郝建安，張曉青，姜天翔，楊　波，司曉光，杜　瑾，張愛君，張雨山，王　靜

(國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

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常壓室溫等離子體誘變選育生物表面活性劑高產(chǎn)菌株

郝建安，張曉青，姜天翔，楊波，司曉光，杜瑾，張愛君，張雨山，王靜

(國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)對(duì)Rhodococcussp. SY095菌株進(jìn)行誘變，通過排油圈法與表面張力測(cè)定篩選到2株高產(chǎn)生物表面活性劑的突變株220-7與300-3。與野生型菌株相比，突變株220-7與300-3發(fā)酵液的最佳表面張力分別降至32.8 mN·m-1與28.6 mN·m-1，發(fā)酵液最佳表面活性分別提高14.4%和25.3%；連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這2株突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

常壓室溫等離子體；Rhodococcussp. SY095；生物表面活性劑

生物表面活性劑是一類由微生物產(chǎn)生的具有表面活性的兩親分子。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑除具有較高的表面活性外，還具有熱穩(wěn)定性、可生物降解性等優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來，生物表面活性劑已經(jīng)在石油回收[2]、食品工業(yè)[3]、環(huán)境工程[4]和生物科學(xué)領(lǐng)域[5]展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。然而，成本高一直是制約生物表面活性劑進(jìn)一步工業(yè)生產(chǎn)的瓶頸[6]。研究人員使用廉價(jià)培養(yǎng)基、優(yōu)化培養(yǎng)條件與分離過程等來降低生產(chǎn)成本，但效果并不明顯。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變育種系統(tǒng)是利用氦氣輝光放電產(chǎn)生的等離子體射流作用于微生物，引起微生物的突變[7-9]，已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，其突變效率高、操作方便、成本低。Wang等[10]應(yīng)用ARTP技術(shù)誘導(dǎo)鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)突變，突變株的生物活性提高了一倍。Hua等[11]應(yīng)用ARTP技術(shù)，賦予耐鹽的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)對(duì)石油污染鹽堿土壤的生物強(qiáng)化能力。截至目前，綠色木霉(Trichoderma viride)[12]、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)[8]、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)[13]、白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)[14]均成功運(yùn)用ARTP技術(shù)提高了生物活性。

作者所在研究組已篩選出一株可產(chǎn)生物表面活性劑的紅球菌SY095(Rhodococcussp.SY095)，在此擬采用ARTP技術(shù)誘變?cè)摼辏Y選高產(chǎn)生物表面活性劑菌株，為降低生物表面活性劑生產(chǎn)成本提供幫助。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1菌種與培養(yǎng)基

紅球菌SY095，自行保存，從天津塘沽海河入?？诘奈勰嘀泻Y選得到，其16S rDNA Genbank編號(hào)為GU184127.1。

LB液體培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，pH值7.0。LB固體培養(yǎng)基添加1.5%～2.0%瓊脂粉，1×105Pa滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：K2HPO41，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，NH4NO31，酵母粉 0.01，大豆油2%，pH值7.5。固體發(fā)酵培養(yǎng)基添加1.5%～2.0%瓊脂粉，1×105Pa滅菌30 min。

1.2ARTP誘變

本實(shí)驗(yàn)所用ARTP誘變育種系統(tǒng)由北京思清源生物科技有限公司提供。

取斜面保存的菌種，接種于LB固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1下培養(yǎng)2 d。取10 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，6 000 r·min-1、4 ℃下離心5 min。收集菌體用10 mL無菌生理鹽水沖洗2～3遍后，懸浮于無菌生理鹽水中制備菌懸液，將菌懸液濃度調(diào)至OD600=0.5～0.7(106～108個(gè)·mL-1)。

取10 μL菌懸液涂布于已滅菌的金屬載片上，將載片置于載物臺(tái)上，調(diào)整照射距離2 mm、氦氣流量10 slpm、功率100 W[7，10]，分別照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s、270 s、300 s、330 s。

將照射后的載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL無菌生理鹽水的EP管中，振蕩1～2 min，使附著在載片上的菌體洗脫到生理鹽水中，形成新的菌懸液。將新菌懸液稀釋至10-4、10-5、10-63個(gè)梯度，每個(gè)梯度涂布3個(gè)LB固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。以未照射樣品為參照，通過菌落計(jì)數(shù)法按下式計(jì)算致死率：

1.3突變株的篩選

將突變株轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液進(jìn)行2輪表面活性篩選。初篩采用排油圈法：取直徑10 cm的培養(yǎng)皿，加入20 mL蒸餾水，再取5 mL液體石蠟置于蒸餾水表面，待液體石蠟在水面上形成穩(wěn)定的油膜后，用移液器分別吸取500 μL不同突變株的發(fā)酵液滴在油膜中央，觀察記錄排油圈直徑[15]。復(fù)篩采用排油圈法結(jié)合表面張力測(cè)定：使用科諾A101型表面張力儀通過白金板法測(cè)定發(fā)酵液表面張力。

1.4突變株與野生型菌株的活性對(duì)比

將突變株與野生型菌株分別接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)2 d。將發(fā)酵液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基(體積比1∶100)中，30 ℃、160 r·min-1下振蕩培養(yǎng)，同步記錄突變株與野生型菌株的生長(zhǎng)曲線和表面張力曲線。

1.5突變株的遺傳穩(wěn)定性分析

突變株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，測(cè)定不同傳代次數(shù)下突變株發(fā)酵液的表面張力，分析突變株的遺傳穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與討論

2.1照射時(shí)間的確定

研究表明，當(dāng)致死率達(dá)到90%以上時(shí)，菌株會(huì)獲得高突變率[11，16]。紅球菌SY095在不同照射時(shí)間下的致死率如圖1所示。

圖1　紅球菌SY095在不同照射時(shí)間下的致死率Fig.1　Lethality rate of Rhodococcus sp.SY095 irradiated different time

從圖1可以看出，照射時(shí)間與紅球菌SY095致死率之間有明顯的劑量累積效應(yīng)，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率不斷升高。當(dāng)照射時(shí)間為30 s時(shí)，致死率約為34%；而照射時(shí)間為210 s時(shí)，致死率升高到91%；照射時(shí)間為330 s時(shí)，致死率達(dá)100%。因此，確定照射時(shí)間為210～330 s。

2.2生物表面活性劑高產(chǎn)菌株的篩選

研究表明，排油圈直徑與表面張力間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，排油圈直徑與生物表面活性劑的產(chǎn)量是相關(guān)的[17]。本實(shí)驗(yàn)中，照射時(shí)間為210～330 s時(shí)，共獲得133株突變株；采用排油圈法初篩獲得34株排油圈直徑大于5 cm的菌株。為了避免誤差，復(fù)篩使用排油圈法結(jié)合表面張力測(cè)定篩選生物表面活性劑高產(chǎn)菌株，結(jié)果如圖2所示。

圖2 突變株的篩選Fig.2　Screening of mutants

從圖2可以看出，有13株突變株發(fā)酵液的表面張力低于野生型菌株，有8株突變株發(fā)酵液的排油圈直徑大于野生型菌株。突變株220-7與300-3發(fā)酵液的表面張力分別為29.7 mN·m-1、30.1 mN·m-1，排油圈直徑分別為6 cm、7 cm，具有最佳表面活性。

2.3突變株與野生型菌株的活性對(duì)比

突變株220-7、300-3與野生型菌株的生長(zhǎng)曲線和表面張力曲線見圖3。

圖3　生長(zhǎng)曲線(a)和表面張力曲線(b)Fig.3　Growth curves(a) and surface tension curves(b)

從圖3a可看出，突變株比野生型菌株生長(zhǎng)更為迅速，突變株與野生型菌株幾乎同時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后，突變株的生長(zhǎng)速度明顯加快。從圖3b可看出，發(fā)酵液的表面張力與菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)相關(guān)；當(dāng)菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，表面活性物質(zhì)大量積累，野生型菌株、突變株220-7與300-3的發(fā)酵液最佳表面張力分別達(dá)到38.3 mN·m-1、32.8 mN·m-1、28.6 mN·m-1；與同期野生型菌株相比，突變株220-7與300-3發(fā)酵液的最佳表面活性分別提高14.4%、25.3%。

2.4遺傳穩(wěn)定性分析

通過連續(xù)傳代培養(yǎng)來分析突變株的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)培養(yǎng)6代的突變株發(fā)酵液的表面張力見圖4。

從圖4可看出，連續(xù)培養(yǎng)6代，突變株產(chǎn)表面活性劑的能力十分穩(wěn)定。表明，突變株的遺傳穩(wěn)定性良好。

2.5討論

誘變是一種提高生物表面活性劑產(chǎn)量的常用方法。

圖4　突變株的遺傳穩(wěn)定性Fig.4　Genetic stability of mutants

Mulligan等[18]使用紫外線誘變的枯草芽孢桿菌ATCC 21332突變株的生物表面活性劑產(chǎn)量超過野生型3倍以上。Iqbal等[19]使用γ-射線誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌EBN-8突變株的烴乳化/轉(zhuǎn)換活性是原始菌株的3～4倍。Tahzibi等[20]利用N-甲基-N-硝基亞硝基胍誘變的銅綠假單胞菌突變株可產(chǎn)生比原始菌株多10倍的鼠李糖脂。Shabtai等[21]利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)誘導(dǎo)的不動(dòng)桿菌RAG-1突變株產(chǎn)高分子乳化劑Emulsan的水平明顯升高。Koch等[22]利用轉(zhuǎn)座子Tn5轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌PG201突變株可以產(chǎn)生比親本高2倍的生物表面活性劑。Ohno等[23]制備的含有重組質(zhì)粒pC112的枯草芽孢桿菌MI113產(chǎn)生的生物表面活性劑是枯草芽孢桿菌RB14的8倍。與上述誘變方法相比，本實(shí)驗(yàn)使用的ARTP誘變方法在誘變效果方面并不是最突出的，但該法有效(超過20%的突變率)、快速(僅需幾分鐘)、方便(不需要特別處理)和環(huán)保(不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì))。迄今為止還沒有利用ARTP技術(shù)來提高紅球菌所產(chǎn)生物表面活性劑產(chǎn)量的報(bào)道。本研究拓寬了ARTP技術(shù)的應(yīng)用范圍，證實(shí)ARTP技術(shù)可以很好地應(yīng)用于紅球菌SY095的誘變(誘變率高于20%)，為提高生物表面活性劑產(chǎn)量提供了一種新的快速便捷的手段。

針對(duì)不同菌種，ARTP技術(shù)所引起的突變方式非常多樣，多數(shù)突變子都出現(xiàn)了快速生長(zhǎng)現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中，突變株在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，生長(zhǎng)速度明顯快于野生型菌株，而生物表面活性劑與菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，因此突變株發(fā)酵液的生物表面活性也相應(yīng)提高。

菌株退化是誘變過程中常發(fā)生的問題，退化的原因通常分為外部原因和內(nèi)部原因，外部原因主要是環(huán)境的變化，內(nèi)部原因是菌株自身的變化。連續(xù)培養(yǎng)往往是菌株活性降低的直接原因。本實(shí)驗(yàn)中，突變株在經(jīng)過連續(xù)多代培養(yǎng)后仍可很好地保持活性的穩(wěn)定；放大到50 L發(fā)酵罐時(shí)，突變株發(fā)酵液的表面張力仍可以達(dá)到28.16 mN·m-1。表明，突變株具有穩(wěn)定的突變效應(yīng)，可以作為生產(chǎn)菌株應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

3　結(jié)論

利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)誘變紅球菌SY095，通過排油圈法與表面張力測(cè)定篩選出2株高產(chǎn)突變株220-7與300-3。與同期培養(yǎng)的野生型菌株相比，突變株220-7與300-3發(fā)酵液的最佳表面張力分別降至32.8 mN·m-1與28.6 mN·m-1，發(fā)酵液的最佳表面活性分別提高14.4%和25.3%。連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這2株突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

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HAO Jian-an,ZHANG Xiao-qing,JIANG Tian-xiang,YANG Bo,SI Xiao-guang,DU Jin,ZHANG Ai-jun,ZHANG Yu-shan,WANG Jing

(InstituteofSeawaterDesalinationandMultipurposeUtilization,SOA,Tianjin300192,China)

Throughoilspreadingmethodanddeterminationofsurfacetension,twohigh-yieldbiosurfactant-producingmutants220-7and330-3werescreenedfromthestrainRhodococcussp.SY095byatmosphericandroomtemperatureplasmamutation.Comparedwiththewildstrain,theoptimalsurfacetensionsoffermentationbrothofmutants220-7and300-3reducedto32.8mN·m-1and28.6mN·m-1,respectively,andtheoptimalsurfaceactivitiesoffermentationbrothoftwomutantsincreased14.4%and25.3%,respectively.Continuouspassageexperimentconfirmedthesetwomutantshadgoodgeneticstabilities.

atmosphericandroomtemperatureplasma;Rhodococcussp.SY095;biosurfactant

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201305022-5)，國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21406042)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(K-JBYWF-2015-T11)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(K-JBYWF-2015-G16)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.006

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