趙希岳，宋厚煜，蔡志強(qiáng)，陳小花

（常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州 213164）

不同溫度對β-葡聚糖酶分批發(fā)酵動力學(xué)的影響

趙希岳，宋厚煜，蔡志強(qiáng)，陳小花

（常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州 213164）

在5 L發(fā)酵罐中研究不同溫度對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZJF-15菌體生長、底物消耗和產(chǎn)酶量的影響。分批發(fā)酵的工藝條件為：攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min、通氣量1.0 L/（L·min）、pH 7.0、接種量5%、裝液系數(shù)0.6、發(fā)酵溫度35～37 ℃。結(jié)果表明：溫度升高會導(dǎo)致反應(yīng)速率加大、生長代謝加快、生產(chǎn)期提前、酶失活速率加快、發(fā)酵周期縮短、最終產(chǎn)酶量減少。實驗建立了B. subtilis ZJF-15分批發(fā)酵的菌體生長、底物消耗和β-葡聚糖酶產(chǎn)酶的動力學(xué)方程。

枯草芽孢桿菌；β-葡聚糖酶；分批發(fā)酵；溫度；動力學(xué)

β-葡聚糖是一類非淀粉多糖，是谷物類細(xì)胞壁的主要成分之一，約占其干質(zhì)量的5.5% ，也廣泛存在于褐藻、酵母、大型真菌、細(xì)菌等其他微生物的細(xì)胞壁中［1-2］。美國飼料業(yè)首次在大麥飼料中添加β-葡聚糖酶，顯著提高了飼料利用率，從而引起世界各國對β-葡聚糖酶的重視［3-4］。吳鵬等［5］對黑曲霉H-5產(chǎn)β-葡聚糖酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，把β-葡聚糖酶的酶活力由12.98 U/mL提高到20.03 U/mL。邵敏等［6］利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)對葡聚糖酶的基因進(jìn)行改造，酶活力由84.2 U/mL提高至247.3 U/mL。黃發(fā)等［7］對綠色木霉產(chǎn)β-葡聚糖酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活力可達(dá)998 U/mL。

產(chǎn)葡聚糖酶的微生物主要包括細(xì)菌和真菌，已報道的有：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtlis）［8-9］、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）［10-11］、碎囊毛霉（Mucor petrinsularis）［12］、盾殼霉（Coniothyrium minitans）［13］、康氏木霉（Trichoderma koningii）［14］、熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）［15］、黑曲霉（Aspergillus niger）［17］、局限曲霉 （Spergillus restrictus）［17］等。

Bano等［18］以廉價甘蔗渣為主要碳源，確定枯草芽孢桿菌產(chǎn)β-葡聚糖酶的最優(yōu)條件為：溫度60 ℃、pH 7.0。Zhang Dianpeng［19］和Chu［20］等測得畢赤酵母屬Guilliermondii M8的葡聚糖酶基因是糖苷水解酶家族的PgExg1，并嫁接此基因到大腸桿菌中。Jung等［21］提取南極彈尾蟲體內(nèi)的β-葡聚糖酶基因，并導(dǎo)入大腸桿菌，獲得重組蛋白工程菌，所產(chǎn)β-葡聚糖酶對海帶多糖水解效果顯著。盡管國內(nèi)外研發(fā)的β-葡聚糖酶已經(jīng)具有很強(qiáng)的工業(yè)潛力，但是關(guān)于β-葡聚糖酶發(fā)酵動力學(xué)模型的研究報道較少。

本課題組研究了Bacillus subtilis ZJF-15發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶的最適溫度為35～37 ℃。在此基礎(chǔ)上，本實驗在5 L發(fā)酵罐中研究了不同溫度對菌體生長、底物消耗和產(chǎn)酶量的影響。建立了B. subtilis ZJF-15分批發(fā)酵菌體生長、底物消耗和β-葡聚糖酶產(chǎn)酶的動力學(xué)方程，為β-葡聚糖酶生物技術(shù)發(fā)展及挖掘其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用潛力提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

B. subtilis ZJF-15 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院。

地衣多糖 美國Sigma公司；大麥粉為市售；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Biof-2005型5 L全自動控制發(fā)酵罐 上海理工大學(xué)高機(jī)實業(yè)總公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵培養(yǎng)

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵，裝料系數(shù)0.6、接種量5%、發(fā)酵溫度35～37 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，復(fù)膜氧電極和pH電極在線測定發(fā)酵過程中的溶解氧和pH值變化，每隔4 h取樣，測定總糖質(zhì)量濃度、還原糖質(zhì)量濃度、β-葡聚糖酶活力、α-淀粉酶活力和中性蛋白酶活力及菌體生物量。

1.3.2發(fā)酵液收集及組分測定

發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨進(jìn)行鹽析分級，收集35%～75%的組分，該組分保留了大部分的β-葡聚糖酶、α-淀粉酶和蛋白酶。含有β-葡聚糖酶的組分經(jīng)脫色、脫鹽、濃縮后上Sephadex G-100柱，獲取純品；β-葡聚糖酶活力、發(fā)酵液中總糖和還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［22］；中性蛋白酶活力的測定采用福林-酚法［23］；α-淀粉酶活力的測定采用BPNPG7法［24］；生物量的測定采用干質(zhì)量法［25］。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵代謝產(chǎn)物的確定

發(fā)酵液中高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)首先會被洗脫下來（峰Ⅰ），緊接為α-淀粉酶（峰Ⅱ），隨后的第3峰主要為β-葡聚糖酶，其間混雜著少量的α-淀粉酶和中性蛋白酶（圖1）。峰Ⅲ組分經(jīng)濃縮后取一部分上DEAE-Cellulose 52離子交換層析柱，得到3 個峰，峰Ⅰ為蛋白酶，緊接著的峰Ⅱ為α-淀粉酶，最后出現(xiàn)的是β-葡聚糖酶蛋白峰（峰Ⅲ）（圖2）。

圖1　發(fā)酵液的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.1　Elution curve of fermentation broth on Sephadex G-100

圖2　2 β-葡聚糖酶的DEAE-Cellulose 52洗脫曲線Fig.2　Elution curve of β-glueanase on DEAE-Cellulose 52

2.2發(fā)酵溫度對B. subtilis ZJF-15產(chǎn)酶的影響

2.2.1發(fā)酵溫度對菌體生長的影響

圖3　發(fā)酵溫度對菌體生長的影響Fig.3　Effect of culture temperature on the growth of B. subtilis ZJF-15

升高溫度可加快菌體生長，有利于菌體生物量的積累。由圖3可知，在35 ℃時，菌體生長較為緩慢，細(xì)胞比生長速率（細(xì)菌生物量對時間求導(dǎo)即為比生長速率）μ=0.114 9 h-1，發(fā)酵至28 h時菌體生物量為13.22 g/L，達(dá)到最大；升高發(fā)酵溫度，菌體比生長速率加快，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時，菌體比生長速率為0.148 5 h-1，在發(fā)酵24 h時，菌體生物量最大，為12.88 g/L。

圖4　發(fā)酵溫度對底物消耗的影響Fig.4　Effects of culture temperature on substrate consumption

2.2.2發(fā)酵溫度對底物消耗的影響由圖4可知，發(fā)酵溫度不同，發(fā)酵液中溶氧水平不同，底物消耗速率也不同，結(jié)果見圖4。兩種發(fā)酵溫度條件下的糖耗曲線相似，菌體生長初始階段的糖耗速率較快，當(dāng)菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長后期至穩(wěn)定期，糖耗速率下降；到發(fā)酵后期，發(fā)酵液中總糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。

2.2.3發(fā)酵溫度對β-葡聚糖酶產(chǎn)生的影響

圖5　發(fā)酵溫度對產(chǎn)β-葡聚糖酶水平的影響Fig.5　Effect of culture temperature on β-glucanase production

由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中β-葡聚糖酶的水平明顯提高，發(fā)酵產(chǎn)酶高峰也提前。β-葡聚糖酶水平在37 ℃條件下最高，在發(fā)酵36 h時，β-葡聚糖酶活力為207.18 U/mL。

2.2.4發(fā)酵溫度對產(chǎn)α-淀粉酶的影響

圖6　發(fā)酵溫度對產(chǎn)α-淀粉酶的影響Fig.6　Effect of culture temperature on α-amylase production

由圖6可知，產(chǎn)α-淀粉酶的水平受溫度的影響與β-葡聚糖酶略有不同。隨溫度的升高，雖然有利于菌體的生長，但發(fā)酵液中還原糖水平明顯提高，B. subtilis ZJF-15 α-淀粉酶受末端代謝產(chǎn)物的抑制，高質(zhì)量濃度的還原糖抑制了α-淀粉酶編碼基因的表達(dá)。

2.2.5發(fā)酵溫度對產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖7　發(fā)酵溫度對產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.7　Effect of culture temperature on protease production

如圖7所示，產(chǎn)中性蛋白酶水平隨溫度的降低而急劇增大，在37 ℃和35 ℃條件下分別在44、40 h時的產(chǎn)酶水平最高，分別為206.7 U/mL和218.42 U/mL。

2.3生長曲線及代謝規(guī)律的發(fā)酵動力學(xué)模型

在37 ℃條件下，從分批發(fā)酵的實驗結(jié)果（圖8、9）可以看出，B. subtilis ZJF-15的菌體生長曲線較典型，生長曲線與耗糖曲線在細(xì)胞生長期間呈影鏡關(guān)系。β-葡聚糖酶的活力隨菌體生物量的增加而逐漸增加，在菌體進(jìn)入對數(shù)生長后期至穩(wěn)定期，菌體發(fā)生自溶，β-葡聚糖酶開始大量產(chǎn)生。

圖8　間歇培養(yǎng)中菌體生長和底物消耗Fig.8　Cell growth and substrate consumption in batch culture

圖9　間歇培養(yǎng)中菌體生長和產(chǎn)酶水平Fig.9　Cell growth and enzyme production in batch culture

菌體生長的動力學(xué)方程為：

式中：cx為菌體生物量/（g/L）；t為發(fā)酵時間/h；μ為比生長速率/h-1；μmax為最大比生長速率/h-1；cs為限制性底物質(zhì)量濃度/（g/L）；Ks為飽和常數(shù)/（g/L）。

由公式（1）、（2）得：

底物消耗動力學(xué)方程為：

相關(guān)數(shù)據(jù)代入公式（4），得

產(chǎn)物形成動力學(xué)方程為：

式中：α為與菌體生長偶聯(lián)的產(chǎn)物生成系數(shù)；β為經(jīng)驗常數(shù)；rp為產(chǎn)物的生成速率/（g/（L·h））；rx為細(xì)胞的增殖速率/（g/（L·h））；cx為菌體生物量/（g/L）；cp為產(chǎn)物質(zhì)量濃度/（g/L）。

相關(guān)數(shù)據(jù)代入公式（6），得

利用Matlab統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)（圖8、9）擬合，得各參數(shù)，見表1。

表1　模型參數(shù)計算結(jié)果Table1　Determination of model parameters for B. subtiilliiss ZJF-15 growth， substrate consumption and enzyme production in batch culture

利用模型公式（1）～（7）計算的cs、cx、cp與實驗數(shù)據(jù)比較，結(jié)果見圖10、11。可知上述方程能較好擬合實驗所得數(shù)據(jù)，模型能很好地描述菌體生長、酶產(chǎn)生及底物消耗的規(guī)律。

圖10　間歇培養(yǎng)中菌體生長和底物消耗模型擬合曲線Fig.10　Fitting curves of the models for cell growth and substrate consumption in batch culture

圖11　間歇培養(yǎng)中菌體生長和產(chǎn)β-葡聚糖酶模型擬合曲線Fig.11　Fitting curves of the model for cell growth and enzyme production in batch culture

3　結(jié) 論

發(fā)酵溫度升高可加快菌體生長，但不利于菌體生物量的積累。溫度升高，發(fā)酵液中產(chǎn)β-葡聚糖酶水平明顯提高，發(fā)酵產(chǎn)酶高峰也提前。產(chǎn)β-葡聚糖酶水平在37 ℃條件下最大，且在36 h時，β-葡聚糖酶活力為207.18 U/mL。產(chǎn)α-淀粉酶的水平隨溫度的降低而急劇增大。B. subtilis ZJF-15分批發(fā)酵菌體生長，采用的是“部分生長偶聯(lián)型”動力學(xué)模型進(jìn)行擬合。底物消耗和β-葡聚糖酶產(chǎn)酶動力學(xué)模型能很好地描述菌體生長、酶生產(chǎn)及底物消耗規(guī)律。

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Kinetic Study of β-Glucanase Production by Batch Fermentation at Different Temperatures

ZHAO Xiyue， SONG Houyu， CAI Zhiqiang， CHEN Xiaohua
（School of Pharmaceutical and Life Science， Changzhou University， Changzhou 213164， China）

The effect of different temperatures on the growth of Bacillus subtilis ZJF-15， substrate consumption and β-glucanase production was studied by conducting batch fermentation experiments in a 5-L fermentation tank. The fermentation conditions were determined as 400 r/min， 1.0 L/（L·min）， 7.0， 5%， 0.6 and 35-37 ℃ for rotating speed，ventilation rate， initial fermentation pH， inoculum quantity， medium loading coeffi cient and culture temperature， respectively. The results showed that increased culture temperature led to a higher reaction rate， accelerated bacterial growth and metabolism， earlier production of β-glucanase， faster enzyme inactivation， shortened fermentation period and fi nally reduced production of β-glucanase. The kinetic equations for bacterial growth， substrate consumption and β-glucanase production of Bacillus subtilis ZJF-15 were established by batch fermentation.

Bacillus subtilis； β-glucanase； batch fermentation； temperature； kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201619035

Q815

A

1002-6630（2016）19-0211-05

趙希岳， 宋厚煜， 蔡志強(qiáng)， 等. 不同溫度對β-葡聚糖酶分批發(fā)酵動力學(xué)的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 211-215.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619035. http：//www.spkx.net.cn

ZHAO Xiyue， SONG Houyu， CAI Zhiqiang， et al. Kinetic study of β-glucanase production by batch fermentation at different temperatures［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 211-215. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619035. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-29

江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項目（CX09S-010Z）；江蘇省企業(yè)研究生工作站項目（20130605）

趙希岳（1965—），男，教授，博士，研究方向為生物化工。E-mail：Xyzhao@cczu.edu.cn