閆小宇，董　喆，王沙沙，周亞麗，蘇鵬飛，袁春龍*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

不同葡萄品種多酚氧化酶酶學(xué)特性比較

閆小宇，董喆，王沙沙，周亞麗，蘇鵬飛，袁春龍*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

以歐美種葡萄 “關(guān)口”、“金手指”、“黃密”3 個(gè)品種和歐亞種葡萄 “澤香”、“無(wú)核白”2 個(gè)品種為實(shí)驗(yàn)材料，比較了5 個(gè)不同葡萄品種間多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）以鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、兒茶素、咖啡酸為底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、vmax/Km值，并比較了酶的最適pH值、最適溫度、熱穩(wěn)定性、以及抑制劑對(duì)酶活性的影響。結(jié)果表明：測(cè)定的5 個(gè)品種中，歐美種葡萄和歐亞種葡萄對(duì)鄰苯二酚的親和力存在顯著性差異，對(duì) 4-甲基兒茶酚、兒茶素、咖啡酸的親和力無(wú)顯著性差異；歐美種葡萄和歐亞種葡萄對(duì)鄰苯二酚的催化效率存在顯著性差異，對(duì)4-甲基兒茶酚的催化效率無(wú)顯著性差異，“關(guān)口”葡萄對(duì)兒茶素和咖啡酸的催化效率明顯高于其他4 個(gè)葡萄品種。焦亞硫酸鹽和抗壞血酸對(duì)5 種葡萄PPO活性都有強(qiáng)的抑制作用，焦亞硫酸鹽對(duì)其他4 個(gè)品種葡萄的抑制作用強(qiáng)于對(duì)“關(guān)口”葡萄的抑制作用；在測(cè)定的pH值和溫度中，5 種葡萄PPO的最適pH值和最適溫度都無(wú)明顯差異。

多酚氧化酶；動(dòng)力學(xué)參數(shù)；催化效率；抑制作用

“關(guān)口”葡萄是湖北省建始縣特產(chǎn)。利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列和逆轉(zhuǎn)座子間擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記法對(duì)“關(guān)口”葡萄的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示“關(guān)口”葡萄與歐美雜交種“尼加拉”和“白香蕉”親緣關(guān)系最近，與美洲種“康可”和“鄭果6號(hào)”親緣關(guān)系較近，而與其他歐亞種的遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，屬歐美雜交種［1］。近幾年“關(guān)口”葡萄受到關(guān)注，但是發(fā)現(xiàn)此種葡萄在釀造葡萄酒和制汁過(guò)程中存在迅速褐變的問(wèn)題。褐變是白葡萄酒和葡萄汁生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)的主要的問(wèn)題，一方面，褐變會(huì)影響產(chǎn)品的感官特性，如色澤、香氣物質(zhì)和風(fēng)味的丟失。另一方面，褐變會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的丟失［2］。褐變反應(yīng)依據(jù)反應(yīng)機(jī)制分為酶促褐變與非酶促褐變［3］。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄汁中主要發(fā)生的是酶促褐變，葡萄酒在釀造過(guò)程中，首先發(fā)生酶促褐變，隨著發(fā)酵進(jìn)行，酶活性逐漸降低，在葡萄酒中主要發(fā)生非酶促褐變，而多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性是影響酶促褐變強(qiáng)度的主要因素。

PPO是一種含有銅離子的酶，在氧存在的情況下，能催化單體酚氧化成為鄰苯酚（單體酚酶活性），也能催化鄰苯酚氧化成相應(yīng)的醌類（兒茶酚酶活性）［4-6］。這些物質(zhì)再聚合成為不期望的褐色、紅色、或者是黑色色素。目前，有關(guān)PPO與植物褐變方面的研究已見(jiàn)不少報(bào)道，關(guān)于部分品種葡萄的PPO和控制酒氧化的研究也有不少報(bào)道［7-13］，但關(guān)于不同品種葡萄間PPO的比較研究鮮見(jiàn)報(bào)道。關(guān)口葡萄破碎時(shí)氧化速率快，這可能與其PPO的特性有關(guān)。為此，選取歐美種葡萄“關(guān)口”、“金手指”、“黃密”和歐亞種葡萄“澤香”、“無(wú)核白”為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其PPO進(jìn)行提取，比較不同品種間PPO對(duì)幾種不同底物的催化活性以及酶學(xué)性質(zhì)，為葡萄酒和葡萄汁生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)的褐變問(wèn)題提供一定的理論依據(jù)，從而找到控制酶促褐變的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

“關(guān)口”葡萄樣品采自湖北建始縣花坪鎮(zhèn)，采收時(shí)間為2014年9月20日，采樣后-20 ℃低溫冰箱冷凍保存?！敖鹗种浮保W美種）、“黃密”（歐美種）、“澤香”（歐亞種）和“無(wú)核白”（歐亞種）均采自咸陽(yáng)張?jiān)Ｈ鹉蔷魄f，采收時(shí)間為2014年9月15日，采樣后-20 ℃保存。

鄰苯二酚、兒茶素、鄰苯三酚、4-甲基兒茶酚、咖啡酸 美國(guó)Sigma公司；檸檬酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、環(huán)庚三烯酚酮、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉、氯化鈉、L-酪氨酸、沒(méi)食子酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

AuY220精密電子天平、UV-2450型紫外分光光度計(jì)日本島津公司；RC5C Plus高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)賽默飛公司。

1.3方法

1.3.1葡萄PPO粗酶液的制備

參考Fortea等［14］的方法，略加改動(dòng)。具體如下：稱取葡萄果實(shí)50 g，去籽，加入50 mL的100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液打漿（含10 mmol/L抗壞血酸，pH 7.3）1 min，用8 層紗布過(guò)濾，4 000 r/min離心15 min。棄上清液，殘?jiān)?0 mL的100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（含4 g/100 mL的Triton X-114和50 mmol/L CaCl2，pH 7.3）提取，振蕩均勻，然后在4 ℃條件下保存15 min，再于37 ℃保溫15 min。這時(shí)溶液會(huì)由于去污劑中的膠體形成、聚合和沉淀而自發(fā)的混濁，這些膠體中包括疏水性的蛋白、花青素和酚類物質(zhì)。然后將混合液在25 ℃、1 000 r/min離心10 min，將富含去污劑的相丟棄，上清液中不含去污劑的液體即為酶粗提取液，-20 ℃保存。實(shí)驗(yàn)做3 次重復(fù)。

1.3.2葡萄PPO活性的測(cè)定

PPO活性的測(cè)定方法參考Marsellés-Fontanet等［15］的方法，略加改動(dòng)。具體步驟如下：將0.1 mL粗酶提取液加入到2.90 mL含有20 mmol/L鄰苯二酚的麥基爾文緩沖溶液（檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液，pH 5.0）中，然后輕輕的搖勻，使其均質(zhì)化，避免形成泡沫，25 ℃反應(yīng)3 min后，測(cè)定在400 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每20 s測(cè)定一次，共測(cè)定3 min，以蒸餾水代替酶的提取液作為對(duì)照組，選取吸光度-時(shí)間曲線中線性部分表示酶的活性，將每分鐘吸光度變化0.001記為一個(gè)活力單位U。做3 次重復(fù)。

1.3.3不同底物酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Km與vmax/Km）的測(cè)定

分別對(duì)7 個(gè)不同商業(yè)底物（鄰苯二酚、鄰苯三酚、4-甲基兒茶酚、咖啡酸、兒茶素、沒(méi)食子酸、L-酪氨酸）的專一性進(jìn)行研究。除L-酪氨酸的濃度為2.5 mmol/L、咖啡酸的濃度為1 mmol/L之外（其溶解度很低），其余底物濃度設(shè)置為10 mmol/L。酶活力的測(cè)定方法同上述酶活力測(cè)定方法，只改變波長(zhǎng)為每種物質(zhì)各自的最大吸收波長(zhǎng)，鄰苯二酚、鄰苯三酚、4-甲基兒茶酚、沒(méi)食子酸、L-酪氨酸的最大吸收波長(zhǎng)均為400 nm，咖啡酸、兒茶素的最大吸收波長(zhǎng)為387 nm，以10 mmol/L的鄰苯二酚為底物時(shí)的最大酶活力表示為100%。

以鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、兒茶素、咖啡酸為底物，測(cè)定不同底物在不同濃度下PPO的活性，做雙倒數(shù)曲線，依據(jù)曲線計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與vmax/Km。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4部分酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1最適pH值的測(cè)定

以鄰苯二酚為底物，測(cè)定酶提取液在pH值范圍為2.6～7.6之間的檸檬酸-磷酸緩沖液中的PPO活性。

1.3.4.2最適溫度的測(cè)定

將含鄰苯二酚底物的緩沖液（pH值為實(shí)驗(yàn)所得的最適pH值）在不同溫度的水浴中保持10 min，溫度變化從20～80 ℃，增加幅度為5 ℃，取2.9 mL緩沖液加入0.1 mL酶提取液，相同水浴溫度反應(yīng)3 min后測(cè)定吸光度，計(jì)算PPO活性。

1.3.4.3熱穩(wěn)定性的測(cè)定

將PPO粗酶提取液分別置于70、75、80 ℃水浴中保溫2、4、6、8、10 min后，迅速放入冰中冷卻，10 min后放入室溫條件下，按上述酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法以鄰苯二酚為底物測(cè)定相對(duì)酶活力，結(jié)果用所測(cè)定殘余酶活力占最大酶活力（100%）的百分比表示。

1.3.5抑制劑對(duì)PPO活性的影響

測(cè)定抑制劑檸檬酸、抗壞血酸、焦亞硫酸鹽、EDTA、環(huán)庚三烯酚酮對(duì)酶活性的抑制作用。利用含20 mmol/L鄰苯二酚的檸檬酸-磷酸緩沖溶液（pH 5.0）溶解抑制劑，配制成含不同濃度（0.05、0.5、5 mmol/L）抑制劑的反應(yīng)體系。按上述酶活性的測(cè)定方法測(cè)定PPO殘余酶活力。用最大酶活力與殘余酶活力差值比最大酶活力表示抑制劑對(duì)PPO活性的抑制作用。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及制圖

使用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，利用Origin 9.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1不同底物酶促動(dòng)力學(xué)

表1　PPO專一性Table1　Substrate specificity of PPO

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了5 個(gè)葡萄品種PPO對(duì)7 種不同底物的專一性，其中包括單羥基酚、二羥基酚、三羥基酚，結(jié)果見(jiàn)表1。5 種葡萄PPO對(duì)單羥基和三羥基酚基本無(wú)活性，而對(duì)二羥基酚的氧化活性相對(duì)較強(qiáng)。PPO是一種含銅離子，能催化酚類物質(zhì)反應(yīng)的酶，能夠催化單羥基酚到二羥基酚，稱作甲酚酶活性，也能夠催化二羥基酚到相應(yīng)的醌類物質(zhì)，稱作兒茶酚酶活性。顯然，5 個(gè)品種葡萄都只具有兒茶酚酶活性，這個(gè)結(jié)果與Zheng Yongju等［9］對(duì)于Thompson無(wú)籽葡萄，Cash等［16］對(duì)Concord葡萄，Lee等［17］對(duì)Chaumac葡萄PPO的研究結(jié)果均相同。然而，Rapeanu等［18］研究得出Victoria葡萄既具有兒茶酚酶活性，也具有甲酚酶活性。5 個(gè)葡萄PPO都對(duì)鄰苯三酚有催化活性，但是催化活性明顯低于二羥基酚的活性。

表2　葡萄PPO不同底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table2　Kinetic parameters of grape PPO towards different substrates

實(shí)驗(yàn)以4 種物質(zhì)作為PPO底物時(shí)，其反應(yīng)規(guī)律都符合米氏方程，依據(jù)雙倒數(shù)曲線得到5 種葡萄的PPO 對(duì)4 種不同底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和vmax見(jiàn)表2。用Km值的大小評(píng)價(jià)底物與酶的親和力，Km值越小，說(shuō)明底物與酶的親和力越強(qiáng)［19］。由表2可知，當(dāng)以鄰苯二酚為底物時(shí)，3 個(gè)歐美種葡萄的Km與2 個(gè)歐亞種葡萄之間存在顯著差異，且3 個(gè)歐美種葡萄的Km值明顯小于2 個(gè)歐亞種葡萄，表明在測(cè)定的5 個(gè)葡萄品種中，歐美種葡萄對(duì)鄰苯二酚的親和能力強(qiáng)于歐亞種，研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚似乎對(duì)大多數(shù)的水果和蔬菜的PPO的親和力都比較低［20］；當(dāng)以4-甲基兒茶酚為底物時(shí)，發(fā)現(xiàn)歐美種葡萄對(duì)4-甲基兒茶酚的親和能力同樣強(qiáng)于歐亞種，只是差異沒(méi)有鄰苯二酚的明顯；當(dāng)以咖啡酸和兒茶素為底物時(shí)，5 個(gè)品種葡萄的Km值都很小，說(shuō)明5 個(gè)葡萄PPO對(duì)于咖啡酸和兒茶素的親和能力都很強(qiáng)，且歐美與歐亞之間的差異性不明顯。Rapeanu等［18］對(duì)Victoria葡萄的底物動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)以鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、兒茶素為底物的Km值分別為52.6、7.51、4.34 mmol/L，這與本實(shí)驗(yàn)得到的5 個(gè)葡萄PPO與底物的親和力的結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)“關(guān)口”葡萄較其他葡萄品種與咖啡酸的親和力相對(duì)較強(qiáng)。

然而，判斷PPO最適底物的主要的標(biāo)準(zhǔn)是具有高的催化效率，以vmax/Km表示，vmax/Km越高，表明催化效率越高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以鄰苯二酚為底物時(shí)，3 個(gè)歐美種葡萄的vmax/Km值明顯大于2 個(gè)歐亞種葡萄，即歐美種葡萄PPO對(duì)鄰苯二酚的催化效率高于歐亞種葡萄的催化效率；當(dāng)以4-甲基兒茶酚為底物時(shí)，歐美種與歐亞種之間無(wú)明顯差異，而當(dāng)以咖啡酸或者是兒茶素為底物時(shí)，“關(guān)口”葡萄對(duì)于這兩種底物的催化效率明顯高于其他4 種葡萄PPO的催化效率，尤其以咖啡酸為底物時(shí)，“關(guān)口”葡萄PPO的vmax/Km值是其他4 種葡萄的2～4 倍，“關(guān)口”葡萄對(duì)咖啡酸的催化效率明顯高于其他葡萄的催化效率。研究表明，葡萄酒在氧化過(guò)程中，首先是酚酸、酒石酸脂類物質(zhì)被氧化成對(duì)應(yīng)的醌類物質(zhì)，然后這個(gè)醌類物質(zhì)作為氧化劑再將黃烷醇類物質(zhì)氧化成對(duì)應(yīng)的醌類物質(zhì)，而自己則被還原。這表明，“關(guān)口”葡萄在釀造葡萄酒時(shí)氧化速率快，很可能是由于其PPO對(duì)于咖啡酸等酚酸類物質(zhì)的催化效率高而使褐變的開(kāi)始反應(yīng)快速發(fā)生而引起的。

2.2部分酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.2.1pH值對(duì)PPO活性的影響

圖1　pH值對(duì)5 種葡萄PPO活性的影響Fig.1　Effect of pH on the activity of PPO from five different varieties of grapes

由圖1可知，pH值對(duì)5 個(gè)不同葡萄品種的PPO活性影響都很大，且對(duì)各品種影響趨勢(shì)相同。在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的pH值范圍內(nèi)，PPO的活性呈先增大后減小的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的幾個(gè)pH值中，5 個(gè)葡萄品種PPO活性都在pH值為5.0時(shí)表現(xiàn)為最強(qiáng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Rapeanu等［18］報(bào)道的Victoria葡萄PPO的最適pH值為5.0相同，與西班牙無(wú)籽葡萄BRS Clara和BRS Morena測(cè)定的最適pH值為5.5的結(jié)果相似［21］?！瓣P(guān)口”葡萄汁的pH值為3.4左右，在此pH值處果實(shí)PPO的活性為最適pH值處活性的45.25%。其他的4 個(gè)葡萄品種在葡萄汁的pH值處表現(xiàn)出的活力與“關(guān)口”葡萄相似。

2.2.25 種葡萄果實(shí)PPO的最適溫度比較

圖2　溫度對(duì)PPO活性的影響Fig.2　Effect of temperature on the activity of grape PPO

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了反應(yīng)溫度為20～80 ℃之間時(shí)5 種葡萄PPO的催化活性，結(jié)果見(jiàn)圖2?！瓣P(guān)口”、“黃密”、“金手指”、“澤香”和“無(wú)核白”5 種葡萄PPO的最適反應(yīng)溫度分別為30、35、30、25、20 ℃。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，“關(guān)口”、“黃密”、“金手指”、“澤香”4 種葡萄的PPO的活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，只有“無(wú)核白”P(pán)PO活性先降低，在50 ℃以后，又出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在60 ℃出現(xiàn)另一個(gè)高峰，然后再降低，這表明“無(wú)核白”葡萄PPO可能具有多種分子形式或同工酶，這與曹健等［22］在《食品酶學(xué)》中敘述的有關(guān)結(jié)論相同。當(dāng)溫度超過(guò)65 ℃時(shí)，幾個(gè)葡萄酶活性都出現(xiàn)快速下降。Muscadine葡萄和Emir葡萄的PPO最適反應(yīng)溫度與5 種葡萄最適反應(yīng)溫度相似［23］。

2.2.35 種葡萄PPO的熱穩(wěn)定性

圖3　5 種葡萄PPO熱穩(wěn)定性Fig.3　Thermal inactivation of PPO from five different varieties of grapes

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同加熱溫度、加熱時(shí)間對(duì)5 種葡萄PPO活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。5 種葡萄PPO熱穩(wěn)定性相似，當(dāng)加熱溫度為80 ℃時(shí)，加熱時(shí)間達(dá)到4 min后，酶的活性降低到10%以下，當(dāng)溫度為75 ℃時(shí)，將酶液加熱4 min，酶的活性降低到最適活性的50%以下。歐亞種葡萄“澤香”和“無(wú)核白”P(pán)PO熱穩(wěn)定性比3 個(gè)歐美種葡萄差，在70 ℃條件下，“澤香”葡萄PPO在70 ℃加熱2 min后活性就降到80%以下，在80 ℃加熱2 min酶活性就降到20%以下，而“金手指”葡萄PPO在70 ℃加熱達(dá)8 min時(shí)酶活性才降到80%以下。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)“關(guān)口”葡萄PPO對(duì)熱處理穩(wěn)定性介于幾種葡萄的穩(wěn)定性之間。

2.2.4抑制劑對(duì)葡萄果實(shí)PPO的影響

表3　抑制劑對(duì)OPP活性的抑制作用Table3　Effect of various inhibitors on the activity of grape PPO

研究發(fā)現(xiàn)，不同抑制劑對(duì)于PPO的抑制作用機(jī)理不同：還原劑、螯合劑、絡(luò)合劑、酸化劑、酶修飾劑，這些抑制作用都是通過(guò)阻止o-醌的積累或是形成穩(wěn)定的無(wú)顏色的物質(zhì)。抗壞血酸和焦亞硫酸鹽是還原劑［24-26］，可以將o-醌還原為沒(méi)有顏色的二羥基酚，也可以和o-醌反應(yīng)形成穩(wěn)定的沒(méi)有顏色的產(chǎn)物。EDTA具有較強(qiáng)的螯合能力，能螯合PPO中Cu2+，從而抑制PPO的活性。檸檬酸的抑制作用是通過(guò)降低反應(yīng)體系的pH值來(lái)降低酶的活性。

實(shí)驗(yàn)以鄰苯二酚為底物對(duì)不同濃度的5 種抑制劑對(duì)5 個(gè)葡萄果實(shí)PPO活性的影響做了研究。結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)葡萄果實(shí)PPO有強(qiáng)的抑制作用的物質(zhì)是焦亞硫酸鹽、抗壞血酸。焦亞硫酸鹽的濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)抑制率達(dá)到100%。白葡萄酒釀造過(guò)程中，一般會(huì)在除梗破碎過(guò)程中加入0.1 mmol/L左右二氧化硫（以亞硫酸形式加入），由于二氧化硫的揮發(fā)性強(qiáng)，在壓榨擠汁過(guò)程后，二氧化硫濃度一般會(huì)降低到0.05 mmol/L以下，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)亞硫酸鹽濃度為0.05 mmol/L時(shí)，只有“關(guān)口”葡萄的抑制率為44.65%，其余4 個(gè)葡萄的抑制率都達(dá)到77%以上。這可能解釋了為什么在用“關(guān)口”葡萄發(fā)酵葡萄酒時(shí)，即使加入二氧化硫，其氧化速率仍然很快的現(xiàn)象?？箟难岬臐舛冗_(dá)到0.5 mmol/L時(shí)抑制率達(dá)到100%，可以得出焦亞硫酸鹽和抗壞血酸可以抑制葡萄汁的酶促褐變反應(yīng)。檸檬酸和EDTA對(duì)PPO也存在抑制作用，但是抑制強(qiáng)度相對(duì)較低。

3　結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了5 種葡萄PPO的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 種葡萄PPO只具有兒茶酚酶催化活性。歐美種葡萄與歐亞種葡萄PPO對(duì)不同底物的親和力與催化活性間存在顯著性差異，“關(guān)口”葡萄PPO對(duì)咖啡酸和兒茶素的催化活性明顯高于其他4 種葡萄PPO?！瓣P(guān)口”葡萄在釀造葡萄酒時(shí)氧化速率快，很可能是由于其PPO對(duì)于咖啡酸等酚酸類物質(zhì)的催化效率高而引起的。在測(cè)定的幾個(gè)pH值處，5 個(gè)葡萄PPO的最適pH值為5.0。“關(guān)口”、“黃密”、“金手指”、“澤香”和“無(wú)核白”葡萄PPO的最適反應(yīng)溫度分別為30、35、30、25 ℃和20 ℃。歐亞種葡萄“澤香”和“無(wú)核白”P(pán)PO熱穩(wěn)定性比3 個(gè)歐美種葡萄穩(wěn)定性差。焦亞硫酸鹽和抗壞血酸對(duì)5 種PPO活性都有強(qiáng)的抑制作用，其中焦亞硫酸鹽對(duì)其他4 個(gè)品種葡萄的抑制作用強(qiáng)于對(duì)“關(guān)口”葡萄的抑制作用。

［1］ 李慧， 羅正榮， 張青林. 基于SSR和IRAP標(biāo)記的‘關(guān)口葡萄’親緣關(guān)系分析［J］. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2014， 31（6）: 1040-1046. DOI:10.13925/j.cnki. gsxb.20140202.

［2］ SIOUMIS N， KALLITHRAKA S， TSOUTSOURAS E， et al. Browning development in white wines: dependence on compositional parameters and impact on antioxidant characteristics［J］. European Food Research and Technology， 2005， 220（3/4）: 326-330. DOI:10.1007/s00217-004-1032-0.

［3］ ES-SAFI N E， CHEYNIER V， MOUTOUNET M. Effect of copper on oxidation of （+）-catechin in a model solution system［J］. International Journal of Food Science and Technology， 2003， 38（2）: 153-163. DOI:10.1046/j.1365-2621.2003.00656.x.

［4］ FRONK P， HARTMANN H， BAUER M， et al. Polyphenoloxidase from Riesling and Dornfelder wine grapes （Vitis vinifera） is a tyrosinase［J］. Food Chemistry， 2015， 183: 49-57. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.03.016.

［5］ ROLFF M， SCHOTTENHEIM J， DECKER H， et al. Copper-O2reactivity of tyrosinase models towards external monophenolic substrates: molecular mechanism and comparison with the enzyme［J］. Chemical Society Reviews， 2011， 40（7）: 4077-4098. DOI:10.1039/ C0CS00202J.

［6］ 劉芳， 趙金紅， 朱明慧， 等. 多酚氧化酶結(jié)構(gòu)及褐變機(jī)理研究進(jìn)展［J］. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2015， 36（6）: 113-119. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2015.06.032.

［7］ 王月暉， 徐洪宇， 張京芳， 等. 釀酒紅葡萄多酚氧化酶活力及總酚含量［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（9）: 47-51. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201309011.

［8］ OEEN?ES-PINERO E， GARCíA-CARMONA F， SáNCHEZFERRER A. Latent polyphenol oxidase from quince fruit pulp （Cydonia oblonga）: purification， activation and some properties［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2006， 86（13）: 2172-2178. DOI:10.1002/jsfa.2593.

［9］ ZHENG Yongju， SHI Junling， PAN Zhongli. Biochemical characteristics and thermal inhibition kinetics of polyphenol oxidase extracted from Thompson seedless grape［J］. European Food Research and Technology， 2012， 234: 607-616. DOI:10.1007/s00217-012-1664-4.

［10］ üMIT üNAL M， ?ENER A. Effect of harvest year on biochemical properties of Narince grape （Vitis vinifera L. cv. Narince） polyphenol oxidase［J］. European Food Research and Technology， 2014， 238（4）: 613-619. DOI:10.1007/s00217-013-2138-z.

［11］ 田國(guó)政， 程超， 田莉， 等. 青蒿多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（19）: 149-152. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201419031.

［12］ MISHRA B B， GAUTAM S， SHARMA A. Purification and characterisation of polyphenol oxidase （PPO） from eggplant（Solanum melongena）［J］. Food Chemistry， 2012， 134（4）: 1855-1861. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.03.098.

［13］ COMUZZO P， ZIRONI R. Biotechnological strategies for controlling wine oxidation［J］. Food Engineering Reviews， 2013， 5（4）: 217-229. DOI:10.1007/s12393-013-9071-6.

［14］ FORTEA M I， LóPEZ-MIRANDA S， SERRANO-MARTíNEZ A，et al. Kinetic characterisation and thermal inactivation study of polyphenol oxidase and peroxidase from table grape （Crimson Seedless）［J］. Food Chemistry， 2009， 113（4）: 1008-1014. DOI:10.1016/ j.foodchem.2008.08.053.

［15］ ROBERT MARSELLéS-FONTANET A， MARTíN-BELLOSO O. Optimization and validation of PEF processing conditions to inactivate oxidative enzymes of grape juice［J］. Journal of Food Engineering，2007， 83（3）: 452-462. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2007.04.001.

［16］ CASH J N， SISTRUNK W A， STUTTE C A. Characteristics of Concord grape polyphenoloxidase involved in juice color loss［J］. Food Science， 1976， 41: 1398-1402. DOI:10.1111/j.1365-2621.1976. tb01181.x.

［17］ LEE C Y， SMITH N L， PENNESI A P. Polyphenoloxidase from DeChaunac grapes［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，1983， 34（9）: 987-991.

［18］ RAPEANU G， LOEY A V， SMOUT C， et al. Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape （Vitis vinifera ssp. sativa）［J］. Food Chemistry，2006， 94（2）: 253-261. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.10.058.

［19］ SIDDIQ M， SINHA N K， CASH J N. Characterization of polyphenoloxidase from Stanley plums［J］. Food Science， 1992， 57（5）: 1177-1179. DOI:10.1111/j.1365-2621.1992.tb11292.x.

［20］ PALMA-OROZCO G， MARRUFO-HERNáNDEZ N A， SAMPEDRO J G， et al. Purification and partial biochemical characterization of polyphenol oxidase from mango （Mangifera indica cv. Manila）［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62（40）: 9832-9840. DOI:10.1021/jf5029784.

［21］ ELLEN S L V， FABIANA C P， NATáLIA M， et al. Isolation and characterization of latent and active polyphenoloxidase in BRS Clara （CNPUV 154-147×Centennial seedless） and BRS Morena（Marroo seedless×Centennial seedless） seedless table grapes［J］. Plant Physiology and Biochemistry， 2011， 49（11）: 1251-1258. DOI:10.1016/ j.plaphy.2011.09.004.

［22］ 曹健， 師俊玲. 食品酶學(xué)［M］. 鄭州: 鄭州大學(xué)出版社， 2011: 142-143.

［23］ üNAL M ü， ?ENER A. Determination of some biochemical properties of polyphenol oxidase from Emir grape （Vitis vinifera L. cv. Emir）［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2006， 86（14）: 2374-2379. DOI:10.1002/jsfa.2627.

［24］ BRADSHAW M P， BARRIL C， ANDREW C C， et al. Ascorbic acid: a review of its chemistry and reactivity in relation to a wine environment［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2011，51（6）: 479-498. DOI:10.1080/10408391003690559.

［25］ LIU Wei， ZOU Liqiang， LIU Junping， et al. The effect of citric acid on the activity， thermodynamics and conformation of mushroom polyphenoloxidase［J］. Food Chemistry， 2013， 140（1）: 289-295. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.02.028.

［26］ 郭艷萍， 劉美林， 賀東亮， 等. 抑制劑對(duì)黑雞心葡萄多酚氧化酶活性的影響［J］. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 34（5）: 476-480. DOI:10.3969/ j.issn.1671-8151.2014.05.019.

Comparative Enzymatic Kinetics of Polyphenol Oxidase from Different Grape Varieties

YAN Xiaoyu， DONG Zhe， WANG Shasha， ZHOU Yali， SU Pengfei， YUAN Chunlong*
（College of Enology， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

The kinetic parameters Kmand vmax/Kmof polyphenol oxidase （PPO） from three Franco-American hybrid grape varieties namely “Guankou”， “Goldfinger”， “Huangmi” and two Vitis vinifera varieties i.e.， Zexiang and seedless white were compared towards different substrates: catechol， 4-methylcatechol， catechin and caffeic acid as well as optimal pH and temperature， thermal stability， and the effect of inhibitors on PPO activity. Results showed that the affinity of PPO from five varieties grapes for catechol was significantly different， whereas no significant difference was observed when 4-methylcatechol， catechin and caffeic acid were used as substrates. The catalytic effi ciency of PPO from Franco-American hybrid grapes and Vitis vinifera for catechol was signifi cantly different while no signifi cant difference was observed when 4-methylcatechol， catechin and caffeic acid were used as substrates. The catalytic efficiency of PPO from “Guankou”grapes for catechin and caffeic acid was obviously higher than that of four other varieties of grapes. Among inhibitors tested， ascorbic acid and sodium metabisulfi te had stronger inhibition on PPO from all fi ve varieties. The inhibitory effect of sodium metabisulfi te on PPO from “Guankou” grapes was weaker than on PPO from four other varieties. Optimal pH and temperature of PPO from fi ve varieties of grapes had no signifi cant difference.

polyphenol oxidase； kinetic parameters； catalytic effi ciency； inhibition

10.7506/spkx1002-6630-201619036

Q554.1

A

1002-6630（2016）19-0216-06

閆小宇， 董喆， 王沙沙， 等. 不同葡萄品種多酚氧化酶酶學(xué)特性比較［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 216-221. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619036. http：//www.spkx.net.cn

YAN Xiaoyu， DONG Zhe， WANG Shasha， et al. Comparative enzymatic kinetics of polyphenol oxidase from different grape varieties［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 216-221. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619036. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-04

西北農(nóng)林科技大學(xué)校企合作項(xiàng)目（K403021407）

閆小宇（1989—），女，碩士，主要從事葡萄酒氧化機(jī)制及其抑制氧化研究。E-mail：498332416@qq.com

袁春龍（1969—），男，副教授，博士，主要從事葡萄酒化學(xué)及葡萄釀酒副產(chǎn)物加工利用研究。

E-mail：yuanchl69@nwsuaf.edu.cn