侯雪嬌，吳科敏，莫國東，劉書宏，言天久，焦鵬濤，韋　平，*

（1.廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所，廣西 南寧 530005；2.廣西畜牧研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西百色市畜牧技術(shù)推廣站，廣西 百色 533000）

食源性沙門氏菌耐藥表型與耐藥基因的研究

侯雪嬌1，吳科敏1，莫國東2，劉書宏1，言天久3，焦鵬濤1，韋平1，*

（1.廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病研究所，廣西 南寧 530005；2.廣西畜牧研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西百色市畜牧技術(shù)推廣站，廣西 百色 533000）

為了解食源性沙門氏菌（Salmonella）的耐藥狀況以及耐藥基因與耐藥表型的關(guān)系，從基因水平上探究Salmonella的耐藥機(jī)制。本研究對(duì)215 株分離自1 093 份市售新鮮肉類中的Salmonella進(jìn)行了耐藥狀況檢測，設(shè)計(jì)了16 種引物對(duì)耐藥基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。結(jié)果顯示，分離株對(duì)磺胺異惡唑耐藥率最高（71.7%），其次為四環(huán)素（69.8%）、甲氧嘧啶（67.9%）和復(fù)方新諾明（52.8%），分離株對(duì)環(huán)丙沙星、呋喃妥因和頭孢類比較敏感。三重及以上耐藥的菌株占60.5%，最多可以耐受13 種抗生素；PCR共擴(kuò)增到10 種耐藥基因，測序結(jié)果表明擴(kuò)增到的序列與GenBank上相應(yīng)參考序列的相似性均在99%以上；β-酰胺類以及四環(huán)素類的耐藥基因檢出情況與耐藥表型具有很高的一致性，符合率均在90%以上，其次為磺胺類（81.6%）。說明本研究中的食源性Salmonella分離株的耐藥率高，多重耐藥情況較為嚴(yán)重，耐藥表型與耐藥基因檢測結(jié)果基本一致。

食品安全；沙門氏菌；抗生素；耐藥表型/耐藥基因

隨著世界貿(mào)易的全球化，食品安全也日益成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將2015年世界衛(wèi)生日的主題定為“食品安全”，旨在呼吁全球人共同關(guān)注食源性疾病，保障人類餐桌的安全。沙門氏菌（Salmonella）是一種重要食品源性病原菌，世界上每年都會(huì)有數(shù)以百萬計(jì)的人死于Salmonella的感染［1］。美國疾病預(yù)防與控制中心2013年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在引起食品中毒的細(xì)菌、病毒以及其他病原中，Salmonella占首位，并且在過去的16 年里Salmonella的感染狀況并沒有減少的趨勢［2］。

自20世紀(jì)40年代被人類發(fā)現(xiàn)以來，抗生素在對(duì)抗Salmonella等細(xì)菌性疾病方面起到了卓越的貢獻(xiàn)，但是近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，尤其是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及畜牧業(yè)中為防治疾病感染以及促生長為目的的不合理使用，導(dǎo)致菌群中的敏感菌株逐漸被殺滅，抗性菌株被選擇或誘導(dǎo)出來，大量增殖并且成為優(yōu)勢群體［3-4］。耐藥菌不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也通過食品的污染威脅著人類的健康。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，世界上每年有1 700萬 人死于各類細(xì)菌、病毒等傳染病，而細(xì)菌耐藥性的廣泛傳播以及多重耐藥現(xiàn)象是其中最主要的原因之一［5］。細(xì)菌的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生比較復(fù)雜，目前研究認(rèn)為主要是通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)基因原件的介導(dǎo)下通過耐藥基因的水平傳播獲得耐藥性［6］。本研究檢測了廣西地區(qū)3 個(gè)城市的鮮肉類食品源性Salmonella耐藥狀況和耐藥基因，以建立本地區(qū)的耐藥基因庫，有利于從根源上了解耐藥性的產(chǎn)生的機(jī)制及其快速檢測，完善對(duì)耐藥食品源性Salmonella的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，指導(dǎo)合理的臨床用藥。

1　材料與方法

1.1材料

2012年1月—2015年7月間，自南寧、欽州、百色市的超市和自由市場中采集1 093 份鮮肉（包括豬肉297 份、牛肉255 份、雞肉276 份、鴨肉265 份）并參照Salmonella國標(biāo)檢測方法GB 4789.4—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》［7］進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)沙門菌屬保守基因invA特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）［8］和生化實(shí)驗(yàn)雙重鑒定并用沙門菌屬診斷血清進(jìn)行血清分型，獲得215 株食源性Salmonella。

1.1.2培養(yǎng)基與試劑

MH瓊脂購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

PCR以及克隆測序試劑：2×Taq Master Mix、100 bp DNA Ladder、DL2000 Marker 日本TaKaRa公司；PUC-T TA快速連接試劑盒 北京康為生物科技有限公司；感受態(tài)細(xì)胞 北京天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3藥敏紙片

共選擇8 類抗生素中的16 種常規(guī)藥敏紙片，包括：青霉素類中的氨芐西林、阿莫西林；第三代頭孢類中的頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松；磺胺類及其增效劑中的復(fù)方新諾明、甲氧嘧啶、磺胺異惡唑；氨基糖苷類中的慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素；喹諾酮類中的環(huán)丙沙星、萘啶酸；四環(huán)素類中的四環(huán)素；硝基呋喃類中的呋喃妥因；氯霉素類中的氯霉素，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC 25922，由廣西北海進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局贈(zèng)予。

1.2方法

1.2.1Salmonella分離株耐藥表型的檢測

新生兒肺透明膜病伴羊水吸入性肺炎死亡法醫(yī)解剖附1例報(bào)告 …………陳嘉妮，陳繼樑，楊文仲，楊開明（82）

采用WHO推薦使用的Kirby-Bauer法（紙片瓊脂擴(kuò)散法）檢測215 株分離株對(duì)8 類16 種供試抗生素的敏感性，簡要步驟如下：挑取營養(yǎng)瓊脂上純培養(yǎng)的待檢菌株，同時(shí)以大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，懸于4 mL生理鹽水中，用細(xì)菌濁度儀測量并將濁度調(diào)整到0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，取無菌棉簽將菌液均勻涂布于MH瓊脂上，用無菌鑷子貼上藥敏紙片，于37 ℃孵育18～24 h后取出，結(jié)果參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2012版［9］藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2Salmonella分離株耐藥基因的PCR檢測

采用熱裂解法［10］提取細(xì)菌的總DNA，具體操作如下：取細(xì)菌純培養(yǎng)物一環(huán)，置于1.5 mL的EP管中，加入25 mmol/L的NaOH 50 μL混合均勻后100 ℃水浴10 min，然后加入4 μL 1 mol/L的Tris-HCl，將上述混懸液12 000 r/min離心5 min，上清液即為DNA提取物。

根據(jù)GenBank中收錄的耐藥基因序列以及相關(guān)文獻(xiàn)［11-12］，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)16 對(duì)引物，分別擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類、氯霉素類、氨基糖苷類的耐藥基因，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：Mix 12.5 mL，20 μmol/L的上下游引物各0.5 mL，DNA模板2 mL，加滅菌超純水配成25 μL的體系；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，退火30 s（各引物退火溫度見表1），72 ℃延伸35 s，循環(huán)30 次后72 ℃終延伸2 min。產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照。

表1　耐藥基因PCR引物及其序列Table1　PCR primers for antimicrobial-resistant genes

1.2.3Salmonella分離株耐藥基因的克隆與測序

對(duì)PCR陽性擴(kuò)增片段參照試劑盒說明書說進(jìn)行凝膠回收；取膠回收產(chǎn)物3 μL、PUC-T載體1 μL、連接Buffer 5 μL、T4 DNA Ligase 1 μL，混勻后于25 ℃反應(yīng)5 min，4 ℃保存?zhèn)溆?；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank上收錄的序列進(jìn)行同源性比對(duì)、分析。

2　結(jié)果與分析

2.1Salmonella分離株耐藥表型測定結(jié)果

由圖1藥敏實(shí)驗(yàn)表明，Salmonella分離株對(duì)磺胺異惡唑、四環(huán)素、甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，耐藥率均在50%以上（耐藥率分別為：磺胺異惡唑71.7%、四環(huán)素69.8%、甲氧嘧啶67.9%、復(fù)方新諾明52.8%）；其次為青霉素類的氨芐西林和阿莫西林；分離株對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為不同程度的耐藥性，其中對(duì)鏈霉素比較耐藥而對(duì)慶大霉素較為敏感，前者耐藥率高于后者20%以上；分離株對(duì)環(huán)丙沙星和呋喃妥因最為敏感。多重耐藥分析結(jié)果顯示，除了26 株對(duì)16 種供試藥物全部敏感外，其余189 株均有不同程度的耐藥性，其中耐3 種及以上抗生素的有130 株，占分離株的60.5%；耐5 種及以上抗生素的有93 株，占分離株的43.2%；耐10種及以上的有13 株，其中有4 株分離株可耐受高達(dá)13 種抗生素，這4 株分離株血清分型的結(jié)果：有2 株為S. enteritidis，另2 株分別為S. newlands和S. derby，其中前3 株均分離自欽州市，另1 株分離自南寧市。

圖1　1 Salmonellanella分離株對(duì)16 種抗生素的耐藥狀況Fig.1　Drug resistances of Salmonella isolates against 16 antibiotics

2.2Salmonella分離株耐藥基因的檢測結(jié)果

表2　耐藥基因檢出情況及測序的結(jié)果Table2　Detection of drug-resistant genes and sequence analysis

由表2可知，共擴(kuò)增檢測到了10 種耐藥基因，其中β-內(nèi)酰胺類檢測到了blaTEM-I，blaPSE-1和blaCMY-2未檢測到；磺胺類中以sulⅡ檢出率最高，其次為sulI與sulⅢ，其中有4 個(gè)分離株同時(shí)檢測到sulI、sulⅡ與sulⅢ這3 種基因，24 個(gè)分離株同時(shí)檢測到sulI與sulⅡ基因，另有18 個(gè)分離株同時(shí)檢測到sulⅢ與sulⅡ基因；氨基糖苷類中以strB檢出最高，其次為aadA1，而aadB、aph（3’）-Ⅱa未檢測到；氯霉素類以flo檢出率最高，其次為cmLA，cat1未檢測到，其中有16 個(gè)分離株同時(shí)檢測到flo與cmLA基因；四環(huán)素類檢測到了tetA、tetB，而tetG未檢測到，其中有15 株同時(shí)攜帶有tetA與tetB基因，另外在4 株四環(huán)素敏感菌株中也擴(kuò)增到了tetB基因。耐藥基因序列的測定結(jié)果顯示，本研究中擴(kuò)增到的耐藥基因與GenBank收錄的參考序列的DNA相似性很高，都在99%以上。

表3　耐藥基因的檢出與耐藥表型的符合情況Table3　Consistency between drug-resistant phenotypes and drug-resistant geenneess

另外，由表3可知，215 個(gè)分離株對(duì)5 類抗生素耐藥基因的檢出情況與耐藥表型的符合率都在70%以上，其中β-酰胺類以及四環(huán)素類的一致性最高，兩者符合率均在90%以上，其次為磺胺類（87.7%），而氨基糖苷類和氯霉素類的符合率則相比而言較低，其符合率分別為73.3%與74.1%。

3　討 論

本研究中的食源性Salmonella分離株耐藥問題比較嚴(yán)重，除了環(huán)丙沙星、呋喃妥因和第三代頭孢類比較敏感外，對(duì)磺胺類及其增效劑、四環(huán)素類以及β-內(nèi)酰胺類等都產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，尤其是磺胺類，已高達(dá)71.7%。而黃志廣等［13］在佛山農(nóng)貿(mào)市場分離的食源性Salmonella對(duì)呋喃妥因和氯霉素耐藥率高，楊保偉等［14］自陜西地區(qū)零售畜禽肉中分離的Salmonella對(duì)四環(huán)素、鏈霉素和卡那霉素耐藥性最強(qiáng)，說明在不同時(shí)間、不同地區(qū)，由于生產(chǎn)中的用藥情況的不同，其分離的Salmonella的耐藥狀況會(huì)有所不同；另外，本研究中對(duì)3 種及以上抗生素耐藥的菌株占60.5%，耐10種以上的有13 株，有4 株分離株甚至可耐受高達(dá)13 種抗生素，這4 株中有3 株分離自欽州市，欽州市養(yǎng)殖業(yè)起步較早，但多年來發(fā)展緩慢，大部分仍為農(nóng)戶型的小養(yǎng)殖場，大型、規(guī)范化的養(yǎng)殖場卻寥寥無幾，由于農(nóng)戶缺乏飼養(yǎng)管理相關(guān)知識(shí)，抗生素濫用情況比較普遍，這是欽州株耐藥性比較嚴(yán)重的一個(gè)重要原因。以上數(shù)據(jù)說明食源性Salmonella分離株的耐藥問題已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重，應(yīng)該引起高度重視。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年有大約90%的抗生素用于食用動(dòng)物的飼料添加劑和疾病的防治，其中以作為飼料添加劑為主，只有10%用于人類疾病的治療［15］。畜禽養(yǎng)殖中這種長期、少量的預(yù)防性或者促生長為目的用藥是誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因。Salmonella作為一種食品源性病原菌，又是人畜共患病原，其耐藥的產(chǎn)生給臨床治療帶來了很大的挑戰(zhàn)，多重耐藥菌株的感染暴發(fā)將會(huì)給人類健康帶來災(zāi)難性的后果［16-17］。

本研究的215 株分離株中，氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、氨基糖苷類和四環(huán)素類5 類抗生素中檢測到的優(yōu)勢耐藥基因分別為flo、blaTEM-I、sulⅡ、strB、tetA。5 類耐藥基因檢出情況與耐藥表型的符合率都在70%以上，但是不同類抗生素耐藥基因與耐藥表型符合率有所差別，其中β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類的符合率都在90%以上，而氯霉素類和氨基糖苷類的符合率均在70%左右；另外，本研究中有4 株四環(huán)素類敏感菌株中也檢測到了tetB基因。說明耐藥表型與耐藥基因的存在有密切的關(guān)系，但是又遵循嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因?yàn)榧?xì)菌的耐藥機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，耐藥基因的位置（是在質(zhì)粒上抑或是染色體上）、其遺傳結(jié)構(gòu)如何、耐藥基因的表達(dá)情況、不同耐藥基因之間的相互作用、細(xì)菌生物膜的形成等都會(huì)影響細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性，細(xì)菌對(duì)一種藥物的耐藥可能是幾種耐藥基因和耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果［18-19］，這些機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。本研究中對(duì)耐藥基因序列的測定結(jié)果表明，耐藥基因的序列與參考序列的相似性很高，均在99%以上，有些即使個(gè)別堿基發(fā)生了突變，但其氨基酸序列相似性依然很高。劉芳菲等［20］在雞源Salmonella中檢測到的blaTEM-1、tetA等11 種耐藥基因，王利勤等［21］在雞源大腸埃希菌中檢測到的aac（3）-Ⅱ、aph（3’）-I和aac（6’）-I等耐藥基因與參考序列的相似性也均在97%以上，說明細(xì)菌的耐藥基因比較穩(wěn)定，自然條件下突變率較低。

本研究對(duì)廣西地區(qū)3 個(gè)城市的肉類食品Salmonella的耐藥性檢測結(jié)果表明，本地食源性Salmonella耐藥率比較高、多重耐藥比較嚴(yán)重，耐藥基因與耐藥性相關(guān)性較強(qiáng)、耐藥機(jī)制復(fù)雜，不同類抗生素的耐藥基因與耐藥表型的符合率不同，很多耐藥機(jī)制還需要進(jìn)行更加深入的研究。為防止Salmonella耐藥性的產(chǎn)生和指導(dǎo)合理的臨床用藥提供理論依據(jù)，呼吁養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)立即減少動(dòng)物飼養(yǎng)中促生長性與預(yù)防性抗生素的使用，盡量通過藥敏實(shí)驗(yàn)選擇敏感藥物進(jìn)行細(xì)菌性疾病的治療，并且采用聯(lián)合用藥與交替用藥的方法減少耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)及時(shí)研發(fā)新藥或使用微生態(tài)制劑等抗生素替代物，以減少食源性Salmonella的耐藥性，保障人類的安全。

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Evaluation of Drug-Resistant Phenotypes and Genes in Foodborne Salmonella Isolates

HOU Xuejiao1， WU Kemin1， MO Guodong2， LIU Shuhong1， YAN Tianjiu3， JIAO Pengtao1， WEI Ping1，*
（1. Institute for Poultry Science and Health， Guangxi University， Nanning 530005， China； 2. Institute of Animal Husbandry in Guangxi， Nanning 530001， China； 3. Animal Husbandry Technology Promotion Station of Baise， Baise 533000， China）

In order to investigate the relationship between drug-resistant phenotypes and genes and explore the mechanism of drug resistance at the gene level， a total of 215 Salmonella strains isolated from 1 093 retail meat samples were assayed for antimicrobial susceptibility. Totally 16 pairs of primers were designed to amplify the drug-resistant genes and sequence homology was detected after T-A cloning. Results indicated that the Salmonella isolates showed the highest resistance to sulfisoxazole （SIZ） （71.7%）， followed by tetracycline （TET） （69.8%）， trimethoprim （TMP） （67.9%） and compound sulfamethoxazole （TSU） （52.8%）， and all these isolates were sensitive to ciprofloxacin （CIP）， nitrofurantoin （NIT） and cephalosporin. Approximately 60.5% of these isolates showed resistance to at least 3 kinds of antibiotics， and 4 of them were even resistant to 13 drugs. Ten drug-resistant genes were detected and they were found to share a homology higher than 99% with

equences. The consistency rates between drug-resistant phenotype and drug-resistant gene for β-lactams and tetracycline were both higher than 90%， followed by sulfonamides （81.6%）. This study demonstrated that the drug resistance rate of foodborne Salmonella was high and their multi-drug resistance was serious. And the results of detection of drugresistant phenotypes and drug-resistant genes were consistent.

food safety； Salmonella； antibiotics； antimicrobial resistance phenotype/resistance genes

10.7506/spkx1002-6630-201619028

TS201.6

A

1002-6630（2016）19-0166-05

侯雪嬌， 吳科敏， 莫國東， 等. 食源性沙門氏菌耐藥表型與耐藥基因的研究［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 166-170.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619028. http：//www.spkx.net.cn

HOU Xuejiao， WU Kemin， MO Guodong， et al. Evaluation of drug-resistant phenotypes and genes in foodborne Salmonella isolates［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 166-170. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619028. http：//www.spkx.net.cn

2015-11-04

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科重14121003-4-1）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（廣西肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)（nycytxgxcxtd-04-20-2）

侯雪嬌（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭吃葱圆≡?。E-mail：houxuejiaomk@163.com

韋平（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称吩葱圆≡臋z測技術(shù)。E-mail：pingwei8@126.com