張　楠，方祥位，洛桑銀巴，李　捷，歐益希，高菱悅

(1.后勤工程學(xué)院 國(guó)防建筑規(guī)劃與環(huán)境工程系，重慶 401311；2.后勤工程學(xué)院 軍事土木工程系，重慶401311；3.95526部隊(duì),西藏 拉薩 850000；4.91241部隊(duì)，廣西 桂平 537200；5.93668部隊(duì)，北京 100005)

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一株固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌的特性研究

張楠1，方祥位2，洛桑銀巴3，李捷2，歐益希4，高菱悅5

(1.后勤工程學(xué)院 國(guó)防建筑規(guī)劃與環(huán)境工程系，重慶 401311；2.后勤工程學(xué)院 軍事土木工程系，重慶401311；3.95526部隊(duì),西藏 拉薩 850000；4.91241部隊(duì)，廣西 桂平 537200；5.93668部隊(duì)，北京 100005)

將一株具有分解尿素能力的巴斯德芽孢桿菌在不同溫度、pH值、NaCl濃度下培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定脲酶活性探討其最適生長(zhǎng)條件；而后將最適生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)的菌懸液用于珊瑚砂固化實(shí)驗(yàn)，研究其固化珊瑚砂的能力。結(jié)果表明，該巴斯德芽孢桿菌最適生長(zhǎng)條件為：溫度30～33 ℃、pH值8.0、NaCl濃度20 g·L-1；將其用于固化珊瑚砂，可使松散的珊瑚砂顆粒膠結(jié)形成具有一定強(qiáng)度的砂柱，但受模具限制和砂柱固化過(guò)程中滲透性的影響，砂柱各部分固化強(qiáng)度不一致。

巴斯德芽孢桿菌；珊瑚砂；固化；特性

珊瑚砂是熱帶海洋中的一種疏松多孔、質(zhì)脆易碎的特殊巖土介質(zhì)，主要由珊瑚碎屑和其它海洋生物碎屑組成，碳酸鈣含量高達(dá)96%以上[1]。近年來(lái)，我國(guó)加大了對(duì)海洋石油、漁業(yè)資源的開(kāi)發(fā)以及國(guó)防現(xiàn)代化的建設(shè)，迫切需要建設(shè)大型的珊瑚島礁工程。用傳統(tǒng)的土壤(砂土)固化方法(化學(xué)固化和物理固化)固化遠(yuǎn)離陸地的珊瑚砂時(shí)，會(huì)遇到機(jī)械設(shè)備匱乏、原材料運(yùn)輸困難、施工環(huán)境差、破壞島礁生態(tài)環(huán)境等問(wèn)題，而微生物固化能夠克服這些缺點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的土壤固化方法。

微生物固化是自然界廣泛發(fā)生的一種作用[2]。微生物礦物學(xué)最新研究表明，巖土中某些特定的微生物可利用尿素等有機(jī)物及鈣離子源，較快地生成具有膠凝作用的碳酸鈣，使松散砂土固化成為可能[3-9]。目前，對(duì)普通砂(硅砂)的微生物固化已取得一定進(jìn)展，但對(duì)遠(yuǎn)離陸地、處于特殊環(huán)境(高含鹽量海水)下的珊瑚砂的微生物固化需考慮鹽度高、溫差大等海洋環(huán)境因素，鮮有研究。

鑒于此，作者以固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌為對(duì)象，研究該菌在不同環(huán)境下的生長(zhǎng)特性，探討其最適生長(zhǎng)溫度、pH值、NaCl濃度，初步考察其對(duì)珊瑚砂的固化能力，擬為珊瑚砂的微生物固化提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1菌種與培養(yǎng)基

巴斯德芽孢桿菌(Bacilluspasteurii)，購(gòu)于德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ)。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母浸出粉1 g，NaCl 2 g，蒸餾水定容至100 mL，2 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，121 ℃高溫蒸汽滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基需加入2 g瓊脂粉。

LB-尿素液體培養(yǎng)基：在上述LB液體培養(yǎng)基滅菌30 min后，加入2 g尿素。LB-尿素固體培養(yǎng)基需加入2 g瓊脂粉。

1.2菌懸液的制備

采用濕重法配制菌懸液：將巴斯德芽孢桿菌置于LB固體培養(yǎng)基上復(fù)活，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基上，32 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)36 h，7 000 r·min-1離心5 min，去上清，稱菌體濕重，用0.85%的無(wú)菌生理鹽水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的菌懸液。

1.3珊瑚砂固化細(xì)菌的生長(zhǎng)特性研究

1.3.1溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

微生物生長(zhǎng)的溫度范圍通常很寬，但有一個(gè)最適生長(zhǎng)溫度或范圍。

1)適宜菌株生長(zhǎng)的溫度范圍的確定

將巴斯德芽孢桿菌分區(qū)劃線于LB平板上，分別置于20 ℃、30 ℃、40 ℃和50 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小和數(shù)量，確定適宜菌株生長(zhǎng)的溫度范圍。

2)菌株最適生長(zhǎng)溫度的確定

在上述溫度范圍內(nèi)，選取適當(dāng)?shù)臏囟?，?.2 mL菌懸液加入100 mL的LB-尿素液體培養(yǎng)基中，于生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。采用DDS-307A型電導(dǎo)率儀(上海佑科儀器儀表有限公司)測(cè)定未加菌懸液時(shí)的初始電導(dǎo)率和培養(yǎng)48 h后的電導(dǎo)率，計(jì)算電導(dǎo)率變化值△K(以△K表征菌株的脲酶活性)，確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度(同時(shí)做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，下同)。

1.3.2pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

用2 mol·L-1的鹽酸或2 mol·L-1的NaOH溶液將100 mL LB-尿素液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，加入菌懸液0.2 mL，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定未加菌懸液時(shí)的初始電導(dǎo)率和培養(yǎng)48 h后的電導(dǎo)率，計(jì)算電導(dǎo)率變化值△K，確定菌株的最適生長(zhǎng)pH值。

1.3.3NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

1)適宜菌株生長(zhǎng)的NaCl濃度范圍的確定

在100 mL LB-尿素液體培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量的NaCl，使培養(yǎng)基中NaCl濃度(g·L-1)分別為5、25、50、75、100，加入菌懸液0.2 mL，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定未加菌懸液時(shí)的初始電導(dǎo)率和培養(yǎng)48 h后的電導(dǎo)率，計(jì)算電導(dǎo)率變化值△K，確定適宜菌株生長(zhǎng)的NaCl濃度范圍。

2)菌株最適生長(zhǎng)NaCl濃度的確定

在上述NaCl濃度范圍內(nèi)適當(dāng)縮小考察范圍，配制不同NaCl濃度的培養(yǎng)基，并加入0.2 mL菌懸液，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定未加菌懸液時(shí)的初始電導(dǎo)率和培養(yǎng)48 h后的電導(dǎo)率，計(jì)算電導(dǎo)率變化值△K，確定菌株生長(zhǎng)的最適NaCl濃度。

1.4珊瑚砂的微生物固化研究

1.4.1原理

產(chǎn)脲酶微生物可以利用環(huán)境中的尿素和鈣離子源，較快地生成具有膠凝作用的碳酸鈣。與一般化學(xué)作用生成的碳酸鈣不同，這種微生物成因的碳酸鈣材料的生成速度及強(qiáng)度可控，并可作為粘結(jié)劑將松散的砂粒粘結(jié)成強(qiáng)度及滲透性可控的人造砂礫石。

巴斯德芽孢桿菌固化珊瑚砂的原理如下[10-11]：

Ca2++cell(帶負(fù)電的微生物細(xì)胞)→cell-Ca2+

1.4.2固化過(guò)程

固化前準(zhǔn)備：(1)將巴斯德芽孢桿菌加入pH值為8.0的LB-尿素液體培養(yǎng)基上，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，備用；(2)用孔徑為3.2 mm的檢驗(yàn)篩對(duì)珊瑚砂進(jìn)行篩分；(3)配制相同濃度、體積比為1∶1的尿素-氯化鈣混合溶液作為粘結(jié)液；(4)用50 mL一次性注射器(內(nèi)徑3 cm、高11.5 cm)作為模具，按生化纖維棉-珊瑚砂-生化纖維棉依次鋪設(shè)(圖1)。

圖1　珊瑚砂的微生物固化實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1　Equipment for biocementation of coral sand

固化：加入菌懸液，讓其流過(guò)模具，使珊瑚砂充分截留細(xì)菌；加入粘結(jié)液；調(diào)節(jié)止水夾，控制粘結(jié)液以低流速流出模具，使粘結(jié)液與截留在珊瑚砂柱中的細(xì)菌充分反應(yīng)，直至粘結(jié)液不再滲出；取下模具，置于恒溫烘箱中烘干；取出珊瑚砂柱，觀察固化效果。

2　結(jié)果與討論

2.1珊瑚砂固化細(xì)菌的生長(zhǎng)特性

2.1.1最適生長(zhǎng)溫度

將巴斯德芽孢桿菌分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃和50 ℃下培養(yǎng)48 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株在20 ℃、30 ℃和40 ℃下生長(zhǎng)較好，其中在30 ℃時(shí)的菌株個(gè)體形態(tài)最大，而50 ℃下肉眼幾乎看不見(jiàn)單菌落。因此，選擇適宜菌株生長(zhǎng)的溫度范圍為20～40 ℃。

為確定最適生長(zhǎng)溫度，分別在24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃和39 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定電導(dǎo)率，并計(jì)算電導(dǎo)率變化值△K，考察溫度對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　溫度對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響Fig.2　Effect of temperature on bacterial urease activity

由圖2可見(jiàn)，隨著溫度的升高，△K先增大后減小，在30～33 ℃時(shí)△K達(dá)到最大值9.2；且24～30 ℃時(shí)的△K增大趨勢(shì)明顯比33～39 ℃的減小趨勢(shì)緩和。表明，24～33 ℃比33～39 ℃更有利于巴斯德芽孢桿菌生長(zhǎng)，而30～33 ℃最適宜巴斯德芽孢桿菌生長(zhǎng)。因此，確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30～33 ℃。

2.1.2最適生長(zhǎng)pH值

pH值對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3　pH值對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響Fig.3　Effect of pH value on bacterial urease activity

由圖3可見(jiàn)，隨著pH值的升高，△K先增大后減小，在pH值為8.0時(shí)△K達(dá)到最大值12.9。因此，確定菌株的最適生長(zhǎng)pH值為8.0。

2.1.3最適生長(zhǎng)NaCl濃度

在不同NaCl濃度的培養(yǎng)基中加入菌懸液，于32 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，考察NaCl濃度對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　NaCl濃度對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響Fig.4　Effect of NaCl concentration on bacterial urease activity

由圖4可見(jiàn)，隨著NaCl濃度的增加，△K先快速增大后緩慢減小，在NaCl濃度為25 g·L-1時(shí)達(dá)到最大值12.8；且在20～60 g·L-1范圍內(nèi)的△K均較大。因此，選擇20～60 g·L-1為適宜菌株生長(zhǎng)的NaCl濃度范圍。

為確定菌株的最適生長(zhǎng)NaCl濃度，分別在NaCl濃度(g·L-1)為20、30、40、50、60的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，考察NaCl濃度對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，當(dāng)NaCl濃度從20 g·L-1逐漸增加到60 g·L-1時(shí)，△K逐漸減小，在NaCl濃度為20～

圖5　最適生長(zhǎng)NaCl濃度的確定Fig.5　Determination of optimal NaCl concentration

50 g·L-1時(shí)，△K減幅較小；在NaCl濃度超過(guò)50 g·L-1后，△K減幅明顯增大。因此，確定菌株生長(zhǎng)的最適NaCl濃度為20 g·L-1。

2.2珊瑚砂的微生物固化效果

經(jīng)過(guò)72 h固化，將砂柱模具烘干，取出珊瑚砂柱(圖6)，觀察固化效果。

圖6　微生物固化珊瑚砂柱Fig.6　Biocementation column of coral sand

為了便于砂柱直立，圖中砂柱與在模具中實(shí)際固化時(shí)的方向相反。由圖6可見(jiàn)，通過(guò)多次澆注固化，原本松散的珊瑚砂顆粒最終膠結(jié)形成具有一定強(qiáng)度的砂柱。砂柱的下半部分(實(shí)際位于模具中的上半部)明顯更加密實(shí)、紋路更少、空隙更小，固化效果更好。這可能是因?yàn)?，加入菌懸液時(shí)，上半部快速反應(yīng)并固化，使得上半部的珊瑚砂空隙變小，降低了粘結(jié)液在砂柱中的滲透性，導(dǎo)致下半部因碳酸鈣含量不足而使砂柱強(qiáng)度降低。因此，為獲得密實(shí)而均勻的珊瑚砂柱，須在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)并完善模具，以提高珊瑚砂柱的固化強(qiáng)度。

3　結(jié)論

通過(guò)測(cè)定脲酶活性，確定巴斯德芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)條件為：溫度30～33 ℃、pH值8.0、NaCl濃度20 g·L-1。將巴斯德芽孢桿菌在上述最適生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)后，用于珊瑚砂固化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)多次澆注固化后，松散的珊瑚砂顆粒最終膠結(jié)形成具有一定強(qiáng)度的砂柱，但受模具限制和砂柱固化過(guò)程中滲透性影響，砂柱各部分固化強(qiáng)度不一致。因此，為獲得密實(shí)而均勻的珊瑚砂柱，須在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)并完善模具，提高珊瑚砂柱的固化強(qiáng)度。該研究具有重要的工程實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

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Characteristics of aBacilluspasteuriiStrain for Cementation of Coral Sand

ZHANG Nan1,FANG Xiang-wei2,LUOSANG Yin-ba3,LI Jie2,OU Yi-xi4,GAO Ling-yue5

(1.DepartmentofNationalDefenseArchitecturePlanning&EnvironmentalEngineering,LogisticEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;2.DepartmentofCivilEngineering,LogisticEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;3.Unit95526,Lhasa850000,China;4.Unit91241,Guiping537200,China;5.Unit93668,Beijing100005,China)

TheoptimumgrowthconditionsofaBacillus pasteuriistrainthathadtheabilitytodecomposeureawerestudiedbymeasuringtheureaseactivityatdifferenttemperatures,pHvaluesandNaClconcentrations.TestsofcementationofcoralsandbyBacillus pasteuriiculturedundertheoptimumgrowthconditionswereconducted.Resultsindicatedthat,theoptimumgrowthconditionsofBacillus pasteuriiwereasfollows:temperatureof30～33 ℃,pHvalueof8.0,andNaClconcentrationof20g·L-1.AfterbiocementationofcoralsandbyBacillus pasteuriiculturedundertheoptimumgrowthconditions,loosecoralsandparticleswerebondedtoformsandcolumnswithcertainstrength.Duetothelimitationsoftestmouldandpermeabilityofsandcolumnincementingprocess,thestrengthsofdifferentpartsofsolidifiedsandcolumnwereinconsistent.

Bacillus pasteurii;coralsand;cementation;characteristics

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51479208，11272354)，總后勤部基建營(yíng)房部資助項(xiàng)目(CY114C022)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.005

X 172TU 411

A

1672-5425(2016)10-0023-04

張楠，方祥位，洛桑銀巴，等.一株固化珊瑚砂的巴斯德芽孢桿菌的特性研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(10)：23-26.