王慶文 白晶月 石岱龍 賈凌云 馮漢青

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

寡霉素處理下細胞外ATP和細胞內(nèi)ATP的關(guān)系及其對細胞死亡調(diào)節(jié)作用的研究

王慶文 白晶月 石岱龍 賈凌云*馮漢青

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

以煙草懸浮細胞BY-2為材料，利用FoF1-ATP合成酶(FoF1-ATPase)抑制劑寡霉素研究了細胞內(nèi)ATP(iATP)對胞外ATP(eATP)水平的影響，以及施加外源ATP對iATP水平和細胞死亡的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，隨著寡霉素濃度的增加(5、10、25、50 μmol·L-1),煙草懸浮細胞的iATP含量逐漸下降,eATP含量也隨之減少，且細胞死亡水平在較高寡霉素處理濃度下有明顯上升。同時，隨著寡霉素處理時間的增加(0.5、1、3、5 h)，煙草懸浮細胞的iATP含量和eATP含量也呈現(xiàn)出不同程度的下降，而細胞死亡水平則有所增加。施加外源ATP能夠緩解寡霉素引起的細胞iATP水平的下降和細胞死亡水平的上升。上述結(jié)果表明，eATP水平受到了iATP水平的影響，而eATP也在線粒體ATP合成受到抑制時調(diào)控iATP和細胞死亡的發(fā)生。

胞內(nèi)ATP；胞外ATP；寡霉素；細胞死亡

三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosphate,ATP)是生物體中的一種高能量化合物,主要由線粒體產(chǎn)生,通常存在于細胞內(nèi)部,并作為能量貨幣分子去支持細胞的各種代謝活動。線粒體ATP是細胞內(nèi)ATP(iATP)最主要的來源，決定著iATP的水平[1～2]。同時，在動、植物細胞外基質(zhì)中也存在著胞外ATP(eATP)[3]。研究表明，eATP可作為一種信使分子，通過特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制調(diào)控細胞代謝和生長發(fā)育過程[4～6]。eATP一定水平的上升可刺激胞內(nèi)游離的Ca2+、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等第二信使分子含量的增加，從而影響植物細胞的生長發(fā)育[7～8]，而eATP一定水平的下降可誘導(dǎo)植物病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)的表達，并且增強了植物對于病毒和病原菌的抗性[9]；eATP更大程度的下降則會引起植物細胞死亡[10]。

由于植物細胞在膜外不存在ATP合成酶，因此我們推測，eATP主要來源于iATP，并受iATP含量的影響，但是這一推論尚缺少直接的實驗證據(jù)。此外，細胞死亡的重要機制之一是iATP的下降，而eATP的下降也能夠引起細胞死亡[11]。這意味著eATP也很可能參與了iATP下降所引起的細胞死亡，但也尚無工作來對這一重要問題進行探討。

基于此,本文以BY-2煙草懸浮細胞培養(yǎng)物(不含葉綠體，不會由光合作用影響ATP的水平，故而線粒體ATP的水平是iATP水平的決定性因素)為材料，利用FoF1-ATPase抑制劑—寡霉素(oligomycin，可通過抑制FoF1-ATPase中Fo亞基從而使細胞內(nèi)ATP合成受到抑制)[12]研究了iATP的產(chǎn)生對eATP水平的影響，以及通過施加外源ATP研究eATP對iATP水平和細胞死亡的調(diào)節(jié)作用。本研究對明確iATP與eATP的關(guān)系以及細胞死亡的機制提供一定的參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料的培養(yǎng)

實驗所用BY-2煙草懸浮細胞(NicotianatabacumL. cv. Bright Yellow-2)由姜里文教授(中國香港大學(xué))饋贈，在MS[13]液體培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司)[補充了3%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的蔗糖和0.4 mg·L-1的2,4-二氯苯氧乙酸，調(diào)pH值至5.8]中25℃黑暗的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)(振蕩速率為130 r·min-1)。每過7天，吸取細胞培養(yǎng)液加入到新鮮液體培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)。

1.2 懸浮細胞的處理

取一定體積的傳代培養(yǎng)5 d后的煙草懸浮細胞，使用前以1∶5的體積比用新鮮培養(yǎng)基稀釋并搖勻后進行如下處理：

(1)分別用0，5，10，25和50 μmol·L-1的寡霉素溶液(無水乙醇配制)處理細胞3 h(在25℃黑暗條件下恒溫震蕩，下同)；

(2)用50 μmol·L-1的寡霉素溶液處理細胞懸液，0.5、1、3和5 h后用于后續(xù)檢測；

(3)50 μmol·L-1寡霉素溶液、50 μmol·L-1外源ATP、50 μmol·L-1寡霉素+50 μmol·L-1外源ATP均處理3 h，以上均用體積分?jǐn)?shù)2%的乙醇代替50 μmol·L-1寡霉素溶液進行如上處理的細胞作為對照。

1.3 懸浮細胞細胞死亡水平的測定

取處理后1 mL的細胞懸液，加入100 μL 0.025%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的伊文思藍染液染色8 min(死細胞因細胞膜通透性增大被伊文思藍著色)。之后，3 000 r·min-1離心3 min，棄上清，再加入1 mL的磷酸緩沖液沖洗細胞，于3 000 r·min-1離心3 min后棄上清，反復(fù)多次以洗去未與細胞結(jié)合的染料。然后向細胞中加入1 mL 1%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS,用50%甲醇配制而成)，混勻后在50℃下水浴30 min，使細胞裂解。于10 000 r·min-1條件下離心10 min，取500 μL上清液，用蒸餾水稀釋至3 mL，在595 nm處檢測其吸光值，以此表示細胞的死亡程度[14]。

1.4細胞內(nèi)ATP(iATP)和胞外ATP(eATP)含量的測定

取處理后的細胞懸液1 mL，于4 000 r·min-1下4℃離心4 min，上清液用于測定eATP含量；吸盡上清液，向剩下的細胞中加入100 μL ATP檢測裂解液(Sigma-Aldrich)破碎細胞釋放出細胞內(nèi)ATP，于12 000 r·min-1下4℃離心5 min，上清液用于iATP含量測定。ATP含量檢測使用螢火蟲尾部提取物(Sigma-Aldrich)測定。螢火蟲尾部提取物的主要成分為蟲熒光素和熒光素酶，ATP可與蟲熒光素經(jīng)熒光素酶催化反應(yīng)，并釋放熒光。通過測定發(fā)光強弱，可測定ATP的含量[15]。測量方法依照制造商說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

以上測量取4次的獨立實驗結(jié)果的平均值，并將數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)采用雙總體t檢驗,檢驗在P<0.05水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果及分析

2.1不同濃度寡霉素處理下細胞iATP和eATP變化關(guān)系

懸浮細胞中分別加入5、10、25或50 μmol·L-1的寡霉素中處理3 h，結(jié)果顯示，隨著寡霉素脅迫濃度的增大，細胞iATP和eATP含量都不同程度減少。5 μmol·L-1寡霉素作用下，iATP含量開始顯著性下降，而eATP含量在10 μmol·L-1寡霉素作用下開始顯著性下降。相較于對照，5、10、25、50 μmol·L-1的寡霉素分別使iATP含量降低了13.02%、33.51%、42.79%、48.19%(圖1A)，eATP含量降低了4.06%、13.23%、22.17%、27.19%(圖1B)。

圖1 不同濃度寡霉素處理下細胞iATP(A)和eATP(B)含量變化 不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著，下同。Fig.1 The level of iATP(A) and eATP(B) under treatment with different oligomycin concentrations Different letters denote significant differences(P<0.05),the same as below.

上述結(jié)果表明，寡霉素處理同時誘導(dǎo)了細胞iATP和eATP含量的減少，并且eATP含量隨著iATP減少呈線性下降(圖2)。表明細胞iATP含量變化直接影響到eATP的含量。

2.2不同時間寡霉素處理下細胞iATP和eATP變化關(guān)系

50 μmol·L-1的寡霉素處理0.5 h即引起iATP含量的顯著下降，并在處理1 h時達到最低，隨后隨著處理時間的延長而不發(fā)生變化(圖3A)。而eATP含量則在寡霉素作用1 h后顯著性下降，并于處理3 h達到最低，隨后處理5 h有所上升(圖3B)。

根據(jù)上述結(jié)果做出iATP與eATP隨寡霉素處理時間變化的關(guān)系圖，同樣可發(fā)現(xiàn)，eATP含量隨著iATP含量的減少而下降(圖4)。

圖2 寡霉素濃度變化下，eATP與iATP含量變化關(guān)系Fig.2 Relationship between iATP and eATP under treatment with different oligomycin concentrations

圖3 不同時間寡霉素處理下細胞iATP(A)和eATP(B)含量變化Fig.3 The level of iATP (A) and eATP (B) under oligomycin treatment with different times

圖4 寡霉素處理時間變化下，eATP與iATP含量變化關(guān)系Fig.4 Relationship between iATP and eATP under oligomycin treatment with different times

2.3 寡霉素處理下細胞死亡的變化

同時本研究對上述不同處理下的煙草懸浮細胞的死亡程度進行了研究。結(jié)果表明，當(dāng)細胞被不同濃度寡霉素作用3 h后，與對照組相比，低濃度5和10 μmol·L-1下細胞死亡水平無明顯增加；較高濃度25和50 μmol·L-1下，細胞死亡水平有顯著性上升，分別增加了1.11和1.27倍(圖5)。

圖5 不同濃度寡霉素處理下細胞死亡水平變化 以無寡霉素處理的細胞作為對照并將對照值設(shè)為1.0，下同。Fig.5 The level of cell death under treatment with different oligomycin concentrations The cells without oligomycin treatment were used as control and the values in the control were set to 1.0,the same as below.

隨著寡霉素處理時間的增加，細胞死亡水平也在不斷加劇。50 μmol·L-1的寡霉素作用下，與對照相比，0.5 h時，細胞死亡無顯著性變化；1 h后，細胞死亡明顯增加并不斷升高。寡霉素處理0.5、1、3、5 h后與對照相比細胞死亡值增加了1.06、1.12、1.26、1.30倍(圖6)。

圖6 不同時間寡霉素處理下細胞死亡水平變化Fig.6 The level of cell death under oligomycin treatment with different times

2.4外源ATP對寡霉素處理下細胞iATP含量和細胞死亡水平的影響

綜上結(jié)果，選擇50 μmol·L-1寡霉素作用懸浮細胞3 h為處理條件，探索外源ATP對寡霉素脅迫下細胞iATP水平的影響。由結(jié)果可知，單獨對細胞進行50 μmol·L-1外源ATP處理，并未引起細胞iATP水平的顯著變化。而50 μmol·L-1寡霉素與50 μmol·L-1外源ATP同時處理細胞，與寡霉素單獨處理細胞相比，iATP水平有所上升(圖7)。

圖7 不同處理下的iATP含量變化Fig.7 The effects of different treatments on the levels of iATP

本實驗繼續(xù)研究了外源ATP對寡霉素處理引起的細胞死亡的調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，單獨使用50 μmol·L-1外源ATP處理細胞，細胞死亡水平無顯著變化。而與50 μmol·L-1寡霉素處理的細胞相比，50 μmol·L-1寡霉素與50 μmol·L-1外源ATP共同處理細胞，則細胞死亡水平明顯降低(圖8)。以上實驗結(jié)果表明,外源ATP對寡霉素引起的細胞死亡有緩解作用。

圖8 不同處理下的細胞死亡水平的變化Fig.8 The effects of different treatments on the levels of cell death

3 討論

寡霉素能夠阻斷H+向ATPase傳遞,從而有效降低細胞iATP水平[16～17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著寡霉素處理濃度的增加，細胞iATP水平逐漸降低(圖1A)；隨著寡霉素處理時間的增加，細胞iATP水平也呈現(xiàn)出不同程度的下降(圖3A)。相似于細胞iATP的變化，細胞eATP水平也因寡霉素(在不同濃度或不同處理時間)的處理而有所降低(圖1B，圖3B)；并且，在不同寡霉素處理濃度或不同處理時間下，eATP與iATP含量變化呈正相關(guān)關(guān)系(圖2，圖4)。上述觀察表明，在寡霉素作用下，iATP水平很大程度上影響著eATP水平。

以前的研究發(fā)現(xiàn)，細胞可以通過ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運載體蛋白或膜泡運輸?shù)确绞綄⒓毎麅?nèi)的ATP運輸?shù)郊毎?，從而形成了細胞外ATP[18～19]；同時，由于植物細胞在膜外并不具有ATP合成酶，故而iATP是植物細胞eATP的唯一來源。因此，盡管并不清楚煙草懸浮細胞是通過哪種方式將細胞內(nèi)的ATP運輸?shù)郊毎?，但寡霉素很可能是通過影響了細胞內(nèi)iATP的合成而影響了eATP的水平。

隨著寡霉素濃度或時間的增加，不僅iATP與eATP的含量下降，細胞死亡水平也不斷加劇(圖5、圖6)。許多研究發(fā)現(xiàn)，iATP下降是引起一些類型植物細胞死亡的重要原因[20～21]。因此，寡霉素引起的細胞死亡水平的上升可能和iATP水平的下降有關(guān)。

本文也觀察到寡霉素也導(dǎo)致了eATP含量的下降(圖1B，圖3B)，而Chivasa等[10～11]發(fā)現(xiàn)，eATP的下降也會引發(fā)植物細胞的死亡，因此本研究進一步探討了寡霉素引起的細胞死亡水平的上升是否也受到了eATP水平的影響。結(jié)果顯示，單獨施加50 μmol·L-1外源ATP時，細胞死亡量無明顯變化，而對寡霉素處理的細胞中施加該濃度的外源ATP，與單獨寡霉素處理細胞相比，細胞死亡有明顯緩解(圖8)，表明了當(dāng)寡霉素導(dǎo)致細胞死亡水平上升時，eATP濃度的變化也能夠影響細胞死亡的水平。

細胞死亡水平的變化是一個細胞內(nèi)部多種生理學(xué)變化的綜合結(jié)果。ATP由于具有較高的極性，無法自由穿過細胞膜[22]，因此，從理論上推斷，外源ATP對寡霉素誘導(dǎo)的細胞死亡水平上升的緩解作用應(yīng)是外源ATP引起了細胞內(nèi)的變化所致。本研究的進一步觀察表明，50 μmol·L-1外源ATP單獨作用對細胞iATP無影響，但當(dāng)寡霉素處理細胞引起iATP水平不足時，施加該濃度外源ATP會對iATP下降有緩解作用(圖7)，表明在寡霉素導(dǎo)致iATP水平不足時，eATP能促進iATP的合成。有研究表明，外源ATP的施加，可以使得動物細胞和植物細胞內(nèi)Ca2+的含量的增加[23～25]。Burkeen等[25]發(fā)現(xiàn)，胞外ATP的水平和線粒體鈣離子的水平呈現(xiàn)出高度的一致性；而線粒體鈣離子水平可正向調(diào)節(jié)著線粒體ATP的產(chǎn)生[26]。由此我們推測可能存在機制：在寡霉素處理下，iATP的減少引起了細胞死亡水平的上升，并引起了eATP的降低；在此情況下，外施ATP可能通過引起胞內(nèi)Ca2+含量增加而使得線粒體ATP的產(chǎn)生有所增加，從而緩解了iATP水平的下降，并緩解了細胞死亡水平的上升。但具體機制尚需進一步研究。

1.Winkler H H,Neuhaus H E.Non-mitochondrial ATP transport[J].Trends in Biochemical Sciences,1999,24(2):64-68.

2.Goh C H,Jung K H,Roberts S K,et al.Mitochondria provide the main source of cytosolic ATP for activation of outward-rectifying K+channels in mesophyll protoplast of chlorophyll-deficient mutant rice(OsCHLH) Seedlings[J].The Journal of Biological Chemistry,2004,279(8):6874-6882.

3.Khakh B S,Burnstock G.The double life of ATP[J].Scientific American,2009,301(6):84-92.

4.Choi J,Tanaka K,Cao Y,et al.Identification of a plant receptor for extracellular ATP[J].Science,2014,343(6168):290-294.

5.Chivasa S,Simon W J,Murphy A M,et al.The effects of extracellular adenosine 5′-triphosphate on the tobacco proteome[J].Proteomics,2010,10(2):235-244.

6.Sun J,Zhang C L,Deng S R,et al.An ATP signalling pathway in plant cells:extracellular ATP triggers programmed cell death inPopuluseuphratica[J].Plant,Cell & Environment,2012,35(5):893-916.

7.Dichmann S,Idzko M,Zimpfer U,et al.Adenosine triphosphate-induced oxygen radical production and CD11b up-regulation:Ca++mobilization and actin reorganization in human eosinophils[J].Blood,2000,95(3):973-978.

8.Silva G,Beierwaltes W H,Garvin J L.Extracellular ATP stimulates NO production in rat thick ascending limb[J].Hypertension,2006,47(3):563-567.

9.Chivasa S,Murphy A M,Hamilton J M,et al.Extracellular ATP is a regulator of pathogen defence in plants[J].The Plant Journal,2009,60(3):436-448.

10.Chivasa S,Tome D F,Murphy A M,et al.Extracellular ATP:a modulator of cell death and pathogen defense in plants[J].Journal Plant Signaling & Behavior,2009,4(11):1078-1080.

11.Chivasa S,Ndimba B K,Simon W J,et al.Extracellular ATP functions as an endogenous external metabolite regulating plant cell viability[J].The Plant Cell,2005,17(11):3019-3034.

12.Ramirez F,Marecek J F,Kantor T V,et al.Effects of borohydride-treated oligomycins on processes of energy transduction in mitochondria[J].European Journal of Biochemistry,1982,121(2):275-279.

13.Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures[J].Physiologia Plantarum,1962,15(3):473-497.

14.Yang S W,Kim S K,Kim W T.Perturbation of NgTRF1 expression induces apoptosis-like cell death in tobacco BY-2 cells and implicates NgTRF1 in the control of telomere length and stability[J].The Plant Cell,2004,16(12):3370-3385.

15.Mcelroy W D.The energy source for bioluminescence in an isolated system[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1947,33(33):342-345.

16.Yokota A,Henmi M,Takaokao N,et al.Enhancement of glucose metabolism in a pyruvic acid-hyperproducingE.colimutant defective in F1-ATPase activity[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1997,83(2):132-138.

17.Keobmann B J,Westerhoff H V,Snoep J L,et al.The glycolytic flux inE.coliis controlled by the demand for ATP[J].Journal of Bacteriology,2002,184(14):3909-3916.

18.Kim S Y,Sivaguru M,Stacey G.Extracellular ATP in plants.Visualization,localization,and analysis of physiological significance in growth and signaling[J].Plant Physiology,2006,142(3):984-992.

19.Thomas C,Rajagopal A,Windsor B,et al.A role for ectophosphatase in xenobiotic resistance[J].The Plant Cell,2000,12(4):519-533.

20.Azad A K,Ishikawa T,Ishikawa T,et al.Intracellular energy depletion triggers programmed cell death during petal senescence in tulip[J].Journal of Experimental Botany,2008,59(8):2085-2095.

21.Comelli M,Pancrazio F D,Mavelli I.Apoptosis is induced by decline of mitochondrial ATP synthesis in erythroleukemia cells[J].Free Radical Biology and Medicine,2003,34(9):1190-1199.

22.Foresi N P,Laxalt A M,Tonn C V,et al.Extracellular ATP induces nitric oxide production in tomato cell suspensions[J].Plant Physiology,2007,145(3):589-592.

23.Demidchik V,Nichols C,Oliynyk M,et al.Is ATP a signaling agent in plants[J].Plant Physiology,2003,133(2):456-461.

24.Burkeen J F,Womac A D,Earnest D J,et al.Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes[J].Journal of Neuroscience,2011,31(23):8432-8440.

25.Jeter C R,Tang W Q,Henaff E,et al.Evidence of a novel cell signaling role for extracellular adenosine triphosphates and diphosphates inArabidopsis[J].The Plant Cell,2004,16(10):2652-2664.

26.Griffiths E J,Rutter G A.Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Bioenergetics,2009,1787(11):1324-1333.

The National Natural Science Foundation of China(No.31260059,31560070)；Gansu University Basic Research Service Fee

introduction：WANG Qing-Wen(1992—),female,senior engineer,mainly engaged in plantphysiology research work.

date:2016-07-03

RelationshipbetweenExtracellularATPandIntracellularATPandItsRoleinRegulatingtheCellDeathunderOligomycinTreatment

WANG Qing-Wen BAI Jing-Yue SHI Dai-Long JIA Ling-Yun*FENG Han-Qing

(College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)

In BY-2 tobacco suspension cells, the effect of intracellular ATP(iATP) production on extracellular ATP(eATP) levels was studied by using oligomycin(Inhibitors of FoF1-ATPase). The results showed that with the increase of the concentrations of oligomycin(from 5-50 μmol·L-1), the level of iATP and eATP were decreased, and the level of cell death were increased under higher concentration of oligomycin. With the increase of the times of oligomycin treatment(0.5, 1, 3 and 5 h), the levels of both iATP and eATP were decreased in different extents, while the level of cell death were increased. Treatment with exogenous ATP alleviated the decrease in iATP and the increase in cell death level that were caused by oligomycin, The level of eATP can be affected by iATP, and eATP can regulate the iATP production and cell death under the condition of mitochondrial oxidative phosphorylation being inhibited.

intracellular ATP;extracellular ATP;oligomycin;cell death

國家自然科學(xué)基金(31260059,31560070)；甘肅高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費

王慶文(1992—)，女，碩士研究生，主要從事植物生理生態(tài)方面研究工作。

* 通信作者：E-mail:lingyunjia1982@126.com

2016-07-03

* Corresponding author：E-mail:lingyunjia1982@126.com

Q945.79

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.017