厲志昂，王亞旭，黃勇

（重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，重慶400010）

CYP3A5和VEGFR3基因多態(tài)性對舒尼替尼治療胃腸道間質(zhì)瘤的影響

厲志昂，王亞旭△，黃勇

（重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，重慶400010）

目的探討細(xì)胞色素P4503A5（CYP3A5）和血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR3）基因多態(tài)性對舒尼替尼治療胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）的影響。方法收集2013年8月至2014年8月該院胃腸外科住院手術(shù)治療的25例GIST患者肘靜脈外周血標(biāo)本，采用聚合酶鏈反應(yīng)測序?qū)YP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826的基因序列進(jìn)行檢測，術(shù)后因應(yīng)用伊馬替尼耐藥或不能耐受或基因檢測表明舒尼替尼敏感而應(yīng)用舒尼替尼治療，并隨訪跟蹤療效及不良反應(yīng)。結(jié)果25例患者中VEGFR3基因rs307826 AG型僅2例（8.0%），AA型23例（92.0%），未發(fā)現(xiàn)GG型；AA型患者疾病控制率明顯高于AG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher=8.696，P=0.033 0）；rs307826位點(diǎn)基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險(xiǎn)度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關(guān)（P＞0.05）。25例患者中CYP3A5基因rs776746 AG型12例（48.0%），GG型13例（52.0%），未發(fā)現(xiàn)AA型；GG型患者不良反應(yīng)明顯輕于AG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher=8.901，P=0.012 0）；rs776746位點(diǎn)基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險(xiǎn)度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論舒尼替尼治療GIST可明顯提高大部分患者疾病控制率。檢測CYP3A5基因多態(tài)性對GIST的個體化治療及不良反應(yīng)的預(yù)防和處理具有重要意義。

胃腸腫瘤；間皮瘤；多態(tài)性，單核苷酸；基因型；舒尼替尼

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是一組來源于胃腸道間葉源性腫瘤，國內(nèi)發(fā)病率為百萬分之一至二，但在消化道間葉腫瘤中占有及其重要的地位。分子水平研究使人們進(jìn)一步深入認(rèn)識了GIST，GIST發(fā)生因素中最為關(guān)鍵的是c-kit基因及血小板源性生長因子受體基因突變［1-3］。酪氨酸激酶抑制劑——伊馬替尼、蘋果酸舒尼替尼膠囊（索坦）等靶向治療藥物的應(yīng)用極大提高了GIST的療效。

基因多態(tài)性是指一個生物群體中存在多種不連續(xù)的基因型。有研究表明，基因多態(tài)性可影響不同個體對疾病的易感性、藥物不良反應(yīng)和療效［4］。腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的高表達(dá)密切相關(guān)。VEGF受體3（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR3）是VEGFR中的一種，主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，其信號通路在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤淋巴管形成等方面具有重要意義。細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是人體內(nèi)一種與藥物代謝有關(guān)的酶，參與多種化合物的代謝包括藥物的生物轉(zhuǎn)化等，與藥物在體內(nèi)的清除密切相關(guān)，能代謝近90.0%臨床藥物［5］。CYP3A5是CYP3A的一種亞型，其表達(dá)的多態(tài)性被認(rèn)為是CYP3A活性差異的最重要因素。隨著人們對GIST認(rèn)識的逐步加深，研究基因多態(tài)性與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，目前，尚未見有關(guān)CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826多態(tài)性與舒尼替尼治療GIST的療效與不良反應(yīng)的研究。本研究回顧性分析了CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826多態(tài)性與舒尼替尼治療GIST的療效、不良反應(yīng)的關(guān)系，并希望可以為GIST的靶向治療提供更加科學(xué)、有效、個體化的臨床依據(jù)。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1資料來源收集2013年8月至2014年8月本院胃腸外科住院手術(shù)治療的25例GIST患者術(shù)后2周采集的肘靜脈血標(biāo)本，術(shù)后常規(guī)進(jìn)行病理檢查及基因檢測均證實(shí)為GIST。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)排除患有高血壓、冠心病、糖尿病等基礎(chǔ)疾病的患者。

1.1.3儀器與試劑無水乙醇、95%乙醇、CYP3A5基因rs776746引物、VEGFR3基因rs307826引物、全血DNA提取試劑盒、DNA FFPE Tissue試劑盒、Taq酶、dNTP、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀9700、海爾冰箱、渦旋混合器XW-80A、ABI3730DNA測序儀、平板離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、電泳儀JY300C、Ge1Doc凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.2方法

1.2.1治療方法25例患者中應(yīng)用伊馬替尼期間出現(xiàn)疾病進(jìn)展17例，不能耐受伊馬替尼4例（將常規(guī)劑量400 mg改為300 mg后患者仍有嚴(yán)重骨髓抑制），基因檢測c-kit外顯子9突變及野生型4例，故均采用索坦（美國輝瑞公司，批號不詳）口服，每天1次，每次50 mg，用藥28 d停藥14 d。根據(jù)患者身體耐受情況和病情程度以12.5 mg為梯度單位適當(dāng)調(diào)整劑量［6］。

1.2.2基因測序收集的外周靜脈血標(biāo)本用乙二胺四乙酸抗凝，離心，分離血細(xì)胞和血漿，于-20℃冰箱保存。提取全血基因組DNA，并對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)合成CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826位點(diǎn)的PCR引物序列（表1）。用50 mL PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火25s，72℃延伸30 s 40個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增后用瓊脂凝膠電泳，電泳完畢取出凝膠，在紫外線成像系統(tǒng)下觀察PCR檢測結(jié)果。最后進(jìn)行基因測序，使用Chromas軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1　PCR引物

1.2.3觀察指標(biāo)嚴(yán)密觀察患者血常規(guī)，肝、腎功能，心電圖和尿常規(guī)等，于第1次用藥及以后每12周復(fù)查腹部CT，并做相應(yīng)記錄。

1.2.4療效判定標(biāo)準(zhǔn)采用文獻(xiàn)［7］的標(biāo)準(zhǔn)，在第24周進(jìn)行療效評估包括完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）。主要觀察終點(diǎn)為無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）、客觀有效（CR+PR）及疾病控制（CR+PR+SD）。PFS定義為從接受第一劑量舒尼替尼至PD的時間，OS定義為從接受第一劑量舒尼替尼至死亡的時間。采用NCI標(biāo)準(zhǔn)對患者出現(xiàn)的不良反應(yīng)進(jìn)行判定及記錄。

1.2.5隨訪對出院患者進(jìn)行電話、電子郵箱、門診隨訪等，對患者出院后病情控制情況進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計(jì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)、Fisher′s精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般資料25例患者一般資料見表2。

表2　患者一般資料（n=25）

2.2基因測序結(jié)果

2.2.1VEGFR3基因rs30782625例患者中AG型2例（8.0%），AA型23例（92.0%），未發(fā)現(xiàn)GG型。

2.2.2CYP3A5基因rs77674625例患者中AG型12例（48.0%），GG型13例（52.0%），未發(fā)現(xiàn)AA型。

2.3基因位點(diǎn)多態(tài)性分析

2.3.1VEGFR3基因rs307826rs307826位點(diǎn)基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險(xiǎn)度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3　VEGFR3基因rs307826位點(diǎn)基因型與臨床特征相關(guān)性［n（%）］

2.3.2CYP3A5基因rs776746rs776746位點(diǎn)基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤危險(xiǎn)度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關(guān)（P＞0.05），見表4。

表4　CYP3A5基因rs776746位點(diǎn)基因型與臨床特征相關(guān)性［n（%）］

2.4VEGFR3基因rs307826位點(diǎn)多態(tài)性對舒尼替尼療效的影響25例患者中出現(xiàn)不同程度進(jìn)展16例，AA型患者疾病控制率明顯高于AG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher=8.696，P=0.033 0），見表5。

表5　EGFR3基因rs307826位點(diǎn)多態(tài)性與舒尼替尼療效分析

2.5CYP3A5基因rs776746位點(diǎn)多態(tài)性對舒尼替尼不良反應(yīng)的影響主要不良反應(yīng)為手足綜合征、惡心、乏力、腹瀉、血液系統(tǒng)并發(fā)癥等，GG型患者不良反應(yīng)明顯輕于AG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher=8.901，P=0.012 0）。見表6。

表6　CYP3A5基因rs776746位點(diǎn)多態(tài)性與舒尼替尼不良反應(yīng)分析

3　討論

GIST發(fā)病率雖然不高，但卻是消化道中最常見的間葉源性腫瘤，男女發(fā)病比例相差無幾（分別為55.0%、45.0%），各年齡段均可發(fā)病，發(fā)病年齡為55～60歲［8］。目前，主要以手術(shù)為主，再輔以靶向生物治療等綜合治療。隨腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展及研究，靶向治療已成為GIST不可替代的治療方式。2002年美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)伊馬替尼用于無法手術(shù)切除或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的GIST患者，目前為止仍為GIST靶向治療的一線用藥。Fujimoto等［9］研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前應(yīng)用伊馬替尼進(jìn)行新輔助治療后患者直腸GIST瘤體縮小明顯，降低了手術(shù)難度，增加了手術(shù)效果。Bamboat等［10］認(rèn)為，伊馬替尼在GIST新輔助治療方面安全、可行，且耐受性良好。但隨伊馬替尼的應(yīng)用，伊馬替尼耐藥或患者不耐受情況越來越受到重視，2006年1月FDA批準(zhǔn)舒尼替尼作為伊馬替尼耐藥或不能耐受的二線用藥。舒尼替尼對伊馬替尼耐藥或不耐受的GIST患者有效。在GIST治療中靶向治療具有更好的療效及耐受性，但靶向治療藥物的不良反應(yīng)與個體差異不容忽視。有研究表明，靶向藥物不良反應(yīng)及療效與CYP3A5基因和VEGFR3基因中某些片段的單核苷酸多態(tài)性密切相關(guān)［11］。因此，檢測這些基因多態(tài)性片段對評估舒尼替尼療效及不良反應(yīng)具有重要意義。

VEGFR3是VEGF-C特異性受體，VEGF-C與VEGFR3特異性結(jié)合，受體發(fā)生磷酸化，激活相應(yīng)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物學(xué)過程，影響腫瘤侵襲性，改變細(xì)胞基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的黏附性，為腫瘤細(xì)胞浸潤創(chuàng)造了條件［8］。有研究表明，在GIST中VEGFR與PDGFR-α表達(dá)均升高，表達(dá)強(qiáng)度隨腫瘤危險(xiǎn)度升高而升高，且VEGFR升高較PDGFR-α明顯［12］?？傊?，通過檢測VEGFR3基因單核苷酸多態(tài)性，有助于評判GIST危險(xiǎn)度及藥物療效，且根據(jù)檢測結(jié)果給予個體化用藥。

CYP3A5基因是CYP3A家族的一個亞型。Faivre等［13］認(rèn)為，CYP3A5基因突變能影響其代謝酶活性，改變代謝底物的速率和能力。在臨床用藥中這是出現(xiàn)個體差異的最重要原因之一。因此，對CYP3A5基因的研究成為解釋酶活性差異的熱點(diǎn)，導(dǎo)致藥物個體差異的重要因素之一是CYP3A5基因多態(tài)性。有研究表明，CYP3A5基因rs776746多態(tài)性可用以檢測腎細(xì)胞癌應(yīng)用舒尼替尼靶向治療過程中的藥物不良反應(yīng)，因藥物不良反應(yīng)而減量的風(fēng)險(xiǎn)與CYP3A5基因rs776746位點(diǎn)高代謝等位基因相關(guān)（危害比：3.75，95%可信區(qū)間：1.67～8.41，P= 0.001 4），rs776746位點(diǎn)GG型較AG型不容易引起藥物不良反應(yīng)［14-15］。在GIST的治療中舒尼替尼產(chǎn)生的不良反應(yīng)亦不容忽視。因此，通過檢測CYP3A5基因多態(tài)性可預(yù)測舒尼替尼治療GIST過程中的不良反應(yīng)，從而早預(yù)防及治療，為個體化治療提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，GIST患者中CYP3A5基因rs776746位點(diǎn)AG型占48.0%，GG型占52.0%，未發(fā)現(xiàn)AA型，因此，雖然GIST患者能明顯從舒尼替尼治療中受益，但其不良反應(yīng)不容忽視，應(yīng)密切觀察并及時處理。本研究還發(fā)現(xiàn)，CYP3A5基因rs776746和VEGFR3基因rs307826位點(diǎn)基因型與患者年齡、性別、腫瘤危險(xiǎn)度分級、腫瘤臨床病理類型等均無關(guān)（P＞0.05）；GIST患者中VEGFR3基因rs307826位點(diǎn)AA型占92.0%，且AA型患者疾病控制率明顯高于AG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher=8.696，P=0.033 0），表明AA型患者舒尼替尼療效較好，且大多數(shù)GIST患者為AA型，表明大多數(shù)GIST患者能從舒尼替尼治療中獲益。GG型患者不良反應(yīng)明顯輕于AG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher=8.901，P=0.012 0）。上述研究結(jié)果在舒尼替尼治療腎癌中亦有相似結(jié)論［15］。本研究未發(fā)現(xiàn)CYP3A5基因rs776746 AA型和VEGFR3基因rs307826 GG型，這2種基因型可能不是GIST患者突變熱點(diǎn)。

綜上所述，GIST患者能明顯從舒尼替尼治療中獲益，但藥物不良反應(yīng)是不容忽視的，因此，檢測CYP3A5基因rs776746位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性能提早預(yù)防及治療舒尼替尼不良反應(yīng)，對個體化治療及預(yù)防具有重要意義，盡量避免因其不良反應(yīng)而導(dǎo)致減量或停藥。當(dāng)然，該結(jié)論尚有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Influence of CYP3A5 and VEGFR-3 gene polymorphism on sunitinib treatment of gastrointestinal stromal tumors

Li Zhiang，Wang Yaxu△，Huang Yong
（Department of Gastrointestinal Surgery，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical U-niversity，Chongqing 400010，China）

ObjectiveTo investigate the influence of cytochrome P4503A5（CYP3A5）and vascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）gene polymorphism on the sunitinib treatment in gastrointestinal stromal tumors（GIST）.Methods The elbow venous peripheral blood sample was taken for detecting the gene sequence of rs776746 polymorphisms of CYP3A5 gene and rs307826 polymorphisms of VEGFR3 gene by PCR direct sequencing.Sunitinib was used due to imatinib resistance after operation，or unable tolerance or sunitinib sensitivity indicated by gene detection.The curative effect and adverse reactions were fol lowed up and tracked.ResultsAmong 25 cases，only 2 case（8.0%）were rs307826 type of VEGFR3 gene，23 cases（92.0%）were AA type and GG type was not found；the disease control rate of AA type was significantly higher than that of AG type，the difference was statistically significant（Fisher=8.696，P=0.033）；rs307826 site genotype had no relation with the age，sex，tumor site，tumorriskgrade andtumorclinicopathologicaltype（P＞0.05）.Among25 cases，12 cases（48.0%）were rs776746 AG type of CYP3A5 gene，13 cases（52.0%）were GG type and AA type was not found；the adverse reactions in the patients with GG type were significantly slighter than those in AG type，the difference was statistically significant（Fisher=8.901，P=0.012 0）；rs776746 site genotype had no relation with the age，sex，tumor site，tumor risk grade and tumor clinicopathological type（P＞0.05）.ConclusionThe sunitinib treatment of GIST can elevate the disease control rate in the majority of patients.Detecting the polymorphism of CYP3A5 gene has an important significance to the individualized therapy，prevention and treatment of adverse reactions in GIST.

Gastrointestinal neoplasms；Mesothelioma；Polymorphism，single nucleotide；Genotype；Sunitinib

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.010

A

1009-5519（2016）12-1806-04

厲志昂（1991-），碩士研究生，主要從事胃腸道間質(zhì)瘤的研究與治療。

△，E-mail：408861993@qq.com。

（2016-03-01）