陸　斌， 李建武， 楊　艷

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)陜西省總隊(duì)醫(yī)院骨科，西安　710054；*通訊作者，E-mail：lubin0008@163.com)

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microRNA-365在骨肉瘤患者血漿中的表達(dá)及其意義

陸斌*， 李建武， 楊艷

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)陜西省總隊(duì)醫(yī)院骨科，西安710054；*通訊作者，E-mail：lubin0008@163.com)

目的探討microRNA-365(miR-365)在骨肉瘤患者血漿中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)方法檢測(cè)35例骨肉瘤患者和40例健康對(duì)照者血漿中miR-365的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)分析骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平為0.38±0.16，明顯低于正常對(duì)照組血漿中miR-365的表達(dá)水平(0.61±0.24)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；骨肉瘤患者血漿中miR-365的表達(dá)水平在不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型及Enneking分期中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論miR-365在骨肉瘤患者血漿中的水平降低，miR-365可能參與骨肉瘤的發(fā)病。

microRNA-365；骨肉瘤；定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

骨肉瘤(osteosarcoma)是一種好發(fā)于兒童和青少年的骨骼系統(tǒng)的惡性腫瘤，起源于間葉組織，占惡性骨腫瘤的35%。由于骨肉瘤發(fā)展快、惡性程度高，骨肉瘤早期診斷及治療較為困難[1-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)一種長(zhǎng)度約22-24個(gè)堿基內(nèi)源性表達(dá)的非編碼單鏈小RNA，參與了早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生理過(guò)程。大量研究表明許多miRNAs可作為原癌基因或者抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[6]，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)多種miRNAs在骨肉瘤組織或細(xì)胞中異常表達(dá)，參與了骨肉瘤的病理過(guò)程[7-11]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-365可能通過(guò)調(diào)節(jié)KRAS基因表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞SOSP9607增殖并促進(jìn)其凋亡[12]，本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步研究miR-365在骨肉瘤發(fā)病中的作用，利用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)miR-365在骨肉瘤患者血漿中的表達(dá)水平，并分析miR-365表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，以便為骨肉瘤的早期診斷提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2012-01～2015-12在中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)陜西省總隊(duì)醫(yī)院骨科住院且經(jīng)過(guò)影像學(xué)及病理學(xué)確診的骨肉瘤患者35例，其中男性20例，女性15例，年齡10-38歲(平均19.2±8.4歲)。Enneking分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期23例，Ⅲ期7例；骨肉瘤部位：股骨17例，脛骨13例，其他5例；瘤體大?。褐睆健? cm 23例，直徑>5 cm 12例；參照Dahlin標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)分型：骨母細(xì)胞型15例，軟骨母細(xì)胞型9例，纖維母細(xì)胞型7例，其他4例。40例正常對(duì)照組為中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)陜西省總隊(duì)醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人，其中男性23例，女性17例，年齡10-42歲，平均(21.3±9.5)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)、內(nèi)參照U6(CD201-0145)及miR-365(CD201-0367)引物購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。紫外分光光度儀為美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品，高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2.2方法無(wú)菌采集所有研究對(duì)象EDTA抗凝外周靜脈血5.0 ml，其中骨肉瘤患者在手術(shù)、放療或化療等抗腫瘤治療前進(jìn)行樣本采集。血液分別經(jīng)過(guò)3 000 r/min離心10 min、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后收集上層血漿置于EP管中-80 ℃保存待用。取200 μl血漿采用miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒提取RNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。RNA溶于10 μl的DEPC水中，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA溶液的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.1的RNA用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA合成，20 μl反應(yīng)體系具體如下： RNA 2 μl、2×miRNA RT 反應(yīng)緩沖液10 μl、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄酶2 μl、無(wú)RNA酶水6 μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min、95 ℃ 3 min，合成的cDNA反應(yīng)液放置于-20 ℃保存待用。采用內(nèi)參照U6(CD201-0145)及miR-365(CD201-0367)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μl PCR反應(yīng)體系包括：2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA 1 μl、50×ROX Reference Dye 2 μl、雙蒸水6.2 μl，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性15 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s 共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲得溶解曲線及循環(huán)閾值(Ct值)，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt分析miR-365的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1兩組血漿中miR-365表達(dá)水平的比較

qRT-PCR檢測(cè)血漿中miR-365的表達(dá)水平結(jié)果顯示，骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平為0.38±0.16，明顯低于正常對(duì)照組血漿中miR-365的表達(dá)水平(0.61±0.24)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.899，P<0.01)。

2.2骨肉瘤患者血漿miR-365表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

根據(jù)qRT-PCR檢測(cè)miR-365表達(dá)結(jié)果的中位值，將骨肉瘤患者分為低表達(dá)組(n=20)和高表達(dá)組(n=15)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-365的表達(dá)水平在不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型及Enneking分期中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

3　討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于脛骨近端和股骨遠(yuǎn)端等長(zhǎng)管狀骨的干骺端，具有惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)等特點(diǎn)。外科手術(shù)及放療是目前主要的治療方法，雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，骨肉瘤患者的5年生存率有了大幅度提高，但由于早期容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移及化療藥物耐藥，骨肉瘤患者的總體預(yù)后較差[1-5]。目前骨肉瘤的診斷主要根據(jù)臨床癥狀及影像學(xué)檢查，缺乏臨床檢測(cè)指標(biāo)以便早期診斷、評(píng)價(jià)預(yù)后，因此迫切需要尋找新的有效的骨肉瘤的早期診斷腫瘤標(biāo)志物以進(jìn)一步提高骨肉瘤的早期診斷和治療水平。

表1骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

Table 1Relationships between plasma levels of miR-365 and clinical pathological parameters in patients with osteosarcoma(cases)

臨床病 理指標(biāo) n低表達(dá)(n=20)高表達(dá)(n=15)χ2P年齡1.390.24 ≥16歲1486 <16歲21129性別0.060.81 男20119 女1596腫瘤部位1.050.59 股骨17116 脛骨1376 其他523腫瘤大小2.720.10 >5cm1275 ≤5cm231310病理類型0.760.86 骨母細(xì)胞型1587 軟骨母細(xì)胞型954 纖維母細(xì)胞型752 其他422Enneking分期1.190.55 Ⅰ期523 Ⅱ期231310 Ⅲ期752

初級(jí)miRNA (primary miRNA)和前體miRNA (precursor miRNA，pre-miRNA)在 Drosha 復(fù)合體和 Dicer 酶的作用下在胞質(zhì)中由剪切成為成熟miRNA，miRNA主要通過(guò)與靶基因 mRNA 的3′UTR結(jié)合導(dǎo)致靶基因降解或者抑制靶基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)控發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多個(gè)生理過(guò)程，miRNA廣泛存在真核生物中，具有組織特異性和時(shí)序性。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，扮演著“癌基因”和/或“抑癌基因”的重要角色[6]。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤組織和正常組織異常表達(dá)的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54個(gè)異常表達(dá)miRNA[13]，Lulla等[14]在骨肉瘤組織及細(xì)胞株中也發(fā)現(xiàn)22個(gè)miRNA差異表達(dá)。Namls等[15]采用定量PCR技術(shù)方法發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中103個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，74個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。此外多項(xiàng)研究分析發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)水平與骨肉瘤的臨床病理參數(shù)及預(yù)后密切相關(guān)[16-19]。

miR-365基因定位16p13.12，miR-365的功能非常復(fù)雜，在不同類型的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用miRNA芯片技術(shù)或定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)miR-365在結(jié)腸癌[20]、肺癌[21,22]、肝癌[23,24]、惡性黑色素瘤[25]、兒童白血病[26]及胃癌[27]等腫瘤組織或細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。但有研究發(fā)現(xiàn)在浸潤(rùn)性導(dǎo)管胰腺癌[28]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌[29]中miR-365的表達(dá)水平增高，這也表明miR-365在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。miRNA在外周血中由于包裝機(jī)制而不易被RNA酶降解，可以非常穩(wěn)定地存在，血液中miRNA的濃度較高，達(dá)到作為生物標(biāo)記物的檢測(cè)濃度，血漿或血清miRNA均可以用作生物標(biāo)記物。我們前期研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-181b水平增高，miR-181b可能參與了骨肉瘤的發(fā)病過(guò)程[19]。有學(xué)者利用qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺患者血清中miR-365表達(dá)水平明顯降低[30]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-365的模擬物可以抑制骨肉瘤細(xì)胞SOSP-9607的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)KRAS基因的表達(dá)；而miR-365的抑制物則可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，上調(diào)KRAS基因的表達(dá)[12]，提示miR-365可能通過(guò)調(diào)節(jié)KRAS基因的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。我們利用qRT-PCR檢測(cè)了骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)，提示miR-365可能參與骨肉瘤的發(fā)病。國(guó)內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn)miR-365的表達(dá)水平與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后有關(guān)[22-25]。我們也統(tǒng)計(jì)分析了骨肉瘤患者血漿中miR-365表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-365的表達(dá)水平在不同年齡、不同性別、不同腫瘤部位、不同腫瘤大小、不同病理類型及不同Enneking分期中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與我們的病例數(shù)量較少有關(guān)，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，同時(shí)本研究缺乏隨訪，無(wú)法分析miR-365在骨肉瘤患者預(yù)后中的價(jià)值。

綜上所述，骨肉瘤患者血漿miR-365中表達(dá)水平降低，提示miR-365可能參與了骨肉瘤的病理過(guò)程，但miR-365的作用機(jī)制及在骨肉瘤預(yù)后中的作用有待進(jìn)一步研究，相信隨著研究的不斷深入miR-365有可能作為骨肉瘤的診斷標(biāo)志物、預(yù)后及治療靶標(biāo)。

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Plasma levels of microRNA-365 in patients with osteosarcoma and its clinical significance

LU Bin*，LI Jianwu，YANG Yan

(DepartmentofOrthopaedics,ChinesePeople’sArmedPoliceTroopsShaanxiProvinceCorpsHospital,Xi’an710054,China;*Correspondingauthor,E-mail:lubin0008@163.com)

ObjectiveTo explore the plasma levels of microRNA-365(miR-365) and its clinical significance in patients with osteosarcoma.MethodsThe plasma levels of miR-365 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) in 35 patients with osteosarcoma and 40 healthy controls. The relationships between the plasma levels of miR-365 and clinical pathological parameters of osteosarcoma were analyzed.ResultsThe plasma levels of miR-365 in patients with osteosarcoma were statistically lower than in healthy controls(0.38±0.16vs0.61±0.24,P<0.01). There was no statistical difference in plasma levels of miR-365 in different age, gender, tumor site, tumor size, histological type and Enneking stage of patients with osteosarcoma(P>0.05).ConclusionThe plasma levels of miR-365 in patients with osteosarcoma decrease，which suggests that miR-365 may participate in the pathogenesis of osteosarcoma.

microRNA-365；osteosarcoma；quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

陜西省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2012k16-09-01)

陸斌，男，1975-09生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:lubin0008@163.com

2016-07-26

R738.1

A

1007-6611(2016)10-0930-04DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.012