鄭　琪， 廖子君 ， 趙凌宇， 李　旭， 張　茜， 翟　陽(yáng)

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安　710061； 2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室)

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Rab1A siRNA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

鄭琪1， 廖子君1， 趙凌宇2， 李旭1， 張茜1， 翟陽(yáng)1

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安710061；2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室)

目的觀察Rab1A在胃癌組織的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和凋亡的影響。方法收集35例胃癌患者的胃癌組織及正常胃組織，用real-time PCR和Western blot法檢測(cè)胃癌組織和正常胃組織中Rab1A表達(dá)水平。SGC7901胃癌細(xì)胞分為對(duì)照組，陰性對(duì)照組，Rab1A siRNA 30 nmol/L組,60 nmol/L組和90 nmol/L組，分別給予無(wú)效處理、陰性對(duì)照siRNA和三種不同濃度的Rab1A siRNA，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力。60 nmol/L的Rab1A siRNA沉默SGC7901細(xì)胞中Rab1A的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析Rab1A siRNA對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，Western blot法檢測(cè)Rab1A siRNA對(duì)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果胃癌組織中Rab1A的表達(dá)無(wú)論在mRNA水平(5.625±0.525vs1.000±0.000,P<0.05)還是蛋白水平(1.013±0.125vs0.219±0.060,P<0.05)，均顯著高于正常胃組織。RNA干擾48 h后，與對(duì)照組相比，30 nmol/LRab1A siRNA組的細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯變化(P>0.05)，60 nmol/LRab1A siRNA組和90 nmol/LRab1A siRNA組的細(xì)胞增殖活力明顯下降(P<0.05)，但60 nmol/L組和90 nmol/L組間細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，60 nmol/L siRNA組無(wú)論是G1/G0期、S期，還是G2/M期的細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，60 nmol/L siRNA組無(wú)論是早期凋亡細(xì)胞比例，還是晚期凋亡細(xì)胞的比例均明顯上升(P<0.05)；而且，與對(duì)照組相比，60 nmol/L siRNA組的Bax蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)(0.483±0.015vs0.767±0.153,P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)(0.703±0.021vs0.347±0.015,P<0.05)。結(jié)論Rab1A在胃癌組織中的表達(dá)水平高于正常胃組織，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901增殖，并且通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。

Rab1A；胃癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

全世界胃癌的年死亡人數(shù)在所有惡性腫瘤中排第3位，僅次于肺癌和肝癌[1]。中國(guó)胃癌的年發(fā)病人數(shù)占全球胃癌年發(fā)病人數(shù)的44.2%[2]，且大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期。盡管化療改善了進(jìn)展期胃癌的預(yù)后，但其中位生存時(shí)間不足1年[3]。胃癌在我國(guó)具有較高的發(fā)病率和死亡率，有必要深入研究其發(fā)病機(jī)制，改善其診療水平。

Rab蛋白屬于小分子三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合蛋白，是GTPases的Ras超家族成員之一，與胞內(nèi)蛋白在各細(xì)胞器之間的運(yùn)輸有關(guān)，分二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP)結(jié)合的無(wú)活性形式和GTP結(jié)合的活性形式[4]。Rab蛋白作為細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_(kāi)關(guān)，與其上游調(diào)控子和下游特定的效應(yīng)子相互作用，并與GTP的結(jié)合和水解過(guò)程相偶聯(lián)，在囊泡運(yùn)輸?shù)牟煌A段發(fā)揮作用。

Rab蛋白的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Rab1A在舌癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肝癌組織中呈高表達(dá)[6-8]，且能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，目前有關(guān)Rab1A與胃癌的關(guān)系少見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)了Rab1A在胃癌組織中的表達(dá)，并研究其對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和凋亡的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1胃癌組織與細(xì)胞株

35例胃癌患者的胃癌組織及相應(yīng)的正常組織(胃癌手術(shù)切除標(biāo)本中距離癌組織邊緣超過(guò)5 cm，且經(jīng)病理科醫(yī)師鑒定為正常組織的胃組織)、胃癌細(xì)胞株SGC-7901由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教育部環(huán)境與基因相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。所有患者均確診為胃腺癌，排除少見(jiàn)病理類(lèi)型(鱗癌，小細(xì)胞癌等)。所有患者平均年齡55歲，60歲以下的患者15例，60歲及以上的患者20例；男性22例，女性13例；病理診斷為中、高分化腺癌的患者18例，低分化腺癌的患者17例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期的患者16例，Ⅲ-Ⅳ期的患者19例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者10例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者25例。

1.2主要試劑

Rab1A-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)與合成；Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD Bioscience公司；Rab1A一抗、Bcl-2一抗、Bax一抗、β-Actin一抗及二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司；RIPA裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒和TRIzol Reagent購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa Ex Taq HS 和SYBRR Premix Ex TaqTMkit購(gòu)于中國(guó)TaKaRa公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、10%新生牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；MTT、胰蛋白酶、RnaseA、碘化丙啶(PI)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Rab1A鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、Bcl-2鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、Bax鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、β-Actin兔單克隆抗體(1∶5 000稀釋)和HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(1∶2 500稀釋)，實(shí)驗(yàn)所用的抗體均為鼠源單克隆抗體，購(gòu)自Santa公司。

1.3細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

常規(guī)復(fù)蘇SGC-7901胃癌細(xì)胞，培養(yǎng)于10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后使用胰酶消化并傳代。

按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，用不含有抗生素含血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、5%CO2孵箱中過(guò)夜。

將Rab1A-siRNA(sense:5′-GUU CAG CCA UUU UGU AUC ATT-3′，antisense:5′-UGA UAC AAA AUG GCU GAA CTT-3′)和negative siRNA (NC-siRNA,sense:5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′, antisense:5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，在不含血清和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)4-6 h，然后更換新鮮的含10%新生牛血清的RPMI1640 全培養(yǎng)基，分別收集培養(yǎng)24 h,48 h,72 h的細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

SGC-7901胃癌細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)后，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105/ml的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加200 μl，培養(yǎng)48 h，行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。陰性對(duì)照siRNA是取靶基因特異性siRNA的部分序列合成，用來(lái)驗(yàn)證siRNA對(duì)靶基因抑制的特異性。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(control組)、NC-siRNA組(60 nmol/L)、30 nmol/L siRNA組、60 nmol/L siRNA組、90 nmol/L siRNA組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h,48 h,72 h，向培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞中加入5 mg/ml MTT 溶液20 μl，在37 ℃、5%CO2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔中加入150 μl DMSO，震蕩5 min，然后在POLARstar+OPTIMA微板測(cè)試儀上檢測(cè)每孔光吸收值(OD值檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm)。

1.5細(xì)胞周期檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，首先用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，然后加入250 μl PBS液重懸細(xì)胞，逐滴加入750 μl無(wú)水乙醇，加入同時(shí)不斷搖動(dòng)離心管，使乙醇最終濃度為75%，細(xì)胞置4 ℃過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌1次，加入0.3 ml無(wú)DNase的RnaseA(濃度為100 μg/ml)重懸細(xì)胞，再加入0.3 ml PI染液(濃度為100 μg/ml)，混合均勻后在室溫下避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，PI的紅色熒光通過(guò)630 nm的濾光片進(jìn)行收集，使用BD FACSort CellQuest軟件獲取數(shù)據(jù)，Modfit LT軟件分析DNA含量變化。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)(Annexin-PI)

收集Rab1A-siRNA轉(zhuǎn)染48 h的各組SGC7901細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，PBS緩沖液洗滌2次。然后用300 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1×105/ml。5 ml的流式管中加入100 μl的細(xì)胞懸液，再加入5 μl的 Annexin Ⅴ/FITC、5 μl的碘化丙錠(20 μg/ml)，避光混勻后孵育20 min，最后在流式管中加入400 μl PBS緩沖液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)光源為488 nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光，檢測(cè)結(jié)果使用隨機(jī)軟件分析。

1.7real time PCR檢測(cè)Rab1A mRNA表達(dá)水平

在轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞和臨床標(biāo)本組織中分別加入適量Trizol裂解細(xì)胞。用氯仿、異丙醇、75%的乙醇提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄，用總RNA 2.0 μg，oligo(dT)18 1 μl (0.5 μg)，5×Buffer 4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，RNasin 0.5 μl，補(bǔ)去離子水至18 μl，MMuLV 2 μl 。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃、15 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶：95 ℃、2 min。經(jīng)過(guò)上述反應(yīng)得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，加入RT-PCR反應(yīng)體系。real time PCR反應(yīng)，依據(jù)人SGC7901細(xì)胞Rab1A的 cDNA 序列(FLAG Tag Sequence:5′-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3′)，設(shè)計(jì)real time PCR 引物。測(cè)序引物： T7 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′,BGH 5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′；干擾序列：Rab1A-RT-F Forward:5′-GGGAAAACAATCAAGCTTCAAA-3′，Rab1A-RT-R Reverse:5′-CTGGAGGTGATTGTTCGAAAT-3′；管家基因：GAPDH Forward:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′,GAPDH Reverse:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

real time PCR擴(kuò)增條件：94 ℃變性2 min，按94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s×30 個(gè)循環(huán)，再于72 ℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法對(duì)real time PCR的結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)，2-ΔΔCt表示處理組相對(duì)于對(duì)照組的擴(kuò)增倍數(shù)。其中ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組Ct值-內(nèi)參Ct值)-(對(duì)照組Ct值-內(nèi)參Ct值)；Ct值即循環(huán)閾值，指在real time PCR 循環(huán)過(guò)程中熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。1.8Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集臨床標(biāo)本組織和轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。變性后取50 μg 蛋白，在10%十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，半干轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，根據(jù)分子量的大小切取條帶，脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，分別加入Rab1A鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、Bcl-2鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、Bax鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、β-actin兔單克隆抗體(1∶5 000稀釋)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次(10 min/次)。然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑，置于Syngene G Box凝膠成像儀的暗箱中拍照。使用GeneTools軟件(英國(guó)SYNGENE公司)分析結(jié)果，計(jì)算條帶的積分光密度(optic density,OD)值，半定量分析。以上所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1Rab1A在人胃癌組織中的表達(dá)

應(yīng)用Real time PCR和Western blot法檢測(cè)35例胃癌患者的癌組織和相應(yīng)正常胃組織中Rab1A的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，胃癌組織中Rab1A mRNA表達(dá)水平顯著高于胃正常組織(5.625±0.525vs1.000±0.000,P<0.05，見(jiàn)圖1)，Rab1A蛋白表達(dá)水平也顯著高于胃正常組織(1.013±0.125vs0.219±0.060,P<0.05，見(jiàn)圖2)。2.2Rab1A對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖活力的影響

NC-siRNA 組RNA干擾不同時(shí)間其細(xì)胞增殖活力均較對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)； 30 nmol/L siRNA組在RNA干擾24h,48h后，細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)，作用72 h后才較對(duì)照組出現(xiàn)輕度下降(P<0.05)；60 nmol/L siRNA組除了在RNA干擾24 h后較對(duì)照組細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯下降外，在48 h，72 h與對(duì)照組、NC-siRNA組和30 nmol/L組比較其增殖活力均出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；干擾24 h,48 h,72 h后，與對(duì)照組、NC-siRNA 組、30 nmol/L組相比，90 nmol/L siRNA組細(xì)胞增殖活力均明顯下降(P<0.05)；60 nmol/L siRNA組和90 nmol/L組的細(xì)胞增殖活力，在RNA干擾不同時(shí)間均無(wú)明顯差異(P>0.05，見(jiàn)表1)。

與正常胃組織比較，*P<0.05圖1　人胃癌組織中Rab1A mRNA表達(dá)的變化 (n=35)Figure 1　Real-time PCR results of Rab1A mRNA expression in human gastric cancer tissues (n=35)

與正常組織比較，*P<0.05圖2　人胃癌組織中Rab1A蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果(n=35)Figure 2　Western blot results of Rab1A protein expression in human gastric cancer tissues(n=35)

表1Rab1A siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901增殖活力的影響(OD值)

Table 1Effects of Rab1A siRNA on the cell proliferation ability of SGC7901 gastric cancer cells (OD value)

組別24h48h72h對(duì)照組0.386±0.0780.757±0.0431.112±0.045NC-siRNA組0.414±0.0140.743±0.0431.077±0.05130nmol/LsiRNA組0.410±0.0270.729±0.0291.025±0.043*60nmol/LsiRNA組0.318±0.011#Δ0.543±0.031*#Δ0.734±0.037*#Δ90nmol/LsiRNA組0.286±0.019*#Δ0.486±0.025*#Δ0.687±0.035*#Δ

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NC-siRNA比較，#P<0.05；與30 nmol/L siRNA組相比，ΔP<0.05

陰性對(duì)照siRNA作用后，Rab1A的表達(dá)水平較對(duì)照組無(wú)明顯變化(0.965±0.025vs1.000±0.000,P>0.05，見(jiàn)圖3);60 nmol/L Rab1A siRNA作用于SGC7901細(xì)胞后，Rab1A的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降(0.351±0.035vs1.000±0.000,P<0.05，見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3　Rab1A siRNA(60 nmol/L)可有效沉默SGC7901胃癌細(xì)胞中Rab1A mRNA的表達(dá)Figure 3　Effect of Rab1A siRNA(60 nmol/L) on the expression of Rab1A mRNA in SGC7901 gastric cancer cells

2.3Rab1A對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響

SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA后培養(yǎng)48 h，消化分散為單個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。與對(duì)照組相比，60 nmol/L Rab1A siRNA組G1/G0期細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著增加，S期細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著減少(P>0.05)，G2/M期細(xì)胞數(shù)量也無(wú)明顯減少(P>0.05)，說(shuō)明60 nmol/L Rab1A siRNA對(duì)SGC701細(xì)胞周期影響不明顯；NC-siRNA組與各組相比，其細(xì)胞數(shù)量也無(wú)明顯變化(P>0.05，見(jiàn)表2，圖 4)。

2.4Rab1A對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響

SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rab1A siRNA 48 h后，消化分散為單個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用Annexin Ⅴ+PI試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。與對(duì)照組相比，60 nmol/L siRNA組無(wú)論早期凋亡細(xì)胞比例，還是晚期凋亡細(xì)胞的比例，均較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；NC-siRNA組和對(duì)照組相比，凋亡細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P>0.05，見(jiàn)表3，圖5)。

表2Rab1A siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞周期的影響(%)

Table 2Effects of Rab1A siRNA on the cell cycle of SGC7901 gastric cancer cells (%)

組別G1/G0SG2/M對(duì)照組60.45±4.2017.88±2.3122.66±1.71NC-siRNA組63.47±4.3218.62±3.1120.09±0.9560nmol/LsiRNA組68.88±5.1914.77±1.5019.55±2.36

圖4　Rab1A siRNA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞周期的影響Figure 4　Effects of Rab1A siRNA on the cell cycle of SGC7901 gastric cancer cells

2.5Rab1A通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，60 nmol/L Rab1A siRNA組蛋白水平明顯下降(0.703±0.015vs0.213±0.015,P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，NC-siRNA對(duì)蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響(P>0.05)；與對(duì)照組相比，60 nmol/L siRNA組的Bcl-2在蛋白水平的表達(dá)顯著下調(diào)(0.703±0.021vs0.347±0.015,P<0.05)，Bax在蛋白水平的表達(dá)顯著上調(diào)(0.483±0.015vs0.767±0.153,P<0.05，見(jiàn)圖6)。

表3Rab1A siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡的影響(%)

Table 3Effects of Rab1A siRNA on the apoptosis of SGC7901 gastric cancer cells (%)

組別早期凋亡細(xì)胞晚期凋亡細(xì)胞對(duì)照組6.75±1.255.00±0.25NC-siRNA組7.50±1.254.25±0.5060nmol/LsiRNA組17.75±1.75*9.75±1.50*

與對(duì)照組比較，*P<0.05

與對(duì)照組相比，*P<0.05圖5　Rab1A siRNA對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 5　Effects of Rab1A siRNA on the apoptosis of SGC7901 gastric cancer cells

3　討論

Rab蛋白是Ras小GTPase超家族的成員之一，相對(duì)分子質(zhì)量約20 000-30 000，幾乎存在于真核細(xì)胞所有的與膜相關(guān)的細(xì)胞器(如細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、高爾基體等)，它作為最重要的蛋白囊泡運(yùn)輸分子之一，參與囊泡運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程，通過(guò)胞吐、胞吞的方式完成蛋白在各細(xì)胞器間的運(yùn)輸[4,9]。

研究發(fā)現(xiàn)，Rab蛋白的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。Rab1A在98%的舌鱗狀細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)[6]，在結(jié)直腸癌、乳腺癌和肝癌中也發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)[7,8]。由于胃和大腸有相同的組織學(xué)來(lái)源，所以本研究檢測(cè)了胃癌組織中Rab1A的表達(dá)情況。本研究結(jié)果提示，無(wú)論在RNA水平還是蛋白水平，Rab1A在胃癌組織中的表達(dá)均明顯高于胃正常組織，這提示Rab1A可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[7,8]，Rab1A能夠促進(jìn)SGC7901胃癌細(xì)胞的增殖。本研究中，通過(guò)RNA干擾法沉默SGC-7901細(xì)胞中的Rab1A表達(dá)，MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rab1A siRNA對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖活力有一定的抑制作用。RNA干擾作用48 h后，30 nmol/L的Rab1A siRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制不明顯，60 nmol/L的Rab1A siRNA不但可以有效地沉默Rab1A表達(dá)，而且可使細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯抑制，90 nmol/L的Rab1A siRNA卻不能較60 nmol/L的Rab1A siRNA進(jìn)一步提高生長(zhǎng)抑制效果。而且隨著濃度的提高，siRNA對(duì)細(xì)胞的非特異性損傷逐漸增加，可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所以，在后面的細(xì)胞增殖和凋亡的研究中，選用的Rab1A siRNA的實(shí)驗(yàn)濃度為60 nmol/L。 由此可見(jiàn)，Rab1A可提高SGC7901細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

細(xì)胞的增殖依賴(lài)于高效有序的細(xì)胞周期，細(xì)胞周期的改變往往會(huì)引起細(xì)胞增殖的顯著變化。但本研究中，RNA干擾沉默Rab1A后，SGC7901細(xì)胞無(wú)論是G1/S期，還是G2期或是M期，細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯變化。這與在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的研究結(jié)果有所不同，當(dāng)HeLa細(xì)胞中Rab1A沉默后其S期細(xì)胞明顯減少，G1/G0期細(xì)胞數(shù)量明顯增加[10]。這提示Rab1A對(duì)于SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)控并非通過(guò)影響細(xì)胞周期而實(shí)現(xiàn)，可能存在其他間接調(diào)控機(jī)制。

另一方面，Rab1A對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，可抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)Rab1A沉默后，SGC7901細(xì)胞無(wú)論早期凋亡細(xì)胞比例，還是晚期凋亡細(xì)胞的比例均明顯增加，細(xì)胞凋亡受到一個(gè)由促凋亡分子和抗凋亡分子組成的網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的代表之一就是Bcl-2家族。Bcl-2翻譯的抗凋亡蛋白可阻止細(xì)胞色素C(cytochrome C)從線(xiàn)粒體釋放，從而阻止凋亡啟動(dòng)基因caspases的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡[11]。Bax基因是Bcl-2家族中促凋亡分子之一，Bax蛋白可與Bcl-2蛋白結(jié)合形成Bax/Bcl-2復(fù)合體，或與Bcl-2的靶分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，加速細(xì)胞凋亡[12]。Bcl-2/Bax比值是決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡期的最終決定因素，因其決定了細(xì)胞對(duì)凋亡刺激物質(zhì)的敏感性[13]。本研究中，Rab1A沉默后，Bax蛋白表達(dá)水平上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax比值顯著下降，可解釋SGC7901細(xì)胞凋亡增加的現(xiàn)象。因此，Rab1A可能通過(guò)下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2的表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞凋亡。

有關(guān)Rab1A調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制，目前尚不完全清楚。2014年的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，大腸癌中高表達(dá)的Rab1A可特異性地激活mTORC1，通過(guò)活化mTOR通路促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和進(jìn)展，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[7]，在肝癌中也得到了類(lèi)似的研究結(jié)果[8]。mTOR通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、運(yùn)動(dòng)的重要信號(hào)通路，它的激活可促進(jìn)細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和增殖[14]。根據(jù)上述研究結(jié)果推測(cè)，Rab1A在胃癌中的作用機(jī)制可能與大腸癌、肝癌中相似，通過(guò)激活mTOR通路促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的增殖，其具體分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，Rab1A在人胃癌組織中的表達(dá)水平高于胃正常組織，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)。

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Effects of Rab1A siRNA on the proliferation and apoptosis of SGC7901 gastric cancer cells

ZHENG Qi1, LIAO Zijun1, ZHAO Lingyu2, LI Xu1, ZHANG Qian1, ZHAI Yang1

(1FirstDepartmentofMedicalOncology,AffiliatedShaanxiProvincialCancerHospital,Xi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xi’an710061,China;2DepartmentofGenetics,Xi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine)

ObjectiveTo explore the expression of Rab1A in gastric cancer tissues and its effects on the proliferation and apoptosis of SGC7901 gastric cancer cells.MethodsGastric cancer tissues and normal gastric tissues from 35 gastric cancer patients were collected, and Rab1A expression was analyzed by real-time PCR and Western blot. SGC7901 gastric cancer cells were divided into control group, negative control siRNA group, 30 nmol/L siRNA group, 60 nmol/L group and 90 nmol/L group. MTT assay was used to detect the cell proliferation abilities. After Rab1A expression was silenced by 60 nmol/L Rab1A siRNA, the cell cycle and apoptosis of SGC7901 gastric cancer cells were examined with flow cytometer, and the expression levels of Bax and Bcl-2 protein were analyzed with Western blot.ResultsRab1A expression was higher in human gastric cancer tissues than in normal gastric tissues both at the mRNA level (5.625±0.525vs1.000±0.000,P<0.05) and at the protein level(1.013±0.125vs0.219±0.060,P<0.05). At 48 h after RNA interference, the cell proliferation ability showed no significant difference between 30 nmol/L Rab1A siRNA group and control group(P>0.05), and the cell proliferation abilities in 60 nmol/L and 90 nmol/L Rab1A siRNA groups decreased markedly compared with control group(P<0.05), but they showed no significant difference between 60 nmol/L group and 90 nmol/L group(P>0.05). The numbers of cells in G1/G0, S and G2/M phases showed no difference between 60 nmol/L Rab1A siRNA group and control group. Both early apoptotic rate and late apoptotic rate in 60 nmol/L Rab1A siRNA group decreased markedly compared with control group(P<0.05). Compared with control group, Bax protein expression increased(0.483±0.015vs0.767±0.153,P<0.05) and Bcl-2 protein expression decreased significantly(0.703±0.021vs0.347±0.015,P<0.05) in 60 nmol/L Rab1A siRNA group.ConclusionRab1A is highly expressed in human gastric cancer tissues compared with normal gastric tissues. In addition, it can promote proliferation of SGC7901 gastric cancer cells, and inhibit the apoptosis of SGC7901 cells through downregulating Bax expression and upregulating Bcl-2 expression.

Rab1A;gastric cancer;cell proliferation;cell apoptosis

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(2013M542358)；陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4122)

鄭琪，男，1979-03生，博士，主治醫(yī)師，E-mail：snowpinezq@163.com

2016-06-04

R735.2

A

1007-6611(2016)10-0895-07DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.004