑量吡格列酮[3 mg/(kg·d)]干預(yù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，不影響骨密度，骨吸收及骨代謝，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[5]。而高劑量組干預(yù)16周可使糖尿病大鼠已有的骨量減少進(jìn)一步加重，骨形態(tài)學(xué)示骨小梁骨量進(jìn)一步減少，而骨動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示骨小梁標(biāo)記表面減低，骨形成速率減低，提示高劑量PIO可能通過使糖尿病大鼠骨形成速率進(jìn)一步減低造成骨量減少。既往研究結(jié)果不盡相同。Lecka-Czernik等[6]的骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)與羅格列酮[20 mg/(kg·d)] 干預(yù)C57BL/6J(B6)鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠骨小梁體積減少，通過骨形成速率減低造成骨量減少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此基本一致。另一項(xiàng)臨床研究也顯示，吡格列酮抑制骨形成，似乎并不影響骨吸收[7]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。也有研究顯示不同的結(jié)果。Syversen等[8]給予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer-344)吡格列酮35 mg/(kg·d)治療4個(gè)月發(fā)現(xiàn)大鼠骨小梁體積減少，該實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)也未能顯示任何與羅格列酮類似的影響前成骨細(xì)胞分化的作用，而僅表現(xiàn)為血清OPG減低，推測(cè)PPARγ激動(dòng)劑可能主要對(duì)骨吸收起作用。一項(xiàng)臨床研究顯示，30 mg/d的吡格列酮用于治療2型糖尿病或IGT患者一年，未看到骨密度及骨轉(zhuǎn)換方面的變化[9]，吡格列酮增加2型糖尿病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚未可知。有研究表明，這種結(jié)果差異可能與TZDs激活PPARγ的活性不同有關(guān)[10]。當(dāng)然，還需大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

總之，上述結(jié)果提示PIO可能減低骨量，宜小劑量使用。

[1]Zhu ZN,Jiang YF,Ding T. Risk of fracture with thiazolidinediones:an updated meta-analysis of randomized clinical trials[J].Bone,2014,68:115-123.

[2]Christie MR,Molvig J,Hawkes CJ,etal.IA-2 antibody-negative status predicts remission and recovery of C-peptide levels in type 1 diabetic patients treated with cyclosporin[J].Diabetes Care,2002,25(7):1192-1197.

[3]邸倩,邱明才,張?chǎng)?等.吡格列酮對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠骨代謝指標(biāo)及骨密度的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,46(9):870-873.

[4]劉忠厚．骨礦與臨床[M]．北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社.2006:353-356．

[5]Tsirella E1,Mavrakanas T,Rager O,etal.Low dose pioglitazone does not affect bone formation and resorption markers or bone mineral density in streptozocin-induced diabetic rats[J].J Physiol Pharmacol,2012,63(2):201-204.

[6]Lecka-Czernik B,Gubrij I,Moerman EJ,etal.Inhibition of Osf2/Cbfa1 expression and terminal osteoblast differentiation by PPARgamma2[J].J Cell Biochem,1999,74(7):357-371.

[7]Xiao WH,Wang YR,Hou WF,etal.The effects of pioglitazone on biochemical markers of bone turnover in the patients with type 2 diabetes[J].Int J Endocrinol,2013,2013:290734.

[8]Syversen U,Stunes AK,Gustafsson BI,etal.Different skeletal effects of the peroxisome proliferator activated receptor(PPAR)α agonist fenofibrate and the PPARγ agonist pioglitazone[J].BMC Endocr Disord,2009,9(6):10.

[9]Grey A,Bolland M,Fenwick S,etal.The skeletal effects of pioglitazone in type 2 diabetes or impaired glucose tolerance:a randomized controlled trial[J].Eur J Endocrinol,2014,170(2):255-262.

[10]Quesada-Gomez JM,Serrano-Alferez I.Nonhypoglycemic effects of thiazolidinediones[J].An Int Med,2001,135:1007-1008.

Effects of pioglitazone on bone histomorphometry in STZ-induced diabetic rats

DI Qian1, QIU Mingcai2, ZHANG Xin2, YANG Jing1

(1DepartmentofEndocrinology,FirstClinicalMedicalCollege,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofEndocrinology,GeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity)

ObjectiveTo explore the effect of pioglitazone on bone histomorphometry in streptozocin(STZ)-induced diabetic rats.MethodsThe DM rat models were established by intravenous injection of STZ(45 mg/kg) and then were randomly divided into low-dose group[4 mg/(kg·d),n=10],high-dose group[20 mg/(kg·d),n=10] and model group(n=8).Another ten normal rats were chosen as control group.The rats in PIO groups were gavaged with PIO liquid every day for 16 weeks.Then the rats were killed,and the left tibia was dissected immediately for bone histomorphometry analysis.ResultsCompared with control group,the ratio of trabecula bone volume to total tissue volume(TBV/TTV),mean trabecula plate thickness(Tb.Th),numbers of trabecula(Tb.N),single labeled surfaces(sLS/S),double labeled surfaces(dLS/S),trabecular osteoid surface/total trabecular surface(OS/BS),MS/BS,bone formation velocity at tissue level(Svf) all decreased(P<0.01),while Tb.Sp increased in the other groups(P<0.01).Compared with model group,all indexes showed no significant change in low-dose group,while TBV/TTV,dLS/S,Svf,Tb.Th,Tb.N,sLS/S,MS/BS,OS/BS all decreased in high-dose group(P<0.05 or<0.01),but Tb.Sp increased(P<0.01).ConclusionThe low-dose PIO may not affect bone histomorphometry in diabetic rats,but high-dose PIO may induce osteopenia by decreasing osteoblastic forming rate.So PIO should be used with a low dose.

pioglitazone;streptozocin;diabetes;bone histomorphometry

邸倩，女，1975-08生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:diqian2008@126.com

2016-05-09

R587.1

A

1007-6611(2016)10-0901-04DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.005