張　博　方險峰　安永濤

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·論著·

雷公藤多苷對狼瘡鼠肝腎組織中11β-羥基類固醇脫氫酶的影響

張博1方險峰2安永濤1

目的：明確雷公藤多苷對MRL/lpr狼瘡小鼠肝臟組織中11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)和腎組織中11β-羥基類固醇脫氫酶2(11β-HSD2)表達(dá)的影響。方法：將14只MRL/lpr狼瘡鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組8只給予雷公藤多苷15 mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)15天，其余6只作為空白對照。免疫組化、RT-PCR分別檢測11β-HSD的IOD值和mRNA的表達(dá)。結(jié)果：實驗組中11β-HSD1的IOD和mRNA分別為1.03±0.05和1.55±0.09，高于對照組的0.83±0.04和1.23±0.07，(P<0.05)；實驗組中11β-HSD2的IOD和mRNA為0.86±0.06和1.10±0.04低于對照組中的0.90±0.05和1.15±0.06)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：雷公藤多苷可誘導(dǎo)肝臟中11β-HSD1的表達(dá)。

雷公藤多苷；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；11β-羥基類固醇脫氫酶

雷公藤多苷是中藥雷公藤的提取物，由于其能夠興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸，使下丘腦、垂體及腎上腺皮質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如皮質(zhì)的增厚、束狀帶細(xì)胞的肥大、增生，從而引起功能增強，產(chǎn)生類激素樣作用[1]，是臨床上治療SLE的常用藥物，療效肯定。以往的研究主要認(rèn)為與其刺激皮質(zhì)醇分泌、提升糖皮質(zhì)激素受體水平有關(guān)，而對體內(nèi)糖皮質(zhì)激素代謝的關(guān)鍵酶11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-HSD)的表達(dá)有無影響則未見相關(guān)報道，本文從動物實驗入手，探討雷公藤多苷對11β-HSD在特異性器官中的表達(dá)是否有影響。

1　實驗材料

1.1動物MRL/lpr狼瘡雌性小鼠14只，14～22周齡，體重42～50 g,購于上海實驗動物中心，飼養(yǎng)在清潔動物房中。

1.2材料雷公藤多苷藥粉(江蘇美通制藥有限公司，生產(chǎn)批號080525)，羊抗鼠11β-HSD1、11β-HSD2一抗(圣克魯斯生物技術(shù)公司)，生物素標(biāo)記兔抗羊二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，防脫片劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，TRIzol(碧云天生物技術(shù)公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI Fermentas)，7300美國ABI進(jìn)口實時熒光定量PCR擴增儀，生物顯微鏡PH100(深圳西派克光學(xué)儀器有限公司)。

2　實驗方法

2.1動物實驗將14只MRL/lpr雌性小鼠隨機分為A、B兩組，A組8只按15 mg/kg劑量的雷公藤多苷融于0.5%羧甲基纖維素鈉給鼠進(jìn)行灌胃，每天1次共15天。B組6只使用等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，作為空白對照組。15天后處死小鼠，取出其肝臟及腎臟，置于標(biāo)本保存液中冷凍保存，待用。

2.2免疫組化檢測將收集的小鼠肝腎組織置于4℃丙酮中固定12 h，石蠟包埋。切片、脫臘、抗原熱修復(fù)后，采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，依次經(jīng)過3%氧化氫孵育、0.5% TritonX-100破膜、血清封閉、一抗孵育(此步驟中肝臟組織切片中加入的是羊抗鼠11β-HSD1一抗，腎臟組織切片中則加入羊抗鼠11β-HSD2一抗)、二抗孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、水洗，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。每張細(xì)胞涂片隨機選取5個高倍顯微鏡下視野，采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件讀取數(shù)據(jù)，分別測定每個視野中積分光密度IOD值，最終以平均IOD值表示。

2.3定量Rt-PCR檢測①取出冰凍的肝腎組織10 g，加入TRIzol提取總RNA，完全按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，將組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。②使用上海生工生物工程有限公司合成的11β-HSD1引物對肝臟中的11β-HSD1進(jìn)行擴增，上游引物:5'-GCAGAGCGATTTGTTGTT-3'，下游引物:5'-TGTCTATGAAGCCGAGGA-3'。使用大連寶生物工程有限公司合成的11β-HSD2引物對腎臟中11β-HSD2進(jìn)行擴增，上游引物:5'-GACCTTAGCCCCGTTGTA-3'，下游引物:5'-GGCAGGTAGTGGTGGATG-3'。以β-actin為內(nèi)參照，上游引物:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物:5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。③用ABI7300美國進(jìn)口實時熒光定量PCR擴增儀進(jìn)行PCR擴增，按照熒光定量PCR擴增試劑盒說明書進(jìn)行操作。擴增條件:預(yù)變性95℃ 30 s；PCR反應(yīng)95℃ 5 s、60℃ 30 s，共30周期。擴增后進(jìn)行熔解曲線分析，監(jiān)測并收集熒光信號，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，使用2-△△Ct法計算各標(biāo)本目的基因的相對表達(dá)量。

3　結(jié)果

3.1雷公藤多苷的治療作用實驗過程中，可以觀察到A組小鼠的食欲不佳、活動度低下以及毛發(fā)脫落現(xiàn)象在隨著藥物的使用后有所改善，實驗結(jié)束后測其尿蛋白為(2.20±1.13)mg/24 h，明顯低于對照組的(4.01±2.02)mg/24 h。

3.2雷公藤多苷對肝細(xì)胞中11β-HSD1表達(dá)的影響光鏡下11β-HSD1被染成棕黃色(圖1、2)，主要分布于肝細(xì)胞的胞內(nèi)，分析后發(fā)現(xiàn)治療組小鼠肝臟組織中11β-HSD1的表達(dá)要高于空白對照組，差異明顯。免疫熒光PCR定量檢測發(fā)現(xiàn)， 表達(dá)也高于空白對照組，P<0.05，與11β-羥基類固醇脫氫酶的高表達(dá)是一致的，提示雷公藤多苷可以誘導(dǎo)狼瘡小鼠肝臟組織中11β-HSD1的表達(dá)(表1)。

表1　雷公藤多苷對狼瘡大鼠肝腎組織中11β-HSD表達(dá)的影響

注：A、B組相比肝臟中P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，腎臟中P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義

圖1、2　肝臟組織中的11β-HSD1(免疫組化，×40)

3.3雷公藤多苷對腎臟細(xì)胞中11β-HSD2表達(dá)的影響 被染成棕黃色的11β-HSD2主要分布于腎臟細(xì)胞的胞內(nèi)(圖3、4)，治療組小鼠腎臟組織中11β-HSD2的表達(dá)稍低于空白對照，但差異不明顯。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，治療腎臟組織中11β-HSD2 mRNA的表達(dá)同樣稍低于空白對照組，P>0.05，差異不明顯，提示雷公藤多苷對狼瘡鼠腎臟中11β-HSD2的表達(dá)無影響(表1)

圖3、4腎臟組織中的11β-HSD1(免疫組化×40)

4　討論

11β-HSD為體內(nèi)糖皮質(zhì)激素代謝的關(guān)鍵酶，有兩種亞型，11β-HSD1可將無活性的可的松轉(zhuǎn)化為有活性的氫化可的松，其中肝臟組織表達(dá)最高，相關(guān)研究表明其活性及分泌異常與代謝綜合征、肥胖癥、胰島素抵抗、高血壓等疾病相關(guān)[2]；11β-HSD2主要分布于腎臟組織中，具有滅活皮質(zhì)醇、保持腎臟對鹽皮質(zhì)激素敏感的特異性作用，與潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等疾病有關(guān)系[3]。

既往研究證實雷公藤多苷具有類糖皮質(zhì)激素樣作用，可刺激下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)，可以增加皮質(zhì)醇的分泌[4]，提升糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)等[5]，提示雷公藤可從不同環(huán)節(jié)提升內(nèi)源性激素效應(yīng)。11β-HSD1/2是糖皮質(zhì)激素代謝關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇/皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化，雷公藤的擬激素作用是否與此有關(guān)，尚未見報道。

本實驗發(fā)現(xiàn)，雷公藤灌胃后肝臟11β-HSD1在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均有顯著提高，提示其擬激素作用包含對皮質(zhì)醇/皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)，提升細(xì)胞內(nèi)皮質(zhì)醇含量，臨床治療過程中，聯(lián)合用藥有助于降低激素用量，減輕其不良反應(yīng)[6,7]。

SLE患者都有不同程度的腎損害，原因為沉積于腎臟組織中的免疫復(fù)合物引起炎癥反應(yīng)所致，本實驗研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷對腎臟組織中11β-HSD2的表達(dá)影響不明顯。因此，雷公藤對內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素代謝的影響主要是通過增加皮質(zhì)醇的分泌、增強糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)、提升肝臟11β-HSD1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平方面實現(xiàn)的。

[1] 李樂真,陳芍藥,譚宮屏,等.雷公藤提取物對垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的影響[J].中成藥研究,1983,10:23-24.

[2] 崔同軍,葉磊,辛婧.11β-羥基類固醇脫氫酶通過改變糖皮質(zhì)激素活性參與機體多個病理環(huán)節(jié)[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(1):40-42.

[3] 陳曉琳,王麗娜,王興友.11β-羥基類固醇脫氫酶2與炎性疾病的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(12):1769-1772.

[4] 茆文杰,陳龍.雷公藤與下丘腦-垂體-腎上腺軸關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國臨床藥學(xué),2009,18(2):120-122.

[5] 劉毅,葉松柏,金彰紅.雷公藤多苷對糖皮質(zhì)激素受體的影響研究[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2000,15(2):4-6.

[6] Stimson RH, Walker BR. Glucocorticoids and 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in obesity and the metabolic syndrome[J]. Minerva Endocrinol,2007,32:141-159.

[7] 王興友,陳杭薇,錢桂生.11β-羥基類固醇脫氫酶的研究[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(24):1050-1051.

(收稿：2015-11-15修回：2016-02-15)

Effect of tripterygium glycosides on the expression of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase in liver and kidney of MRL/lpr mice

ZHANGBo1,FANGXianfeng2,ANYongtao1.

1.GuangxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Nanning530000,China; 2.RuiKangAffiliatedHospitalofGuangxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Nanning530000,China

Correspondingauthor:FANGXianfeng,E-mail:fxf777@qq.com

Objective: To determine the effects of tripterygium glycosides (TG) on the expression of 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase1 (11β-HSD1) in liver and 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase2 (11β-HSD2) in kidney of MRL/lpr mice. Methods: Fourteen MRL/lpr mice were randomly divided into two groups. Eight mice in the experimental group were given TG, 15 mg/kg, once a day, for 15 days. Six mice were used as blank controls. The expression of 11β-HSD1 and 11β-HSD2 was detected by immunohistochemistry and PCR. Results: The IOD and mRNA of 11β-HSD1 in the experimental group were 1.03±0.05 and 1.55±0.09, which was higher than those in the control group (0.83±0.04 and 1.23±0.07), with a significant difference (P<0.05). The IOD and mRNA of 11β-HSD2 in the experimental group were 0.86±0.06 and 1.10±0.045, which was lower than those in the control group (0.90±0.05 and 1.15±0.06), with no significant difference (P>0.05). Conclusion: Tripterygium glycosides can induce the expression of 11β-HSD1 in liver.

tripterygium glycosides; systemetic lupus erythematosus; 11β-hydroxysteroid dehydrogenase

國家自然科學(xué)基金(編號：81260593)

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧，530000

2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧，530000

方險峰，E-mail：fxf777@qq.com

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金

(編號：2012GXNSFAA053101)

廣西壯族自治區(qū)教育廳科研項目(編號：201203YB105)