艾可筠 朱 堯 侯和勝 佟少明*

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081； 2.遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116081)

普通小麥TaNAC1基因的表達(dá)及在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化

艾可筠1,2朱 堯1,2侯和勝1,2佟少明1,2*

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081；2.遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116081)

NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用。本文從普通小麥幼葉中獲得了一個(gè)編碼NAC結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為T(mén)aNAC1；氨基酸序列分析表明，TaNAC1具有典型的NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子所具有的五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，隸屬于NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的ATAF亞類(lèi)；亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明，TaNAC1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)；轉(zhuǎn)錄水平上，TaNAC1基因的表達(dá)受到PEG、ABA、低溫及高鹽等非生物脅迫條件的誘導(dǎo)；將TaNAC1轉(zhuǎn)化擬南芥后，與野生型比較發(fā)現(xiàn)，TaNAC1基因的過(guò)量表達(dá)會(huì)使轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)葉片發(fā)育畸形且生長(zhǎng)緩慢，植株矮化及莖部融合等表型，表明TaNAC1基因可能在參與小麥葉片及莖的發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

普通小麥；TaNAC1基因；擬南芥；表型

NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子基因家族的重要成員之一，首先在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)NAM基因編碼蛋白的N端存在著一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為NAM結(jié)構(gòu)域，隨后在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)存在著四個(gè)基因(ATAF1/ATAF2和CUC1/CUC2)編碼蛋白的N端存在著與NAM高度相似的結(jié)構(gòu)域[1～2]。目前，已經(jīng)把編碼具有與矮牽牛的NAM、擬南芥的ATAF1/2和CUC1/2基因相同結(jié)構(gòu)域的基因統(tǒng)稱(chēng)為NAC基因。序列分析表明，所有NAC蛋白的N端都存在一個(gè)保守的NAC結(jié)構(gòu)域，由A、B、C、D、E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，也有些NAC蛋白包含兩個(gè)串聯(lián)的NAC結(jié)構(gòu)域[3]；NAC作為轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合在煙草花葉病毒的35S啟動(dòng)子區(qū)域[4～7]及ERD1基因的啟動(dòng)子區(qū)域[8]。一般情況下，NAC蛋白結(jié)構(gòu)域能促使其形成同源或異源的二聚體，但同時(shí)會(huì)也受到C端轉(zhuǎn)錄激活域的影響[3,6～7]。NAC蛋白的C端氨基酸序列變化多樣，不包含任何已知蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，但具有轉(zhuǎn)錄激活活性的特征，即一些簡(jiǎn)單重復(fù)的氨基酸以及富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸等氨基酸組成的區(qū)域[9～10]。

NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物不同組織及器官的生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)進(jìn)程的調(diào)控。在莖的發(fā)育過(guò)程中，NAC基因的突變會(huì)導(dǎo)致矮牽牛植株缺少芽頂端分生組織，并在幼苗期逐漸死亡，少部分形成芽頂端分生組織的突變體在幼苗期也會(huì)出現(xiàn)子葉融合，成苗期花發(fā)育異常的現(xiàn)象[2]，同時(shí)NAC蛋白還參與植物細(xì)胞壁次生壁的形成及導(dǎo)管的分化，在水生植物向陸生演化過(guò)程中對(duì)莖桿的支持，以及輸導(dǎo)組織的形成中都發(fā)揮了重要的作用[11～13]；在根的發(fā)育中，擬南芥的NAC1基因作為T(mén)IR1下游的靶基因，可以誘導(dǎo)側(cè)根的形成[7]；在葉片發(fā)育過(guò)程中，擬南芥中有6個(gè)NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同EIN3蛋白參與由EIN2蛋白介導(dǎo)的葉片衰老過(guò)程的調(diào)控[14]，47個(gè)大麥的NAC基因中有15個(gè)參與大麥旗葉衰老進(jìn)程的調(diào)控[15]，小麥的TtNAM基因能夠延遲葉片衰老，提高麥粒中的蛋白質(zhì)及鐵、鋅等微量元素的含量[16]；除此之外，NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子還參與植物激素代謝，如番茄的SlNAC4基因的沉默會(huì)通過(guò)抑制乙烯的生物合成來(lái)延遲果實(shí)的成熟[17]，大豆的NAC基因SHAT1-5參與大豆果實(shí)開(kāi)裂的分子調(diào)控[18]；另外，很多證據(jù)表明NAC類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子還參與多方面的非生物脅迫[19]及植物免疫[20～21]等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如干旱[8,22]、高鹽[23]、高溫[24]、水澇[25]、氧化[26]及低溫[27]等。

普通小麥(TriticumaestivumL.)是我國(guó)主要的農(nóng)作物，其功能基因的挖掘和注釋一直是小麥分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，尤其是在小麥基因組測(cè)序完成后，為基因功能的注釋提供了便利條件，根據(jù)預(yù)測(cè)，小麥的基因組中存在著134個(gè)NAC類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)，本研究利用電子克隆等手段，從小麥幼葉中分離了受到PEG、ABA、低溫及高鹽誘導(dǎo)的TaNAC1基因，該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，超表達(dá)TaNAC1基因的擬南芥植株的莖及葉片的生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)了異常，表明該基因可能在小麥莖及葉片的發(fā)育過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

普通小麥(T.aestivumL.)種子采用5%的次氯酸鈉消毒10 min，用蒸餾水沖洗4遍，置于4℃冰箱中暗培養(yǎng)1周后，將種子移入培養(yǎng)瓶，每瓶5粒左右，置于培養(yǎng)室中(溫度25℃，相對(duì)濕度60%～70%，光強(qiáng)100 μmol·m-2·s-1)培養(yǎng)。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的處理，整個(gè)處理參照Mukhopadhyay[28]的方法在黑暗中進(jìn)行。

高鹽處理：在培養(yǎng)瓶中加入濃度為1 mol·L-1的NaCl溶液至終濃度為250 mmol·L-1。

PEG處理：在培養(yǎng)瓶中加入50% PEG溶液至終濃度為25%。

ABA處理：把ABA溶解在DMSO中制成10 mmol·L-1貯存液，然后加入到培養(yǎng)瓶中至終濃度為100 μmol·L-1。

在加入上述溶液以后，分別在0.5、1、2、12，24 h時(shí)，取小麥幼苗的葉片，用吸水紙吸干殘余溶液后迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存，待用；同時(shí)將生長(zhǎng)在蒸餾水中的小麥幼苗作為對(duì)照組，在上述相應(yīng)的時(shí)間取樣。

低溫處理是將小麥的幼苗置于4℃光照培養(yǎng)箱中，處理的時(shí)間和取材方法同上，對(duì)照組為在正常培養(yǎng)室的溫度(25℃和光強(qiáng)為100 μmol·m-2·s-1)。

1.2 小麥幼葉總RNA提取及cDNA的合成

利用Trizol試劑盒(TaKaRa，大連)提取小麥幼葉的總RNA，經(jīng)DNaseI處理后，用NanoDrop確定RNA的濃度和純度，稀釋成相同濃度后，通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性。取1 μg純化后的RNA，按照PrimeScript One Step RT-PCR Kit試劑盒(TaKaRa，大連)說(shuō)明書(shū)中的操作程序進(jìn)行第1鏈cDNA的合成，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因的克隆及序列分析

以NAM(Accession no. X92204)和CUC2(Accession no. AB002560)為查詢(xún)序列，在GenBank的nr數(shù)庫(kù)中采用Blastn程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，物種限定為T(mén).aestivum，搜索與之高度相似的小麥的EST序列，將返回的結(jié)果拼接，以拼接序列為模板設(shè)計(jì)引物，上下游的引物序列分別為CGACGGAGAAGCAGGAAGC(5′-3′)及AGTCCTCTTCTTACCCGACTGC(5′-3′)。

以小麥幼葉的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，與pMD-19T載體(TaKaRa，大連)連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序；測(cè)序結(jié)果利用Sequencher軟件進(jìn)行拼接，并通過(guò)NCBI的ORF Finder程序進(jìn)行開(kāi)放閱讀框及其編碼氨基酸序列的預(yù)測(cè)；采用Interpro和predictNLS程序分別對(duì)該基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索和核定位信號(hào)的預(yù)測(cè)。

1.4 氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以克隆到的基因編碼的蛋白序列為查詢(xún)序列，登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Blastp程序查找與其蛋白序列高度相似的序列，對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選后，相似序列以FASTA格式下載存于本地機(jī)上。多序列比對(duì)采用ClustalX程序進(jìn)行，并利用MEGA5.1進(jìn)化分析軟件，采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[29]。

1.5 脅迫條件下的基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同脅迫處理?xiàng)l件下的TaNAC1基因在各個(gè)階段的表達(dá)情況。以克隆到的目的基因序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物，上下游序列分別為CGCGAATTCACTACCCGATT(5′-3′)及ACTGCCAAAGGAGGAGGTGC(5′-3′)；以小麥的Tubulin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物，上下游引物序列分別為T(mén)GAGGGTCCTACACTTCG(5′-3′)及TCCTCTGGATTCCGTGCC(5′-3′)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用SYBR? Premix ExTaqTM試劑盒(TaKaRa，大連)在TP800實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行。

以稀釋10倍的不同脅迫條件下的cDNA為模板，反應(yīng)體積為25 μL，包括2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后根據(jù)熒光實(shí)時(shí)定量PCR的分析曲線，自動(dòng)設(shè)定熒光域值，分別計(jì)算出目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因各處理3次重復(fù)的Ct值的平均值，通過(guò)計(jì)算不同的2-ΔCt值，來(lái)確定目標(biāo)基因在不同處理?xiàng)l件下各個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。

1.6 目標(biāo)蛋白的細(xì)胞定位

將目標(biāo)基因的5′及3′端分別引入EcoRⅠ及HindⅢ酶切位點(diǎn)，插入到pEGAD載體中，經(jīng)含有60 mg·L-1氨芐青霉素的LB平板篩選后，挑取陽(yáng)性克隆，并經(jīng)過(guò)酶切及測(cè)序驗(yàn)證，獲得經(jīng)CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白(GFP)與目標(biāo)蛋白的融合蛋白的表達(dá)載體。采用基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，將表達(dá)載體導(dǎo)入其中，并置于22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14～16 h后，利用激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope,Carl Zeiss)觀察熒光蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的位置。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定

將目標(biāo)基因插入到pCAMBIA 1300載體的多克隆位點(diǎn)中構(gòu)建雙元表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Columbia型)，轉(zhuǎn)化程序參照Bechtold等[30]進(jìn)行，收獲T0代種子后，在選擇培養(yǎng)基上(含30 mg·L-1的潮霉素)進(jìn)行篩選，選擇T2代為3∶1分離比的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行T3代篩選，同時(shí)以T3代轉(zhuǎn)基因植株和野生型的葉片為材料，采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以擬南芥的Actin及TaNAC1基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定。

將經(jīng)過(guò)篩選的陽(yáng)性株系及野生型的種子消毒并用無(wú)菌水清洗后，將種子平鋪在MS培養(yǎng)基上，4℃下春化5天后，移入光照箱中(22℃恒溫，24 h光照，光強(qiáng)為30～40 μmol·m-2·s-1)培養(yǎng)10 h后移入營(yíng)養(yǎng)土中，每天觀察并照相記錄轉(zhuǎn)基因植株各株系及野生型的葉片、莖以及種莢的發(fā)育情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaNAC1基因的克隆及序列分析

采用表1中的引物，以小麥幼葉的cDNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得一個(gè)長(zhǎng)為900 bp的條帶，該序列的ORF長(zhǎng)度為858 bp，預(yù)測(cè)編碼285個(gè)氨基酸，分子量31.9 KDa，基因組PCR擴(kuò)增的結(jié)果顯示此基因不含有內(nèi)含子；InterPro程序分析在該序列編碼蛋白的N端18-168氨基酸殘基處存在著NAC結(jié)構(gòu)域，并具有A、B、C、D和E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(圖1)，predictNLS程序預(yù)測(cè)該蛋白序列包含著兩個(gè)保守的核定位信號(hào)序列(圖1)。將該基因命名為T(mén)aNAC1后提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，返回的登錄號(hào)為KR814823。

2.2小麥TaNAC1氨基酸序列的多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

多序列比對(duì)的結(jié)果表明，除了麥屬植物外，TaNAC1蛋白的氨基酸序列與其它物種的相似性相對(duì)較高，如與Brachypodiumdistachyon(XP_003557366.1)氨基酸序列的一致性達(dá)到76%，與Zeamays(001141629.2)，Sorghumbicolor(XP_002459566.1)和Oryzasativa(NP_001059213.1)，氨基酸序列的一致性分別為70%，69%和68%。(圖1)，進(jìn)一步說(shuō)明NAC類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子是植物中高度保守的蛋白質(zhì)家族之一。

圖1 TaNAC1蛋白的氨基酸序列以及與其它NAC蛋白的氨基酸序列的比對(duì)分析 “*”代表相同的氨基酸殘基；“:”及“.”代表相似的氨基酸殘基 A,B,C,D及E代表NAC結(jié)構(gòu)域所包含的五個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域；NLS1,NLS2為預(yù)測(cè)到的兩個(gè)核定位信號(hào)Fig.1 Multiple alignments of TaNAC1 and other NACs “*” represents the identical amino acid residues; “:” and “.” represent similar amino acid residues; A,B,C,D and E represent five conservative sub-domains of NAC respectively; NLS1 and NLS2 are two predicted nuclear localization signals.

圖2 TaNAC1蛋白與其它物種NAC蛋白的聚類(lèi)分析 圖中黑色箭頭表示TaNAC1蛋白所在位置Fig.2 The phylogenetic analysis of TaNAC1 and other NACs The black arrow indicates the location of TaNAC1

圖3 TaNAC1基因在不同脅迫及植物激素ABA處理下，不同時(shí)間(0.5、1、2和12 h)的表達(dá)變化模式Fig.3 The transcription levels of TaNAC1 at different time points (0.5,1,2 and 12 h)by the treatment of various stresses and ABA

將搜索到的所有與TaNAC1相似的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(物種名稱(chēng)及登錄號(hào)見(jiàn)圖2)，結(jié)果表明，單子葉植物，雙子葉植物各聚成單獨(dú)的一枝，所有不同分支的NAC蛋白都是單系同源的，并不存在物種間的水平基因轉(zhuǎn)移，說(shuō)明此類(lèi)NAC蛋白在一定程度上反映了物種進(jìn)化的歷史。導(dǎo)入到ClustalX軟件中進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA5.1進(jìn)化分析軟件采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2.3 TaNAC1基因在脅迫條件下的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)小麥幼葉中TaNAC1基因在不同脅迫處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。結(jié)果表明：PEG(25%)、ABA(100 μmol·L-1)和NaCl(250 mmol·L-1)的處理都使TaNAC1基因的轉(zhuǎn)錄在1 h內(nèi)就達(dá)到最高，然后逐漸下降(圖3:A,B,D)；4℃低溫處理使TaNAC1基因的轉(zhuǎn)錄在0.5 h后就迅速達(dá)到最高，然后下降(圖3:C)。

2.4 TaNAC1基因的亞細(xì)胞定位分析

為驗(yàn)證TaNAC1蛋白在細(xì)胞中的作用部位，將TaNAC1基因插入35S啟動(dòng)子和pEGAD基因之間形成GFP-TaNAC1的融合基因，未插入TaNAC1基因的pEGAD空載體用作對(duì)照，分別用基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。結(jié)果顯示GFP-TaNAC1融合蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)(圖4:A,B,C)，而對(duì)照的GFP蛋白均勻分布在洋蔥表皮細(xì)胞的每個(gè)部位，證明了TaNAC1基因編碼的蛋白是核蛋白。

圖4 GFP-TaNAC1融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中定位分析 A.融合蛋白在熒光場(chǎng)下的照片；B.融合蛋白在光場(chǎng)下的照片；C.光場(chǎng)和熒光場(chǎng)疊加后的照片；D.對(duì)照GFP蛋白在熒光激發(fā)時(shí)的照片F(xiàn)ig.4 Location of GFP-TaNAC1 in the onion epidermis cell A.Image of GFP-TaNAC1 in fluorescence field; B.Image of GFP-TaNAC1 in light field; C.Image of GFP-TaNAC1 in fluorescence and light field; D.Image of GFP(control) in fluorescence field

2.5 轉(zhuǎn)TaNAC1基因的擬南芥的表型鑒定

將T3代轉(zhuǎn)基因植株各株系及野生型的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用擬南芥的Actin引物及TaNAC1的特異性引物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)檢測(cè)，如圖5結(jié)果所示，所有的轉(zhuǎn)基因植株都含有目的基因，表明外源基因已經(jīng)整合到基因組中并在擬南芥中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。

在獲得TaNAC1的轉(zhuǎn)基因擬南芥后，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的葉片發(fā)育情況和野生型(圖6)進(jìn)行了對(duì)比觀察。在種子萌發(fā)期，轉(zhuǎn)基因植株和野生型并沒(méi)有差別；在子葉形成期，野生型的子葉對(duì)生分布(圖6:A箭頭所指處)，而部分轉(zhuǎn)基因株系的兩片子葉發(fā)生融合(圖6:A2-A3箭頭所指處)，根系短小， 數(shù)目少，發(fā)生子葉融合的轉(zhuǎn)基因植株一般不能正常發(fā)育到成株，在幼苗期就會(huì)逐漸死亡；在蓮座葉形成后，野生型蓮座葉的葉形由卵形，邊緣整齊，逐漸轉(zhuǎn)為橢圓形(圖6:B1)，而大部分轉(zhuǎn)基因葉片發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)為裂葉及葉片融合(圖6:B2-B3,C1-C3,D1-D3)。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的分子鑒定 1～10.不同轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增結(jié)果；11.野生型；12.陽(yáng)性對(duì)照；13.水對(duì)照Fig.5 Molecular identification of transgenic Arabidopsis 1-10. The PCR amplification results of different transgenic plants; 11. Wild type; 12. Positive control; 13. ddH2O

圖6 小麥TaNAC1的轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉和葉片發(fā)育的表型 A1-A3.轉(zhuǎn)基因T1代植株的子葉；B1.野生型葉片發(fā)育表型；B2,B3,C1-C3.轉(zhuǎn)基因T3代植株的葉片表型；D1-D3.發(fā)育畸形的葉片表型Fig.6 Phenotype of cotyledon and leaf development in transgenic Arabidopsis A1-A3. The cotyledon of T1 transgenic lines; B1. The leaf phenotype of wild type; B2,B3,C1-C3. The leaf phenotype of T3 transgenic lines; D1-D3. The phenotype of abnormal leaves

圖7 小麥TaNAC1的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種莢發(fā)育的表型 A.野生型的莖及種莢表型；B～D.代表不同的轉(zhuǎn)基因株系的莖及種莢發(fā)育的表型Fig.7 Phenotype of pod development in transgenic Arabidopsis A.The phenotype of stem and pod in wild type; B-D. The phenotype of stem and pod in transgenic Arabidopsis

轉(zhuǎn)基因植株抽薹進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，與野生型(圖7:A)相比，部分轉(zhuǎn)基因株系的莖矮化，開(kāi)花數(shù)量不一，種莢無(wú)序分布，集中在花莖的頂端(圖7:B)或下部(圖7:C)，部分轉(zhuǎn)基因植物的莖部發(fā)生融合(圖7:D)。

3 討論

本研究從普通小麥中克隆了一個(gè)NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因TaNAC1，該基因編碼蛋白屬于NAC家族基因的ATAF類(lèi)。在基因的分子進(jìn)化分析中，我們采用了最大似然法(ML)、最大簡(jiǎn)約法(MP)以及鄰接法(NJ)對(duì)所選取的序列進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，3種算法都得到了相同的進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并與傳統(tǒng)的物種分類(lèi)及進(jìn)化的結(jié)果保持一致，說(shuō)明NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可以作為基因進(jìn)化研究的侯選基因之一。分析結(jié)果也顯示，與此類(lèi)NAC蛋白親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的為裸子植物Piceasitchensis，并沒(méi)有在已經(jīng)完成基因組測(cè)序的藻類(lèi)等水生植物中找到編碼NAC結(jié)構(gòu)域的基因，因此NAC蛋白作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，還缺少?gòu)乃参锏疥懮参镞M(jìn)行轉(zhuǎn)移的證據(jù)。另外，植物NAC蛋白在不同物種中序列的相似程度較高，與TaNAC1蛋白距離最遠(yuǎn)的S.moellendorffii，其氨基酸序列的相似性也已經(jīng)達(dá)到41%；對(duì)于NAC蛋白的結(jié)構(gòu)域，尤其是DNA結(jié)合域在不同物種間的相似程度更高，其保守性也確保了其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，也暗示了其在植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中的相似功能。

TaNAC1基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)受到PEG、高鹽、低溫及植物激素ABA的誘導(dǎo)，很多研究都表明，NAC家族的AFAF類(lèi)基因參與廣泛的逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)[31～33]，是植物逆境脅迫的重要調(diào)節(jié)因子之一。在擬南芥中，ANAC019，ANAC055及ANAC072基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)受到干旱、高鹽以及植物激素ABA及MeJA的誘導(dǎo)[8]，以及其編碼的NAC結(jié)構(gòu)域的RD26基因也受到干旱和ABA的誘導(dǎo)[34]；一些與TaNAC1蛋白在序列上相似程度很高的其它物種的NAC蛋白，如O.sativaIndica(ACX71077.1)、S.bicolor(AGG40203.1)及H.vulgare(AEG21060.1)，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)都不同程度地受到各種脅迫因子的誘導(dǎo)，尤其是GRAB1(CAA09371)蛋白與TaNAC1相似性達(dá)到93%，可以通過(guò)與小麥的矮化雙生病毒復(fù)制蛋白R(shí)epA相互作用來(lái)抑制雙生病毒的復(fù)制[21]，但由于在擬南芥中超表達(dá)TaNAC1基因后，會(huì)造成轉(zhuǎn)基因植物的莖、葉等器官發(fā)育異常，甚至產(chǎn)生致死的效應(yīng)，故無(wú)法對(duì)其進(jìn)行抗性分析，因此對(duì)于TaNAC1基因參與的逆境調(diào)控機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

超表達(dá)TaNAC1基因的轉(zhuǎn)基因植株，在葉片發(fā)育初期出現(xiàn)了子葉及幼葉融合、幼葉黃化，后期部分葉片變大，短葉柄及葉片發(fā)育畸形，并出現(xiàn)開(kāi)花數(shù)目減少，植株矮化等表型。與Huh[35]等人報(bào)道相一致，擬南芥的ATAF2基因超表達(dá)后也導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因植株的葉片黃化及植株矮化，原因可能是ATAF2基因激活了NIT基因(編碼催化IAN轉(zhuǎn)變IAA和IAM的關(guān)鍵酶)的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)素的合成發(fā)生變化，從而影響植株的發(fā)育；超表達(dá)RD26基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥也出現(xiàn)開(kāi)花數(shù)目減少、短葉柄及葉片變大等表型[35]；但是，擬南芥的NAC類(lèi)基因的另一成員ANAC102受到低溫、干旱、高鹽及低氧的誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)或缺失該基因?qū)M南芥正常的生長(zhǎng)和發(fā)育均沒(méi)有影響，但是在低氧條件下，該基因的缺失表達(dá)會(huì)顯著降低種子的發(fā)芽率[36]。在本研究中，盡管TaNAC1轉(zhuǎn)基因株系都不同程度出現(xiàn)了葉片、莖等組織及器官發(fā)育異常的情況，但由于單子葉及雙子葉植物在葉片、莖等器官形態(tài)建成上存在本質(zhì)的差別，因此TaNAC1基因是否真正參與小麥葉片及莖等器官的形態(tài)建成還需要進(jìn)一步得到證實(shí)。

綜上所述，本研究從普通小麥幼葉中克隆了在細(xì)胞核中表達(dá)的NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子TaNAC1基因，該基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)受到PEG、ABA、低溫及高鹽等非生物脅迫條件的誘導(dǎo)；在擬南芥中實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)葉片發(fā)育畸形且生長(zhǎng)緩慢，植株矮化及莖部融合等表型，表明該基因可能在參與小麥葉片及莖的發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

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introduction：AI Ke-Jun(1991—),female,Master student,is mainly engaged in plant molecular biology.

date:2016-07-26

ExpressionofTaNAC1GeneinCommonWheatandGeneticTransformationinArabidopsis

AI Ke-Jun1,2ZHU Yao1,2HOU He-Sheng1,2TONG Shao-Ming1,2*

(1.College of Life Sciences,Liaoning Normal University,Dalian 116081；2.Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province,Dalian 116081)

NAC-type transcription factor is one of the plant-specific gene families, which plays key roles in regulating the development and response to environmental stress in plants. A NAC-type transcription factor, designatedTaNAC1, was cloned from leaves in wheat. The encoding sequence of TaNAC1 contained five typical NAC conserved domains and belonged to ATAF sub-type NAC family. The TaNAC1 protein was located in the nucleus by transient expression in onion epidermis cell. The transcriptional expression was induced by environmental stresses such as ABA, PEG, low temperature and high salt. Phenotypic analysis in the transgenicArabidopsisshowed that over-expression ofTaNAC1 caused abnormal leaves, dwarfism and fused stem in transgenicArabidopsis.TaNAC1 maybe play important roles in regulation during the development of leaves and stems in wheat.

wheat;TaNAC1;Arabidopsis;phenotype

艾可筠(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail:tongsm@163.com

2016-07-26

* Corresponding author：E-mail:tongsm@163.com

S512.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.012