趙玉琳 楊桂燕,2 于麗麗 郭宇聰 趙 震 高彩球*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，楊凌 712100)

甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草的活性氧代謝

趙玉琳1楊桂燕1,2于麗麗1郭宇聰1趙 震1高彩球1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，楊凌 712100)

真核翻譯起始因子eIF1家族基因具有一定的抗逆調(diào)節(jié)能力。前期研究表明檉柳TheIF1A基因能提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱耐鹽脅迫能力。本研究旨在對該基因的抗氧化能力進(jìn)行分析，探討TheIF1A基因是否具有抗氧化能力。組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草葉片、保衛(wèi)細(xì)胞、根尖積累的活性氧明顯少于野生型煙草(WT)，H2O2含量測定結(jié)果也表明轉(zhuǎn)基因株系的H2O2含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因株系。此外，甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草的CAT活性、POD活性顯著高于WT株系，表明過表達(dá)TheIF1A可能通過提高保護(hù)酶活性來調(diào)節(jié)體內(nèi)活性氧清除能力進(jìn)而改善植株活性氧積累，提高抗氧化能力。

剛毛檉柳；甲基紫精脅迫；活性氧代謝；TheIF1A

真核翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)，是指參與真核翻譯起始這一過程的蛋白質(zhì)。與原核起始因子相比，真核起始因子種類多且復(fù)雜，目前已鑒定的真核起始因子共有12種[1]。其與核糖體、信使核糖核酸和起始轉(zhuǎn)移核糖核酸等組成動(dòng)態(tài)翻譯起始復(fù)合體。在眾多的翻譯起始因子中只有eIF1A和eIF5A具有普遍的保守性[2]。其中eIF1A是一種在真核翻譯起始過程中起重要作用的蛋白質(zhì)，也是一種RNA結(jié)合蛋白，其主要的功能是穩(wěn)定Met-tRNAi與40S核糖體亞基間的結(jié)合，參與激活mRNA的結(jié)合，還可以通過結(jié)合到40S亞基上以阻止其與60S亞基結(jié)合形成無活性的核糖體[3]。eIF1A能夠促使eIF2:GTP:tRNA組成三元復(fù)合體，與40S核糖體亞基結(jié)合啟動(dòng)蛋白翻譯過程[4]。

對植物和酵母細(xì)胞的研究表明，鹽脅迫下eIF1A能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)的翻譯能力，是維持其細(xì)胞生存不可或缺的蛋白，在植物和酵母的抗鹽脅迫中起重要作用[5]。將檉柳TheIF1A基因?qū)霟煵葜?，可提高煙草的抗旱性[6]。因此，在植物抗旱基因工程中TheIF1A具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但目前，對eIF1A基因的抗氧化能力研究較少，因此本研究擬對氧化脅迫下TheIF1A基因的抗逆功能進(jìn)行分析，探討TheIF1A基因的抗氧化功能，這將為拓展真核翻譯起始因子的抗逆作用，為后續(xù)研究真核翻譯起始因子的氧化脅迫抗性及相關(guān)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料處理

將非轉(zhuǎn)基因煙草(WT)及第3代轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草株系1A#1、1A#3種子，分別進(jìn)行表面消毒后播種于1/2MS培養(yǎng)基，4℃處理2～3 d后，萌發(fā)培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)移至滅菌營養(yǎng)土(花土∶蛭石∶珍珠巖=5∶3∶2)，置于相對濕度為70±5%，溫度22±2℃，光照周期14 h/10條件下生長1個(gè)月。用5 μmol·L-1甲基紫精(MV)分別噴灑各株系葉片，并澆灌根部，避光處理0、2、5 h后取整個(gè)植株進(jìn)行酶活測定，取葉片、根尖及葉下表皮進(jìn)行組織化學(xué)染色分析。

1.2CAT活性、POD活性和H2O2含量測定

取約0.1 g葉片，液氮研磨后，用0.05 mol·L-1pH7.8磷酸緩沖液4℃抽提30 min，12 000 r·min-1離心20 min，取上清，用0.3% H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，測定A240以計(jì)算CAT活性[7]。POD活性根據(jù)班巧英等人的方法進(jìn)行測定[8]。H2O2含量的測定根據(jù)南京建成生物工程研究所(http://www.njjcbio.com/)過氧化氫試劑盒進(jìn)行測定。每個(gè)處理至少重復(fù)3次。

1.3 DAB、NBT、DCFH-DA染色

DAB染色[9]：將煙草葉片置于2 mL離心管，加入1.5 mL 1 mg·mL-1DAB染色液，37℃染色12 h。曝光1 h，加入95%的乙醇+5%甘油沸水浴脫色。

NBT染色[9]：將煙草葉片置于2 mL離心管，加入1.5 mL 1 mg·mL-1NBT染色液，37℃染色過夜。加入95%的乙醇+5%甘油沸水浴脫色。

DCFH-DA染色[9]：撕取煙草葉下表皮，置于含100 mmol·L-1MES-KOH和30 mmol·L-1KCl的incubation buffer中，4℃，2 h，5 μmol·L-1DCFH-DA染色劑染色10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察染色結(jié)果。

每種染色至少選取5棵株系的葉片、根及葉下表皮。

2 結(jié)果與分析

2.1甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草保衛(wèi)細(xì)胞和根中活性氧積累

DCFH-DA可以對體內(nèi)ROS進(jìn)行活體染色。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2與DCFH反應(yīng)時(shí)，能使DCFH形成有熒光的2,7-二氯甲烷雙氫熒光素DCF。通過觀察DCF的熒光強(qiáng)度可直接了解細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

對轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草和WT煙草的DCFH染色結(jié)果表明，非脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系1A#1、1A#3和WT的保衛(wèi)細(xì)胞和根尖的熒光強(qiáng)度無明顯差異，MV脅迫后，隨著脅迫時(shí)間延長，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。但與WT相比，1A#1、1A#3的熒光強(qiáng)度明顯要弱(圖1)，表明在MV脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A煙草保衛(wèi)細(xì)胞和根內(nèi)產(chǎn)生的ROS積累小于WT株系。

2.2甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草葉片中活性氧積累

H2O2和O2-為活性氧(ROS)的主要類別。利用DAB染色可以反映體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2含量，染色的深淺代表體內(nèi)積累的H2O2的多少。NBT主要對體內(nèi)的超氧離子(O2-)水平進(jìn)行著色，顏色越深表示積累的O2-越多。染色結(jié)果表明，非脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系1A#1、1A#3和野生型(WT)具有相似的DAB、NBT染色結(jié)果；MV脅迫2和5 h后，WT葉片的DAB、NBT著色明顯比1A#1、1A#3深(圖2)。

整個(gè)植株的H2O2含量測定結(jié)果也表明，非脅迫條件下3個(gè)株系間無顯著差別，MV脅迫引起各株系H2O2含量增強(qiáng)，且隨著脅迫時(shí)間的延長，各株系的H2O2含量增加，但轉(zhuǎn)TheIF1A株系的H2O2含量顯著低于WT株系。如脅迫5 h，WT中H2O2含量分別為1A#1、1A#3的1.64和1.36倍(圖2)。表明過表達(dá)TheIF1A能有效的改善轉(zhuǎn)基因株系在MV脅迫下的ROS積累。

圖2 MV脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因和WT煙草葉片DAB、NBT染色及H2O2含量比較Fig.2 The comparison of DAB, NBT staining and H2O2 content between transgenic lines and WT under MV stress

圖3 MV脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A基因和WT煙草POD和CAT活性比較Fig.3 The comparison of POD and CAT activities between transgenic lines and WT under MV stress

2.3甲基紫精脅迫下轉(zhuǎn)TheIF1A煙草體內(nèi)CAT和POD活性

過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)都是植物體內(nèi)重要的清除活性氧類物質(zhì)的酶類。對轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草和WT的CAT、POD活性測定結(jié)果顯示，非脅迫條件下，轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草和WT的CAT、POD活性無明顯差異，而脅迫后二者活性均明顯增加，但轉(zhuǎn)基因株系中CAT和POD活性明顯高于WT。MV脅迫2 h后，1A#1和1A#3的POD活性分別為WT的1.40和1.32倍，5 h分別為WT的1.34和1.21倍。轉(zhuǎn)TheIF1A基因株系和WT間的CAT活性差異更大，MV脅迫2 h后，WT的CAT活性分別為1A#1和1A#3的59.1%和69.0%；5 h后，WT的CAT活性分別為1A#1和1A#3的59.1%和75.6%(圖3)。表明氧化脅迫下TheIF1A基因可能通過產(chǎn)生較高的保護(hù)酶活性來清除體內(nèi)的活性氧，從而提高轉(zhuǎn)基因植物的抗氧化脅迫能力。

3 討論

本研究對轉(zhuǎn)TheIF1A基因煙草進(jìn)行甲基紫精脅迫處理，分析比較過表達(dá)TheIF1A植株的抗氧化表現(xiàn)，探討TheIF1A是否具有抗氧化調(diào)節(jié)能力。非脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系組織化學(xué)染色結(jié)果顯示各株系體內(nèi)的活性氧積累相似，表明在正常生長條件下這些株系的活性氧水平一致。脅迫后各株系葉片、氣孔、根尖的ROS積累均明顯增加，可能是各株系對甲基紫精脅迫敏感，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而使體內(nèi)的活性氧水平增加；但轉(zhuǎn)基因株系的ROS積累顯著低于野生型，表明過表達(dá)TheIF1A對甲基紫精脅迫引起的氧化脅迫具有調(diào)節(jié)作用，使其保持相對較低的活性氧積累。以往研究也表明翻譯起始因子對植物包括氧化脅迫在內(nèi)的多重非生物脅迫具有應(yīng)答調(diào)控能力，如Sun et al.[10]指出eIF1可作為植物耐鹽堿的指示基因，其耐鹽堿調(diào)控與ROS代謝直接相關(guān)[11]。TaeIF3G具有多重抗非生物脅迫調(diào)控能力，其中包括氧化代謝相關(guān)的調(diào)控[12]，eIF4E也具有相似的功能[13]。本研究以甲基紫精進(jìn)行氧化脅迫更直接的證實(shí)了eIF1A在抗氧化脅迫調(diào)控中的功能。

甲基紫精脅迫不僅能引起植株的氧化應(yīng)激響應(yīng)，同時(shí)也會(huì)引起植株的光合效應(yīng)[14]。吳長艾等人研究表明，甲基紫精脅迫引起植株的光氧化效應(yīng)，進(jìn)而引起葉綠素含量等的變化，導(dǎo)致光合作用的改變[15]。通常情況下，植物光合代謝與光照、水分、溫度等有直接關(guān)系，活性氧積累和代謝也會(huì)一定程度的影響植株的光合代謝。如eIF5A的過表達(dá)直接影響植株在鹽和干旱條件下的葉綠素積累情況，直接關(guān)系植株在脅迫條件下的光合代謝，而同時(shí)eIF5A的耐鹽抗旱調(diào)節(jié)也與SOD等直接參與活性氧代謝的保護(hù)酶活性相關(guān)[16]。本研究中，1A#1和1A#3的氣孔開度在脅迫前后均有所變化，如，1A#1在脅迫2 h氣孔開放較0和5 h大(圖1:A，Bright)，表明過表達(dá)TheIF1A可能在一定程度上影響植株MV脅迫下的氣孔開關(guān)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而改變植株的光合代謝以影響植株的氧化應(yīng)答能力。

在植株排除體內(nèi)活性氧時(shí)，通常涉及SOD、POD、CAT、GST等保護(hù)酶活性的調(diào)控[7,17～18]。其中CAT是H2O2的清除酶類[7]，POD則是過氧化物的清除酶[19]，因此對這些保護(hù)酶活性的測定能反映各株系對氧化脅迫的應(yīng)對能力。在非脅迫下各株系的POD、CAT活性均相似，表明正常生長條件下轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系在氧化酶活性等方面是一致的。脅迫后雖然各株系的酶活性都增高，但相同條件下轉(zhuǎn)基因株系的CAT、POD活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因株系，表明植株受外界氧化脅迫時(shí)，過表達(dá)TheIF1A能夠通過快速提高保護(hù)酶活性應(yīng)對刺激保證正常的代謝。Diédhiou等[20]研究也表明，水稻eIF1也能通過調(diào)控逆境脅迫下的保護(hù)酶類活性參與調(diào)控離子代謝平衡，進(jìn)而提高抗逆能力。表明調(diào)控保護(hù)酶類活性可能是eIF調(diào)控植物響應(yīng)外界刺激進(jìn)行應(yīng)答調(diào)控的主要方式之一。

綜上所述，TheIF1A基因過表達(dá)株系在MV脅迫下的活性氧積累少于WT，而體內(nèi)的CAT、POD活性顯著高于WT，表明TheIF1A可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的保護(hù)酶類活性來增強(qiáng)體內(nèi)的活性氧清除能力從而提高植株的抗氧化脅迫能力。

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ReactiveOxygenMetabolismoftheTheIF1ATransgenicTobaccounderMethylViologenStress

ZHAO Yu-Lin1YANG Gui-Yan1,2YU Li-Li1GUO Yu-Cong1ZHAO Zhen1GAO Cai-Qiu1*

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040；2.College of Forestry,Northwest Agriculture & Forestry University,Yangling 712100)

Eukaryotic translation initiation factor eIF1 involved abiotic stress regulation in plant. Previous studies showed that overexpressedTheIF1Agene fromTamarixhispidaimproved drought and salt resistance of genetically modified plants. We further studied the function ofTheIF1Aresponse to methyl viologen(MV). The results of histochemical stainning showed that ROS were less accumulated in leaves, guard cells and root tips of theTheIF1Atransgenic lines than WT tobacco under MV stress. The H2O2content in transgenic lines were also less than WT under MV stress. Accordingly, the CAT and POD activity in transgenic lines were obviously higher than WT under MV stress. Therefore,TheIF1Acould improve plant oxidative stress resistance by regulating the protecting enzymes activity to increase the ROS scavenging ability.

Tamarixhispida;methyl viologen;ROS metabolism;TheIF1A

東北林業(yè)大學(xué)青年拔尖人才支持計(jì)劃(PYTT-1213-09)；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”(NCET-13-0709)

趙玉琳(1989—)，女，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail：gaocaiqiu@nefu.edu.cn

2015-07-28

Q943.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.018