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        不同葡萄品種多酚氧化酶酶學特性比較

        2016-11-09 01:44:15閆小宇王沙沙周亞麗蘇鵬飛袁春龍
        食品科學 2016年19期
        關鍵詞:鄰苯二酚關口歐亞

        閆小宇,董 喆,王沙沙,周亞麗,蘇鵬飛,袁春龍*

        (西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院,陜西 楊陵 712100)

        不同葡萄品種多酚氧化酶酶學特性比較

        閆小宇,董喆,王沙沙,周亞麗,蘇鵬飛,袁春龍*

        (西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院,陜西 楊陵 712100)

        以歐美種葡萄 “關口”、“金手指”、“黃密”3 個品種和歐亞種葡萄 “澤香”、“無核白”2 個品種為實驗材料,比較了5 個不同葡萄品種間多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)以鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、兒茶素、咖啡酸為底物的動力學參數(shù)Km、vmax/Km值,并比較了酶的最適pH值、最適溫度、熱穩(wěn)定性、以及抑制劑對酶活性的影響。結果表明:測定的5 個品種中,歐美種葡萄和歐亞種葡萄對鄰苯二酚的親和力存在顯著性差異,對 4-甲基兒茶酚、兒茶素、咖啡酸的親和力無顯著性差異;歐美種葡萄和歐亞種葡萄對鄰苯二酚的催化效率存在顯著性差異,對4-甲基兒茶酚的催化效率無顯著性差異,“關口”葡萄對兒茶素和咖啡酸的催化效率明顯高于其他4 個葡萄品種。焦亞硫酸鹽和抗壞血酸對5 種葡萄PPO活性都有強的抑制作用,焦亞硫酸鹽對其他4 個品種葡萄的抑制作用強于對“關口”葡萄的抑制作用;在測定的pH值和溫度中,5 種葡萄PPO的最適pH值和最適溫度都無明顯差異。

        多酚氧化酶;動力學參數(shù);催化效率;抑制作用

        “關口”葡萄是湖北省建始縣特產(chǎn)。利用簡單重復序列和逆轉座子間擴增多態(tài)性標記法對“關口”葡萄的親緣關系進行了分析,結果顯示“關口”葡萄與歐美雜交種“尼加拉”和“白香蕉”親緣關系最近,與美洲種“康可”和“鄭果6號”親緣關系較近,而與其他歐亞種的遺傳關系相對較遠,屬歐美雜交種[1]。近幾年“關口”葡萄受到關注,但是發(fā)現(xiàn)此種葡萄在釀造葡萄酒和制汁過程中存在迅速褐變的問題。褐變是白葡萄酒和葡萄汁生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的主要的問題,一方面,褐變會影響產(chǎn)品的感官特性,如色澤、香氣物質(zhì)和風味的丟失。另一方面,褐變會導致營養(yǎng)物質(zhì)的丟失[2]。褐變反應依據(jù)反應機制分為酶促褐變與非酶促褐變[3]。研究發(fā)現(xiàn),葡萄汁中主要發(fā)生的是酶促褐變,葡萄酒在釀造過程中,首先發(fā)生酶促褐變,隨著發(fā)酵進行,酶活性逐漸降低,在葡萄酒中主要發(fā)生非酶促褐變,而多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的活性是影響酶促褐變強度的主要因素。

        PPO是一種含有銅離子的酶,在氧存在的情況下,能催化單體酚氧化成為鄰苯酚(單體酚酶活性),也能催化鄰苯酚氧化成相應的醌類(兒茶酚酶活性)[4-6]。這些物質(zhì)再聚合成為不期望的褐色、紅色、或者是黑色色素。目前,有關PPO與植物褐變方面的研究已見不少報道,關于部分品種葡萄的PPO和控制酒氧化的研究也有不少報道[7-13],但關于不同品種葡萄間PPO的比較研究鮮見報道。關口葡萄破碎時氧化速率快,這可能與其PPO的特性有關。為此,選取歐美種葡萄“關口”、“金手指”、“黃密”和歐亞種葡萄“澤香”、“無核白”為實驗材料,對其PPO進行提取,比較不同品種間PPO對幾種不同底物的催化活性以及酶學性質(zhì),為葡萄酒和葡萄汁生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的褐變問題提供一定的理論依據(jù),從而找到控制酶促褐變的方法。

        1 材料與方法

        1.1材料與試劑

        “關口”葡萄樣品采自湖北建始縣花坪鎮(zhèn),采收時間為2014年9月20日,采樣后-20 ℃低溫冰箱冷凍保存。“金手指”(歐美種)、“黃密”(歐美種)、“澤香”(歐亞種)和“無核白”(歐亞種)均采自咸陽張裕瑞那酒莊,采收時間為2014年9月15日,采樣后-20 ℃保存。

        鄰苯二酚、兒茶素、鄰苯三酚、4-甲基兒茶酚、咖啡酸 美國Sigma公司;檸檬酸、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、環(huán)庚三烯酚酮、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉、氯化鈉、L-酪氨酸、沒食子酸均為國產(chǎn)分析純。

        1.2儀器與設備

        AuY220精密電子天平、UV-2450型紫外分光光度計日本島津公司;RC5C Plus高速冷凍離心機 德國賽默飛公司。

        1.3方法

        1.3.1葡萄PPO粗酶液的制備

        參考Fortea等[14]的方法,略加改動。具體如下:稱取葡萄果實50 g,去籽,加入50 mL的100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液打漿(含10 mmol/L抗壞血酸,pH 7.3)1 min,用8 層紗布過濾,4 000 r/min離心15 min。棄上清液,殘渣用20 mL的100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(含4 g/100 mL的Triton X-114和50 mmol/L CaCl2,pH 7.3)提取,振蕩均勻,然后在4 ℃條件下保存15 min,再于37 ℃保溫15 min。這時溶液會由于去污劑中的膠體形成、聚合和沉淀而自發(fā)的混濁,這些膠體中包括疏水性的蛋白、花青素和酚類物質(zhì)。然后將混合液在25 ℃、1 000 r/min離心10 min,將富含去污劑的相丟棄,上清液中不含去污劑的液體即為酶粗提取液,-20 ℃保存。實驗做3 次重復。

        1.3.2葡萄PPO活性的測定

        PPO活性的測定方法參考Marsellés-Fontanet等[15]的方法,略加改動。具體步驟如下:將0.1 mL粗酶提取液加入到2.90 mL含有20 mmol/L鄰苯二酚的麥基爾文緩沖溶液(檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液,pH 5.0)中,然后輕輕的搖勻,使其均質(zhì)化,避免形成泡沫,25 ℃反應3 min后,測定在400 nm波長處的吸光度,每20 s測定一次,共測定3 min,以蒸餾水代替酶的提取液作為對照組,選取吸光度-時間曲線中線性部分表示酶的活性,將每分鐘吸光度變化0.001記為一個活力單位U。做3 次重復。

        1.3.3不同底物酶促動力學參數(shù)(Km與vmax/Km)的測定

        分別對7 個不同商業(yè)底物(鄰苯二酚、鄰苯三酚、4-甲基兒茶酚、咖啡酸、兒茶素、沒食子酸、L-酪氨酸)的專一性進行研究。除L-酪氨酸的濃度為2.5 mmol/L、咖啡酸的濃度為1 mmol/L之外(其溶解度很低),其余底物濃度設置為10 mmol/L。酶活力的測定方法同上述酶活力測定方法,只改變波長為每種物質(zhì)各自的最大吸收波長,鄰苯二酚、鄰苯三酚、4-甲基兒茶酚、沒食子酸、L-酪氨酸的最大吸收波長均為400 nm,咖啡酸、兒茶素的最大吸收波長為387 nm,以10 mmol/L的鄰苯二酚為底物時的最大酶活力表示為100%。

        以鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、兒茶素、咖啡酸為底物,測定不同底物在不同濃度下PPO的活性,做雙倒數(shù)曲線,依據(jù)曲線計算酶的動力學參數(shù)Km與vmax/Km。實驗重復3 次。

        1.3.4部分酶學性質(zhì)的測定

        1.3.4.1最適pH值的測定

        以鄰苯二酚為底物,測定酶提取液在pH值范圍為2.6~7.6之間的檸檬酸-磷酸緩沖液中的PPO活性。

        1.3.4.2最適溫度的測定

        將含鄰苯二酚底物的緩沖液(pH值為實驗所得的最適pH值)在不同溫度的水浴中保持10 min,溫度變化從20~80 ℃,增加幅度為5 ℃,取2.9 mL緩沖液加入0.1 mL酶提取液,相同水浴溫度反應3 min后測定吸光度,計算PPO活性。

        1.3.4.3熱穩(wěn)定性的測定

        將PPO粗酶提取液分別置于70、75、80 ℃水浴中保溫2、4、6、8、10 min后,迅速放入冰中冷卻,10 min后放入室溫條件下,按上述酶活性測定的標準方法以鄰苯二酚為底物測定相對酶活力,結果用所測定殘余酶活力占最大酶活力(100%)的百分比表示。

        1.3.5抑制劑對PPO活性的影響

        測定抑制劑檸檬酸、抗壞血酸、焦亞硫酸鹽、EDTA、環(huán)庚三烯酚酮對酶活性的抑制作用。利用含20 mmol/L鄰苯二酚的檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH 5.0)溶解抑制劑,配制成含不同濃度(0.05、0.5、5 mmol/L)抑制劑的反應體系。按上述酶活性的測定方法測定PPO殘余酶活力。用最大酶活力與殘余酶活力差值比最大酶活力表示抑制劑對PPO活性的抑制作用。

        1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及制圖

        使用Excel 2007軟件統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù),計算標準差,利用Origin 9.0軟件作圖。

        2 結果與分析

        2.1不同底物酶促動力學

        表1 PPO專一性Table1 Substrate specificity of PPO

        實驗測定了5 個葡萄品種PPO對7 種不同底物的專一性,其中包括單羥基酚、二羥基酚、三羥基酚,結果見表1。5 種葡萄PPO對單羥基和三羥基酚基本無活性,而對二羥基酚的氧化活性相對較強。PPO是一種含銅離子,能催化酚類物質(zhì)反應的酶,能夠催化單羥基酚到二羥基酚,稱作甲酚酶活性,也能夠催化二羥基酚到相應的醌類物質(zhì),稱作兒茶酚酶活性。顯然,5 個品種葡萄都只具有兒茶酚酶活性,這個結果與Zheng Yongju等[9]對于Thompson無籽葡萄,Cash等[16]對Concord葡萄,Lee等[17]對Chaumac葡萄PPO的研究結果均相同。然而,Rapeanu等[18]研究得出Victoria葡萄既具有兒茶酚酶活性,也具有甲酚酶活性。5 個葡萄PPO都對鄰苯三酚有催化活性,但是催化活性明顯低于二羥基酚的活性。

        表2 葡萄PPO不同底物的動力學參數(shù)Table2 Kinetic parameters of grape PPO towards different substrates

        實驗以4 種物質(zhì)作為PPO底物時,其反應規(guī)律都符合米氏方程,依據(jù)雙倒數(shù)曲線得到5 種葡萄的PPO 對4 種不同底物的動力學參數(shù)Km和vmax見表2。用Km值的大小評價底物與酶的親和力,Km值越小,說明底物與酶的親和力越強[19]。由表2可知,當以鄰苯二酚為底物時,3 個歐美種葡萄的Km與2 個歐亞種葡萄之間存在顯著差異,且3 個歐美種葡萄的Km值明顯小于2 個歐亞種葡萄,表明在測定的5 個葡萄品種中,歐美種葡萄對鄰苯二酚的親和能力強于歐亞種,研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚似乎對大多數(shù)的水果和蔬菜的PPO的親和力都比較低[20];當以4-甲基兒茶酚為底物時,發(fā)現(xiàn)歐美種葡萄對4-甲基兒茶酚的親和能力同樣強于歐亞種,只是差異沒有鄰苯二酚的明顯;當以咖啡酸和兒茶素為底物時,5 個品種葡萄的Km值都很小,說明5 個葡萄PPO對于咖啡酸和兒茶素的親和能力都很強,且歐美與歐亞之間的差異性不明顯。Rapeanu等[18]對Victoria葡萄的底物動力學研究發(fā)現(xiàn)以鄰苯二酚、4-甲基兒茶酚、兒茶素為底物的Km值分別為52.6、7.51、4.34 mmol/L,這與本實驗得到的5 個葡萄PPO與底物的親和力的結果相似。實驗發(fā)現(xiàn)“關口”葡萄較其他葡萄品種與咖啡酸的親和力相對較強。

        然而,判斷PPO最適底物的主要的標準是具有高的催化效率,以vmax/Km表示,vmax/Km越高,表明催化效率越高。實驗發(fā)現(xiàn),以鄰苯二酚為底物時,3 個歐美種葡萄的vmax/Km值明顯大于2 個歐亞種葡萄,即歐美種葡萄PPO對鄰苯二酚的催化效率高于歐亞種葡萄的催化效率;當以4-甲基兒茶酚為底物時,歐美種與歐亞種之間無明顯差異,而當以咖啡酸或者是兒茶素為底物時,“關口”葡萄對于這兩種底物的催化效率明顯高于其他4 種葡萄PPO的催化效率,尤其以咖啡酸為底物時,“關口”葡萄PPO的vmax/Km值是其他4 種葡萄的2~4 倍,“關口”葡萄對咖啡酸的催化效率明顯高于其他葡萄的催化效率。研究表明,葡萄酒在氧化過程中,首先是酚酸、酒石酸脂類物質(zhì)被氧化成對應的醌類物質(zhì),然后這個醌類物質(zhì)作為氧化劑再將黃烷醇類物質(zhì)氧化成對應的醌類物質(zhì),而自己則被還原。這表明,“關口”葡萄在釀造葡萄酒時氧化速率快,很可能是由于其PPO對于咖啡酸等酚酸類物質(zhì)的催化效率高而使褐變的開始反應快速發(fā)生而引起的。

        2.2部分酶學性質(zhì)測定

        2.2.1pH值對PPO活性的影響

        圖1 pH值對5 種葡萄PPO活性的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of PPO from five different varieties of grapes

        由圖1可知,pH值對5 個不同葡萄品種的PPO活性影響都很大,且對各品種影響趨勢相同。在實驗測定的pH值范圍內(nèi),PPO的活性呈先增大后減小的趨勢,實驗測定的幾個pH值中,5 個葡萄品種PPO活性都在pH值為5.0時表現(xiàn)為最強。這個實驗結果與Rapeanu等[18]報道的Victoria葡萄PPO的最適pH值為5.0相同,與西班牙無籽葡萄BRS Clara和BRS Morena測定的最適pH值為5.5的結果相似[21]?!瓣P口”葡萄汁的pH值為3.4左右,在此pH值處果實PPO的活性為最適pH值處活性的45.25%。其他的4 個葡萄品種在葡萄汁的pH值處表現(xiàn)出的活力與“關口”葡萄相似。

        2.2.25 種葡萄果實PPO的最適溫度比較

        圖2 溫度對PPO活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of grape PPO

        實驗測定了反應溫度為20~80 ℃之間時5 種葡萄PPO的催化活性,結果見圖2。“關口”、“黃密”、“金手指”、“澤香”和“無核白”5 種葡萄PPO的最適反應溫度分別為30、35、30、25、20 ℃。實驗發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高,“關口”、“黃密”、“金手指”、“澤香”4 種葡萄的PPO的活性呈先升高后降低的趨勢,只有“無核白”PPO活性先降低,在50 ℃以后,又出現(xiàn)上升的趨勢,在60 ℃出現(xiàn)另一個高峰,然后再降低,這表明“無核白”葡萄PPO可能具有多種分子形式或同工酶,這與曹健等[22]在《食品酶學》中敘述的有關結論相同。當溫度超過65 ℃時,幾個葡萄酶活性都出現(xiàn)快速下降。Muscadine葡萄和Emir葡萄的PPO最適反應溫度與5 種葡萄最適反應溫度相似[23]。

        2.2.35 種葡萄PPO的熱穩(wěn)定性

        圖3 5 種葡萄PPO熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal inactivation of PPO from five different varieties of grapes

        實驗測定了不同加熱溫度、加熱時間對5 種葡萄PPO活性的影響,結果見圖3。5 種葡萄PPO熱穩(wěn)定性相似,當加熱溫度為80 ℃時,加熱時間達到4 min后,酶的活性降低到10%以下,當溫度為75 ℃時,將酶液加熱4 min,酶的活性降低到最適活性的50%以下。歐亞種葡萄“澤香”和“無核白”PPO熱穩(wěn)定性比3 個歐美種葡萄差,在70 ℃條件下,“澤香”葡萄PPO在70 ℃加熱2 min后活性就降到80%以下,在80 ℃加熱2 min酶活性就降到20%以下,而“金手指”葡萄PPO在70 ℃加熱達8 min時酶活性才降到80%以下。實驗發(fā)現(xiàn)“關口”葡萄PPO對熱處理穩(wěn)定性介于幾種葡萄的穩(wěn)定性之間。

        2.2.4抑制劑對葡萄果實PPO的影響

        表3 抑制劑對OPP活性的抑制作用Table3 Effect of various inhibitors on the activity of grape PPO

        研究發(fā)現(xiàn),不同抑制劑對于PPO的抑制作用機理不同:還原劑、螯合劑、絡合劑、酸化劑、酶修飾劑,這些抑制作用都是通過阻止o-醌的積累或是形成穩(wěn)定的無顏色的物質(zhì)??箟难岷徒箒喠蛩猁}是還原劑[24-26],可以將o-醌還原為沒有顏色的二羥基酚,也可以和o-醌反應形成穩(wěn)定的沒有顏色的產(chǎn)物。EDTA具有較強的螯合能力,能螯合PPO中Cu2+,從而抑制PPO的活性。檸檬酸的抑制作用是通過降低反應體系的pH值來降低酶的活性。

        實驗以鄰苯二酚為底物對不同濃度的5 種抑制劑對5 個葡萄果實PPO活性的影響做了研究。結果見表3。對葡萄果實PPO有強的抑制作用的物質(zhì)是焦亞硫酸鹽、抗壞血酸。焦亞硫酸鹽的濃度達到0.5 mmol/L時抑制率達到100%。白葡萄酒釀造過程中,一般會在除梗破碎過程中加入0.1 mmol/L左右二氧化硫(以亞硫酸形式加入),由于二氧化硫的揮發(fā)性強,在壓榨擠汁過程后,二氧化硫濃度一般會降低到0.05 mmol/L以下,實驗發(fā)現(xiàn),當亞硫酸鹽濃度為0.05 mmol/L時,只有“關口”葡萄的抑制率為44.65%,其余4 個葡萄的抑制率都達到77%以上。這可能解釋了為什么在用“關口”葡萄發(fā)酵葡萄酒時,即使加入二氧化硫,其氧化速率仍然很快的現(xiàn)象。抗壞血酸的濃度達到0.5 mmol/L時抑制率達到100%,可以得出焦亞硫酸鹽和抗壞血酸可以抑制葡萄汁的酶促褐變反應。檸檬酸和EDTA對PPO也存在抑制作用,但是抑制強度相對較低。

        3 結 論

        實驗測定了5 種葡萄PPO的酶學性質(zhì),結果發(fā)現(xiàn),5 種葡萄PPO只具有兒茶酚酶催化活性。歐美種葡萄與歐亞種葡萄PPO對不同底物的親和力與催化活性間存在顯著性差異,“關口”葡萄PPO對咖啡酸和兒茶素的催化活性明顯高于其他4 種葡萄PPO?!瓣P口”葡萄在釀造葡萄酒時氧化速率快,很可能是由于其PPO對于咖啡酸等酚酸類物質(zhì)的催化效率高而引起的。在測定的幾個pH值處,5 個葡萄PPO的最適pH值為5.0?!瓣P口”、“黃密”、“金手指”、“澤香”和“無核白”葡萄PPO的最適反應溫度分別為30、35、30、25 ℃和20 ℃。歐亞種葡萄“澤香”和“無核白”PPO熱穩(wěn)定性比3 個歐美種葡萄穩(wěn)定性差。焦亞硫酸鹽和抗壞血酸對5 種PPO活性都有強的抑制作用,其中焦亞硫酸鹽對其他4 個品種葡萄的抑制作用強于對“關口”葡萄的抑制作用。

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        Comparative Enzymatic Kinetics of Polyphenol Oxidase from Different Grape Varieties

        YAN Xiaoyu, DONG Zhe, WANG Shasha, ZHOU Yali, SU Pengfei, YUAN Chunlong*
        (College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

        The kinetic parameters Kmand vmax/Kmof polyphenol oxidase (PPO) from three Franco-American hybrid grape varieties namely “Guankou”, “Goldfinger”, “Huangmi” and two Vitis vinifera varieties i.e., Zexiang and seedless white were compared towards different substrates: catechol, 4-methylcatechol, catechin and caffeic acid as well as optimal pH and temperature, thermal stability, and the effect of inhibitors on PPO activity. Results showed that the affinity of PPO from five varieties grapes for catechol was significantly different, whereas no significant difference was observed when 4-methylcatechol, catechin and caffeic acid were used as substrates. The catalytic effi ciency of PPO from Franco-American hybrid grapes and Vitis vinifera for catechol was signifi cantly different while no signifi cant difference was observed when 4-methylcatechol, catechin and caffeic acid were used as substrates. The catalytic efficiency of PPO from “Guankou”grapes for catechin and caffeic acid was obviously higher than that of four other varieties of grapes. Among inhibitors tested, ascorbic acid and sodium metabisulfi te had stronger inhibition on PPO from all fi ve varieties. The inhibitory effect of sodium metabisulfi te on PPO from “Guankou” grapes was weaker than on PPO from four other varieties. Optimal pH and temperature of PPO from fi ve varieties of grapes had no signifi cant difference.

        polyphenol oxidase; kinetic parameters; catalytic effi ciency; inhibition

        10.7506/spkx1002-6630-201619036

        Q554.1

        A

        1002-6630(2016)19-0216-06

        閆小宇, 董喆, 王沙沙, 等. 不同葡萄品種多酚氧化酶酶學特性比較[J]. 食品科學, 2016, 37(19): 216-221. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201619036. http://www.spkx.net.cn

        YAN Xiaoyu, DONG Zhe, WANG Shasha, et al. Comparative enzymatic kinetics of polyphenol oxidase from different grape varieties[J]. Food Science, 2016, 37(19): 216-221. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619036. http://www.spkx.net.cn

        2015-12-04

        西北農(nóng)林科技大學校企合作項目(K403021407)

        閆小宇(1989—),女,碩士,主要從事葡萄酒氧化機制及其抑制氧化研究。E-mail:498332416@qq.com

        袁春龍(1969—),男,副教授,博士,主要從事葡萄酒化學及葡萄釀酒副產(chǎn)物加工利用研究。

        E-mail:yuanchl69@nwsuaf.edu.cn

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