劉艷軍 張 超 楊靜慧* 李 冰 劉 婷 秦艷筠

(1.天津農學院園藝園林學院，天津 300384； 2.日本筑波大學生命與環(huán)境科學學院，筑波 305-8572)

塔楊松散型均質胚性愈傷組織培養(yǎng)體系

劉艷軍1張 超2楊靜慧1*李 冰2劉 婷1秦艷筠1

(1.天津農學院園藝園林學院，天津 300384；2.日本筑波大學生命與環(huán)境科學學院，筑波 305-8572)

為了獲得塔楊(Populus×canadensisMoench ‘Tower’)松散型、均質、胚性愈傷組織(LHEC)，以塔楊試管苗葉片為外植體，通過不同濃度激素(BA、KT、2,4-D)、蔗糖和無機鹽處理，建立了松散型愈傷組織(LC)誘導—繼代培養(yǎng)—胚性愈傷誘導的高效體系。結果顯示：塔楊葉片在低蔗糖和低無機鹽(1/4MS+2 mg·L-12,4-D+1 mg·L-1BA+10 g·L-1)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)可以誘導出完全的LC(誘導率100%)。LC在繼代培養(yǎng)基(MS+2.0 mg·L-12,4-D+2.0 mg·L-1BA+Vc100 mg·L-1+30 g·L-1)上進行2～3次轉接后，再轉移到LHEC培養(yǎng)基(MS+0.5 mg·L-12,4-D+3 mg·L-1BA+Vc100 mg·L-1+40 g·L-1蔗糖)上培養(yǎng)4～5周(每7天轉接1次)，即可誘導出具有許多球狀體(原胚狀體)的松散型胚性愈傷組織。此外，適當?shù)?,4-D與BA濃度比例，可以使LC保持細胞的松散特性、不形成根、無褐變，生長快；含有30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基利于LC生長和LHEC的形成；維生素C能較好的抑制繼代培養(yǎng)中的褐變；BA有利于形成LC，而KT有利于緊密型愈傷組織的形成，同時BA處理的愈傷組織生長較KT處理的快；當2,4-D濃度為0.5～1 mg·L-1時，隨著BA濃度的增加，LHEC的數(shù)量也隨之增加，當BA為3 mg·L-1時，LHEC數(shù)量達到最大值100%。本文還對影響愈傷組織胚性化的主要因素進行了討論。提出的各項建議對均質胚性愈傷組織LHEC的培養(yǎng)有重要的指導意義。

蔗糖；培養(yǎng)體系；無機鹽；激素；胚狀體

塔楊(Populus×canadensisMoench)是我國近年來新引進的楊樹雜交品種，塔楊為加楊的一個變種，是從加楊品種中經(jīng)過現(xiàn)代生物技術人工選育出的楊樹新品種，屬于黑楊派。其具有生長快、樹形美觀、抗逆性強等特點[1]。楊樹作為重要的林業(yè)資源，不僅是重要的觀賞樹種，還具有經(jīng)濟價值,在水土保持和維護生態(tài)平衡等方面也發(fā)揮著重要的作用。由于楊樹的速生特性[2～3]和經(jīng)濟價值較高等特點，使楊樹育種得到了廣大研究者和生產者的重視，培育具有優(yōu)良性狀的楊樹品種一直是育種工作者所追求的目標[4～6]。近年來，采用體細胞和組織培養(yǎng)進行離體誘變育種技術在許多物種上獲得了應用[7～9]。在以往的體細胞誘變育種中所采用的胚性愈傷組織多為結構緊密的胚性愈傷團[10～11]，由于這種愈傷團僅僅在其表面分散一些胚性細胞[12]，其內部多已分化，這些組織基本不具有分裂能力，很難誘導出胚狀體，甚至在長時間培養(yǎng)后褐變、死亡。所以，采用這類愈傷組織作為誘變對象往往誘變效率低，不能充分發(fā)揮胚性愈傷組織誘變育種的優(yōu)勢。而均質的松散型的胚性愈傷組織內部的細胞氧氣及營養(yǎng)等供應充足，內、外細胞均處于活躍狀態(tài)，易于誘變；其次，構成該愈傷組織的各個細胞處于相同的生理生長狀態(tài)，是理想的細胞試驗系統(tǒng)，可以保證試驗處理的均等性或同一性；第三，其易于分離，可直接用于懸浮培養(yǎng)，并可大大簡化液體懸浮培養(yǎng)程序。因此，均質的、松散型胚性愈傷組織能夠克服上述愈傷組織的不足[13]，其構成的每一個細胞都是一個獨立的個體，誘變率高，可以形成許多不同的單細胞植物體，并能用于細胞學基礎研究(如細胞對各種脅迫的反應)、細胞多倍體育種、細胞誘變育種和懸浮培養(yǎng)的前期培養(yǎng)。本研究的目的是建立塔楊松散型的、均質的胚性愈傷組織誘導體系，為進一步的體細胞學研究、誘變育種等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用塔楊由天津農學院園林植物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 塔楊試管苗的準備

采集當年生的塔楊嫩枝，用流動的自來水沖洗枝條5 min后用20 g·L-1的次氯酸鈉消毒20 min，再用0.01 g·L-1的升汞溶液消毒2 min。消毒后，將枝條用無菌水反復沖洗、接種到含有20 g·L-1蔗糖和30 g·L-1瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上。長出芽后，在相同的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，并取長到5 cm左右的短枝備用。

1.2.2 塔楊松散型愈傷組織的誘導

取上述短枝上的葉片，剪成0.5～1 cm的大小(每片上帶有葉脈或少量葉柄)，接種到不同的誘導培養(yǎng)基中進行松散型愈傷組織的誘導。每個培養(yǎng)皿為一個處理，其中放15～20片；5次重復。每周觀察1次愈傷組織的生長情況。培養(yǎng)溫度為23～25℃，暗培養(yǎng)(黑暗、無光照)。培養(yǎng)4～5周后，選擇松散型愈傷組織進行繼代培養(yǎng)。

1.2.3 塔楊松散型愈傷組織的繼代培養(yǎng)

將上述獲得的松散型愈傷組織轉入繼代培養(yǎng)基。在轉接愈傷組織時，一定要去掉外植體，并只選擇結構松散、絮狀的松散愈傷組織，小心地將其成塊轉移，避免弄碎，轉移的愈傷組織塊要3～5 mm3。每處理10～15個愈傷組織塊；5次重復。培養(yǎng)條件為20～23℃，每天24 h全光照，光照強度為2 000 lx。

1.2.4 塔楊松散型胚性愈傷組織的誘導

上述松散型愈傷組織經(jīng)過2～3次的繼代培養(yǎng)后(每7～10天繼代一次)，再轉入松散型胚性愈傷組織培養(yǎng)基。此次轉移的愈傷組織塊質地開始變硬，轉移時應盡量將變硬的愈傷組織塊整體轉移，避免分散、變小。每處理10～15個愈傷組織塊，5次重復。然后，用同樣的培養(yǎng)基每7～10天轉接一次。轉接時盡量切取愈傷組織塊外圍的愈傷組織，避免帶入組織內部褐變的部分。其中Vc是在培養(yǎng)基融化后50℃時加入培養(yǎng)基(Vc需提前抽濾滅菌)。轉接后，每7天觀察記錄一次。培養(yǎng)條件同繼代培養(yǎng)。

2 結果與分析

2.1激素、無機鹽和蔗糖對塔楊松散型愈傷組織LC的誘導

表1的結果顯示，用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(蔗糖濃度30 g·L-1)，選用BA、KT、2,4-D等激素的各種濃度組合都不能誘導出LC(表1：配方1-1～1-13)，誘導出的都是綠色、緊密型的愈傷組織。這說明在誘導LC過程中激素不是關鍵因素。當僅僅降低培養(yǎng)基中無機鹽含量到1/4MS或僅僅降低蔗糖的含量至10 g·L-1時，也不能誘導出LC(表1：配方1-14～1-17)。只有當蔗糖濃度降低至10 g·L-1和無機鹽含量降低到原濃度的1/4時(1/4MS)才能獲得LC，獲得率為85%～100%(表1：配方1-18～1-22)。說明培養(yǎng)基的滲透壓對形成愈傷的種類影響較大?？赡苁怯绊懙搅擞鷤M織的結構，如MS培養(yǎng)基或高蔗糖(30 g·L-1)培養(yǎng)基都誘導出的是緊密型愈傷組織。這種緊密型愈傷組織細胞排列緊密，細胞間隙較小，組織中細胞大小不一，并分化出導管等細胞，外觀深綠色，是一些質地十分堅硬的大塊狀愈傷組織(圖1)。這類組織很難分化出胚性愈傷和很難誘導出體細胞胚。而降低滲透壓后形成的LC細胞較小，多為圓球形，排列疏松，胞間隙明顯；外觀為淡黃色或黃綠色，組織質地松軟(圖2)。這類組織容易分化出胚性愈傷組織。

表1還顯示，在降低滲透壓后，所有培養(yǎng)基都能誘導出LC，但愈傷組織的細胞類型、生長、穩(wěn)定性等都存在較大的差異。首先在沒有加入細胞分裂素BA的培養(yǎng)基中雖然可以誘導出LC，但在其愈傷上很快長出較多的不定根，隨著培養(yǎng)時間的增長，不定根數(shù)量也增加，同時誘導出的愈傷組織也逐漸變得緊密，甚至褐變、死亡(表1:配方1-18)。BA能使不定根消失(表1:配方1-19～1-21)。這可能與楊樹內源激素中生長素含量較高，加入BA后抑制了其內源生長素的作用，從而抑制了根的生長。

表1 激素、無機鹽和蔗糖對塔楊松散型愈傷組織的誘導

圖1 緊密型愈傷組織顯微結構和外觀形態(tài) A.顯微照片(10×40)；B.外觀Fig.1 The compact callus microstructure and morphology A.Micrograph(10×40); B.Appearance

圖2 松散型愈傷組織顯微結構和外觀形態(tài) A.顯微照片(10×40)；B.外觀Fig.2 The loose callus microstructure and morphology A.Micrograph(10×40); B.Appearance

在低滲透壓下，當生長素2,4-D濃度較低時，愈傷組織生長速度較慢，且所誘導的愈傷組織中夾雜著緊密型愈傷組織，尤其是在靠近葉片邊緣的部位出現(xiàn)較多的緊密型愈傷(表1：配方1-19～1-20)。當2,4-D和BA濃度都較高時，愈傷組織除出現(xiàn)一定數(shù)量的不定根外，顏色會逐漸變黃、變褐(表1：配方1-22)。只有當2,4-D與BA濃度比例合適時(配方1-21)才使形成的愈傷組織保持細胞的松散特性、無不定根、無褐變，始終保持正常的生長。

因此，配方1-21(1/4MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-1BA+10 g·L-1蔗糖)培養(yǎng)基最好，為誘導塔楊LC的最佳培養(yǎng)基配方。

2.2繼代培養(yǎng)中激素、蔗糖和維生素C對塔楊LC生長的影響

在誘導出LC后，如果不及時轉移到新培養(yǎng)基上，愈傷組織會很快褐變、死亡，有些逐漸變成透明狀，并解體死亡。此外，上述誘導的LC是在較低的滲透壓(10 g·L-1蔗糖和1/4MS)下誘導的，需轉移到滲透壓較高的培養(yǎng)基上，以利于胚性細胞的形成。因此，需經(jīng)過2～3次的繼代培養(yǎng)，才能誘導出穩(wěn)定的、均質的、松散型愈傷組織。

表2顯示，在蔗糖為30 g·L-1時，細胞質濃度增大，質地變硬，多數(shù)愈傷組織生長較快。但當采用50 g·L-1時，出現(xiàn)愈傷組織生長減慢的現(xiàn)象(表2:2-6和2-8)。此外，在無維生素C(Vc)的培養(yǎng)基中，愈傷組織培養(yǎng)時間較長時會出現(xiàn)較嚴重的褐變現(xiàn)象(表2:2-1、2-2、2-3)，Vc能較好的抑制褐變(表2:2-4、2-5、2-6)。愈傷組織生長時會產生的一些次生代謝物和內源乙烯[14～15]，Vc能抑制這些物質的產生或降低其作用，同時Vc對愈傷組織的生長也有一定的促進作用。第三， BA更有利于形成松散型愈傷組織，而KT更有利于形成緊密型愈傷組織，同時KT處理的愈傷組織生長速度較慢(表2:2-4、2-7、2-8)。

綜上所述，誘導塔楊形成松散型的、均質的愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方應含有30 g·L-1蔗糖和VC及適宜濃度的BA，即配方2-5(MS+2.0 g·L-12,4-D+2.0 mg·L-1BA+Vc 100 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖)。

2.3不同濃度BA和2,4-D對塔楊松散型胚性愈傷組織的誘導

誘導出的松散型愈傷組織在配方2-5的培養(yǎng)基中繼代2～3次后，如果繼續(xù)培養(yǎng)，則幾乎全部的愈傷組織均處于快速生長狀態(tài)，同時愈傷組織結構開始變硬、變緊密，顏色變?yōu)榘咨?，最后形成為結構緊密的白色愈傷組織塊。如果不進行培養(yǎng)條件的調整，這些愈傷組織會不斷增大，最后其內部褐變或木栓化，只有外部幾層細胞繼續(xù)分裂增殖。這種愈傷組織是不能分化和再生的。為此，我們將配方2-5上培養(yǎng)獲得的白色松散型、均質的、質地變硬的愈傷組織轉接到新的培養(yǎng)基中(表3)觀察其生長。

表2 激素、蔗糖和維生素C對塔楊繼代培養(yǎng)中散松型愈傷組織生長的影響

表3 不同濃度BA和2,4-D對塔楊松散型胚性愈傷組織的誘導

從表3可以看出，在2,4-D濃度為0.5～1 mg·L-1時，隨著BA濃度的增加，胚性愈傷組織的數(shù)量也隨之增加；當BA為3 mg·L-1時，胚性愈傷組織百分率達到最大值100%；以后，隨著BA濃度的增加而下降。表3中配方3-4和配方3-8的培養(yǎng)都能使愈傷組織百分率達到100%。但是，配方3-4培養(yǎng)的愈傷組織生長較慢，另外，由于低濃度2,4-D更有利于愈傷組織的分化和胚狀體的形成[16]。所以，選擇配方3-8(MS+0.5 mg·L-12,4-D+3 mg·L-1BA+Vc100 mg·L-1+40 g·L-1蔗糖)作為胚性愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基配方。

當用配方3-8轉接培養(yǎng)5～8次后，松散的塔楊愈傷組織開始轉變?yōu)檩^硬的愈傷組織，而且顏色也從白色絮狀逐漸過渡到乳白色、黃色，最后為嫩綠色。此時的愈傷組織中有許多球狀體(即為原胚狀體)[17]，結構松散，當以上特征愈傷組織出現(xiàn)時，塔楊的胚性愈傷組織誘導完成。

3 討論

胚性愈傷組織的誘導受到激素、溫度、培養(yǎng)基的滲透壓、繼代時間、抗氧化試劑、初始愈傷組織的狀態(tài)、愈傷組織分割的大小和形態(tài)、外植體的選擇和放置方式等的影響。在我們的試驗中發(fā)現(xiàn)細胞分裂素是胚性愈傷組織形成的關鍵，適當濃度的細胞分裂素有利于胚性愈傷組織的形成，與李雪梅的研究相反[20]，與郭玲玲等的研究也有所不同，她認為與生長素的含量有關[21]；低溫利于愈傷組織向胚性愈傷組織轉化，與傅杰、王麗等人的研究一致[18～19]；降低培養(yǎng)基中蔗糖和無機鹽的濃度，可以增加胚性愈傷組織的比例，可能與降低蔗糖轉運蛋白基因VvSUC12的表達有關[22]；及時的較快的繼代培養(yǎng)有利于愈傷組織的胚性化，可能與增加其過氧化物酶、酸性磷酸酯酶的活性有關[23]；抗氧化試劑的添加如Vc有利于愈傷組織的胚性化，與劉福平等的研究一致[24]； 過于松軟的初始愈傷組織很難獲得胚性愈傷，過于緊密的初始愈傷組織雖然容易胚性化，但不利于均質胚性愈傷組織的形成；適宜大小的愈傷組織利于其胚性化，如塔楊以3～5 mm3大小最為適宜；選擇幼嫩部位或含有分生組織較多的部位作為外植體易獲得胚性愈傷組織；外植體和轉接的愈傷組織放置時具有明顯的“位置效應”，即不能埋進培養(yǎng)基，僅放置在培養(yǎng)基的表面(既與培養(yǎng)基接觸，又留有一定的空隙)的LC誘導率高。此外，光照、植物品種、外植體的生理狀態(tài)及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，如有機成分的添加等都對愈傷組織的胚性化有不同程度的影響。

總之，在誘導植物愈傷組織向胚性愈傷轉變過程中，不同種類的植物存在較大的差異，要根據(jù)上述影響因素具體情況具體分析，找出制約的關鍵因素，從而獲得理想的誘導效果。

4 結論

綜上所述，誘導塔楊松散型胚性愈傷組織的方法為：采用塔楊試管苗葉片為外植體，在1/4MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-1BA+10 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上進行松散型愈傷組織的誘導， 然后轉入MS+2.0 mg·L-12,4-D+2.0 mg·L-1BA+Vc100 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)2～3次，最后轉到MS+0.5 mg·L-12,4-D+3 mg·L-1BA+Vc100 mg·L-1+40 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，進行松散型的胚性愈傷組織的誘導，轉接3～5次后即可誘導出塔楊的松散型的胚性愈傷組織。

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CultureSystemonLoose,Homogeneous,EmbryogenicCallusofPopulus×canadensisMoench‘Tower’

LIU Yan-Jun1ZHANG Chao2YANG Jing-Hui1*LI Bing2LIU Ting1QIN Yang-Jun1

(1.College of Horticulture and Landscape,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384；2.College of Environmental Science,University of Tsukuba in Japan,Tsukuba 305-8572)

To get loose, homogeneous, embryonic callus(LHEC) fromPopulus×canadensisMoench ‘Tower’, an efficient system was set up from the loose callus induction(LC) to successive transfer culture and embryonic callus induction with leaves of seedlings in tube and different kinds and concentration of hormones(BA,KT,2,4-D), sucrose and inorganic salt. The loose, homogeneous callus(LC) was induced completely(induction rate of 100%) with leaves and on the culture medium of low sugar and low inorganic salt(1/4MS+2 mg·L-12,4-D+1 mg·L-1BA+10 g·L-1sugar). The globule embryonic callus(formerly embryoid) was induced after LC was transferred for 2-3 times on successive culture medium(MS+2.0 mg·L-12,4-D+2.0 mg·L-1BA+Vc 100 mg·L-1+30 g·L-1), then transferred onto the medium of LHEC(MS+0.5 mg·L-12,4-D+3 mg·L-1BA+Vc 100 mg·L-1+40 g·L-1sucrose), and cultivated for 4-5 weeks(one time transfer every seven days). The cells of LC was kept in the characteristics of loose without roots, browning and with fast growth under the appropriate concentration of 2,4-D and BA. LC grew better and LHEC was produced more in medium containing 30 g·L-1sucrose. Vitamin C suppressed browning of LC in subculture. BA was conducive to the formation of LC, but KT was beneficial to the formation of compact callus, while the callus growth was faster by treatment of BA than by KT. When the concentration of 2,4-D was 0.5-1 mg·L-1, the number of LHEC was increased with the increase of BA concentration. The number of LHEC reached to the maximum of 100%, when BA was 3 mg·L-1. The main factors were discussed in callus embryogenic.

sucrose;culture system;inorganic salt;hormone;embryoid

國家農業(yè)科技成果轉化基金(2012GB2A100015)和天津市科委重大科技專項(12ZCDZNC04800)

劉艷軍(1970—)，男，高級實驗師，主要從事園藝植物組織培養(yǎng)和分子育種研究。

* 通信作者：E-mail:ajinghuiyang2@aliyun.com

2015-05-27

S792.181

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.017