劉超帝，繆禮鴻*，陳　瑾，劉蒲臨

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

耐高溫酵母菌的篩選及其乙醇發(fā)酵特性

劉超帝，繆禮鴻*，陳瑾，劉蒲臨

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

采用平板分離法，從29 份新鮮采集的土樣中分離獲得64 株耐高溫酵母菌株，并對(duì)其在高溫條件下的乙醇發(fā)酵性能進(jìn)行了分析比較。26S rDNA D1/D2區(qū)域序列測(cè)定和生理特征分析結(jié)果表明，這些酵母菌株在親緣關(guān)系上可歸類(lèi)于6 個(gè)屬7 個(gè)種，分別為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）（占總分離株的39.1%）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）（占23.4%）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）（占29.7%）、季也蒙畢赤酵母（M. guilliermondii）（占1.6%）、Kazachstania bovina（占1.6%）、Candida palmioleophila（占1.6%）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（占3.1%）。其中，馬克斯克魯維酵母的耐高溫能力和乙醇發(fā)酵能力最強(qiáng)；40 ℃條件下發(fā)酵72 h后，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)最高可達(dá)6.56%，顯著高于相同條件下其他耐高溫酵母的乙醇產(chǎn)量。上述結(jié)果表明，馬克斯克魯維酵母在高溫乙醇發(fā)酵過(guò)程中具有明顯優(yōu)勢(shì)，可作為利用生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良候選菌株。

耐高溫酵母菌；生物多樣性；26S rDNA；乙醇發(fā)酵

高溫真菌是一類(lèi)能在高溫條件下生長(zhǎng)的極端環(huán)境真核微生物。目前，國(guó)際學(xué)術(shù)界將高溫真菌分為兩類(lèi)，一類(lèi)為嗜熱真菌，菌株最高生長(zhǎng)溫度為50 ℃或50 ℃以上，最低生長(zhǎng)溫度為20 ℃或20 ℃以上；另一類(lèi)為耐熱真菌，菌株最高生長(zhǎng)溫度在50 ℃左右（通常為40 ℃或40 ℃以上），最低生長(zhǎng)溫度在20 ℃以下的特殊菌群［1-3］。酵母菌是一類(lèi)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的單細(xì)胞真菌。迄今為止，所報(bào)道的耐高溫酵母屬有畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬、假絲酵母屬、德巴利酵母屬和豆孢酵母屬等［4-7］。

高溫發(fā)酵生產(chǎn)乙醇具有冷卻成本低，污染風(fēng)險(xiǎn)小，節(jié)約糖化酶的使用等多種優(yōu)點(diǎn)，關(guān)注度逐年增高。Abdel-Banat等［8］研究指出，一個(gè)產(chǎn)能為3×107L的乙醇發(fā)酵企業(yè)，如果將發(fā)酵溫度提升5 ℃，僅冷卻成本即可節(jié)約3萬(wàn) 美元。尤其是高溫同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇技術(shù)，不僅可以減少葡萄糖對(duì)酶的抑制作用，還能進(jìn)一步的簡(jiǎn)化發(fā)酵過(guò)程和設(shè)備，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯［9］。然而，目前所廣泛使用的釀酒酵母，最佳發(fā)酵溫度僅為28～33 ℃［10］，一般不超過(guò)36 ℃，限制了高溫同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。篩選獲取在高溫條件下具有良好的乙醇發(fā)酵性能的酵母菌株，成為提高該工藝乙醇產(chǎn)率的關(guān)鍵。因此，國(guó)內(nèi)外乙醇生產(chǎn)企業(yè)都十分重視耐高溫酵母菌的選育工作。Edgardo等［11］篩選到兩株可以在42 ℃條件下生長(zhǎng)的耐高溫釀酒酵母菌株；利用這些菌株進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵，實(shí)際產(chǎn)率為理論產(chǎn)率的50%～80%。Dhaliwal等［12］以含有體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的甘蔗汁作為富集培養(yǎng)基篩選到一株耐高溫的東方伊薩酵母，其在40 ℃條件下以甘蔗汁作為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵后，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到71.9 g/L，生產(chǎn)效率為4.0 g/（L·h）。田沈等［13］對(duì)一株耐高溫麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa）進(jìn)行高溫馴化，馴化后的菌株在46 ℃，含有5%葡萄糖培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能接近30 ℃條件下釀酒酵母的發(fā)酵水平；46 ℃條件下以3 g/100 mL玉米秸稈進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，得到13.93 g/L的乙醇，達(dá)到理論產(chǎn)率的88.2%。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)分離和篩選不同地域的耐高溫酵母菌株，并對(duì)相關(guān)菌株的耐溫性和產(chǎn)乙醇能力進(jìn)行比較研究，為耐高溫酵母菌資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來(lái)源

表1　采樣地名稱(chēng)Table1　Information of the soil samples used in this study

本研究共采集29 份新鮮的土壤樣品，土樣采集的范圍包括：云南省、湖北省、廣東省、河北省、山東省、內(nèi)蒙古自治區(qū)，詳見(jiàn)表1。

1.1.2試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP和DL2000 Marker 寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司合成；葡萄糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司；蜜二糖阿拉丁試劑（上海）有限公司；菊糖 北京博奧拓科技有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基采用豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基［5］：黃豆芽200 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。分離選擇培養(yǎng)基采用馬丁孟加拉紅-鏈霉素培養(yǎng)基［14］：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉紅33.4 mg、蒸餾水100 mL、鏈霉素溶液30 μg/mL。常規(guī)培養(yǎng)使用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、水1 000 mL。發(fā)酵采用葡萄糖乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基［15］：葡萄糖200 g、尿素5 g、CaCl20.55 g、蛋白胨10 g、KH2PO41 g、酵母粉6 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、水1 000 mL。同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母膏0.2 g、（NH4）2SO45.0 g、KH2PO41.0 g、水1 000 mL。所有固體培養(yǎng)基加入20 g/L瓊脂。以上培養(yǎng)基滅菌條件為115 ℃，30 min。

1.2儀器與設(shè)備

PCR儀 德國(guó)Biometra公司；SYDR/1305凝膠成像儀美國(guó)Syngene公司；ZXDP-A2160恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠(chéng)科技有限公司；ECLIPSE 80i顯微鏡 日本Nikon公司；7890A氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1耐高溫酵母菌株的分離與保藏

耐高溫酵母菌株分離方法：稱(chēng)取土樣1.0 g，加入到100 mL滅菌的富集培養(yǎng)基中，33 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)30 h。梯度稀釋后涂布于分離選擇培養(yǎng)基上，33 ℃靜置培養(yǎng)2～3 d后挑取形態(tài)不同的單菌落，鏡檢。形態(tài)初步確定為酵母后，多次劃線純化，獲得純培養(yǎng)物。42 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，挑取生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行真空冷凍干燥保存。

1.3.2酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)基因的擴(kuò)增及測(cè)序

1.3.2.1基因組DNA的提取

利用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法［16］提取酵母菌基因組DNA，檢測(cè)后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序

正向引物N L 1（5’-G C A T A T C A A T A AG C G G A G G A A A A G-3’）；反向引物N L 4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)32 次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.3序列分析和菌種鑒定

對(duì)篩選得到的所有菌株進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar軟件人工校對(duì)。校正以后的序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，比較測(cè)試菌株和已知酵母菌株之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，選取與測(cè)試菌株關(guān)系較近的模式菌株的Dl/D2區(qū)序列，用Clustal X進(jìn)行序列校準(zhǔn)排齊，再用Mega 4.0軟件鄰接法，進(jìn)行1 000 次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［17-19］。

1.3.4耐高溫酵母菌株的耐溫性能

先將酵母菌接種于YPD平板上33 ℃活化24 h，然后重新劃線接種于YPD平板上，分別置于42、45、47、50 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察酵母菌生長(zhǎng)情況。

1.3.5耐高溫酵母菌對(duì)碳源的利用

在同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加果糖、蔗糖、菊糖等18 種不同的糖類(lèi)為唯一碳源，115 ℃，30 min滅菌后，接種各測(cè)試菌株培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況。

1.3.6不同種屬耐高溫酵母在不同溫度條件下的耐乙醇能力

將酵母菌于YPD平板上33 ℃活化24 h，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h。采用血球板計(jì)數(shù)法［14］測(cè)總菌數(shù)以確定接種量，以2×108個(gè)/mL的接種量接入含有0%、4%、6%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中，置于35、42、45 ℃條件下170 r/min搖瓶培養(yǎng)6 h后，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌液的光密度（OD）值。每種酵母選取1 株酵母菌進(jìn)行測(cè)定，每株菌株做兩個(gè)重復(fù)。

1.3.7耐高溫酵母菌乙醇發(fā)酵能力的測(cè)定

將菌株在YPD固體平板上活化1 d，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h，即為種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)2.0%的接種量轉(zhuǎn)接至葡萄糖乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中。先將其在37℃、170 r/min培養(yǎng)6 h，然后于40 ℃條件下靜置厭氧發(fā)酵。發(fā)酵72 h后，取100 mL發(fā)酵液再加入100 mL蒸餾水，蒸餾，取100 mL餾出液用氣相色譜測(cè)其發(fā)酵液的乙醇含量［20］。每種酵母菌株挑選1～4 株進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)菌株做3 個(gè)重復(fù)。

1.3.8高溫條件下馬克斯克魯維酵母發(fā)酵能力的測(cè)定

將種子液按體積分?jǐn)?shù)2.0%的接種量轉(zhuǎn)接到葡萄糖乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中。37 ℃、170 r/min培養(yǎng)6 h，然后于42、45 ℃條件下進(jìn)行靜置發(fā)酵。發(fā)酵72 h后，取100 mL發(fā)酵液加入100 mL蒸餾水，蒸餾，取100 mL餾出液用氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵液的乙醇體積分?jǐn)?shù)。每株菌株做3 個(gè)重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌株的分離鑒定及種群分布

本研究共分離獲得耐高溫酵母菌64 株，分屬于6 個(gè)屬7 個(gè)種，其中，熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）25 株（占總分離株的39.1%）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）15 株（占23.4%）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）19 株（占29.7%）、季也蒙畢赤酵母（M. guilliermondii）1 株（占1.6%）、Kazachstania bovina 1 株（占1.6%）、Candida palmioleophila 1 株（占1.6%）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2 株（占3.1%），優(yōu)勢(shì)菌株為熱帶假絲酵母，其次是馬克斯克魯維酵母和東方伊薩酵母。湖北省和云南省采集的土樣最多，篩選和鑒定的菌株總數(shù)也最多。從分離結(jié)果看，熱帶假絲酵母的地域分布最廣（表2），云南、湖北、河北、山東和廣東5 個(gè)省的土樣中都能篩選到。

表2　耐高溫酵母菌的地理分布Table2　Geographical distribution of different thermotolerant yeasts 株

2.2耐高溫酵母菌株的耐溫性能測(cè)定結(jié)果

本研究所篩選到的15 株馬克斯克魯維酵母菌株均能在50 ℃條件下生長(zhǎng)；而在25株熱帶假絲酵母中，有13 株能在47 ℃條件下生長(zhǎng)，9 株能在45 ℃條件下生長(zhǎng)，3 株能在42 ℃條件下生長(zhǎng)。19 株?yáng)|方伊薩酵母中，18 株能在47 ℃條件下生長(zhǎng)，1 株能在45 ℃條件下生長(zhǎng)。C. palmioleophila能在45 ℃條件下生長(zhǎng)。所有的釀酒酵母、季也蒙畢赤酵母和K. bovina菌株均只能在42 ℃條件下生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，不同屬酵母菌的耐高溫能力不相同，同種酵母不同菌株之間的耐高溫能力也存在明顯差異，其中耐溫能力最好的是馬克斯克魯維酵母。每個(gè)種屬選取1～3 株作為代表菌株列出，各屬酵母菌株的耐溫性能見(jiàn)表3。

表3　酵母菌耐高溫能力Table3　Growth status of different yeast strains at different temperatures

2.3耐高溫酵母菌對(duì)碳源的利用結(jié)果

表4　酵母菌同化碳源結(jié)果Table4　Carbon assimilation of different yeast strains

2.4耐高溫酵母菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

根據(jù)目前酵母菌的分子分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)［18-21］，所測(cè)序菌株的D1/D2序列與已知種的相似性為99%以上并有形態(tài)特征的支持時(shí)，就可以做出種的鑒定。與最近緣的已知種的相似性在98%～99%之間時(shí)，就需要結(jié)合ITS序列分析和生理生化特征比較，對(duì)其作出分類(lèi)學(xué)鑒定。如果在98%或者以下時(shí)，則可初步確定為新種。由圖1可知，測(cè)試菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列與各模式菌株進(jìn)行序列比對(duì)，與相應(yīng)的模式菌株的相似性為99%～100%。

圖1　根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree based on the 26S rDNA D1/D2 region sequence

2.5不同種屬耐高溫酵母菌在不同溫度下的耐乙醇能力比較

圖2　不同耐高溫酵母菌株在不同溫度條件下的耐乙醇能力Fig.2　Ethanol tolerance of different thermotolerant yeasts at different temperatures

由于菌液濃度太高，35、42 ℃條件下0%乙醇的菌液為稀釋5 倍后的結(jié)果。由圖2可知，在不含乙醇的YPD培養(yǎng)基中，馬克斯克魯維酵母KMBM2-5在42 ℃的生長(zhǎng)情況略強(qiáng)于35 ℃；在42、45 ℃條件下，其生長(zhǎng)性能均強(qiáng)于其他5 種酵母菌，45 ℃尤為明顯。45 ℃條件下，在YPD液體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)性能的強(qiáng)弱順序是：馬克斯克魯維酵母K. marxianus＞熱帶假絲酵母C. tropicalis＞東方伊薩酵母I. orientalis＞季也蒙畢赤酵母M. guilliermondii＞釀酒酵母S. cerevisiae＞C. palmioleophila。

35 ℃條件下，對(duì)乙醇的耐受能力最好的是東方伊薩酵母IOTC2-2，它在添加了4%乙醇和6%乙醇的YPD培養(yǎng)基中表現(xiàn)出的耐受性均強(qiáng)于其他5 種酵母菌。在此溫度條件下，不同酵母菌株4%乙醇的耐受能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋簴|方伊薩酵母I. orientalis＞熱帶假絲酵母C. tropicalis＞釀酒酵母S. cerevisiae＞馬克斯克魯維酵母K. marxianus＞季也蒙畢赤酵母季也蒙畢赤酵母M. guilliermondii＞C. palmioleophila。6%乙醇的耐受能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋簴|方伊薩酵母I. orientalis＞釀酒酵母S. cerevisiae＞馬克斯克魯維酵母K. marxianus＞季也蒙畢赤酵母M. guilliermondii＞熱帶假絲酵母C. tropicalis＞C. palmioleophila。其中熱帶假絲酵母CTBK-2可以在4%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但在6%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中明顯受到抑制。在42 ℃和45 ℃條件下，6 種酵母菌對(duì)乙醇的耐受能力均不高，馬克斯克魯維酵母KMBM2-5的乙醇耐受能力要強(qiáng)于其他5 種酵母。整體上來(lái)說(shuō)，6 種酵母菌在42 ℃條件下的乙醇耐受能力要強(qiáng)于45 ℃。

2.6耐高溫酵母菌乙醇發(fā)酵能力的比較

圖3　不同耐高溫酵母菌株的產(chǎn)乙醇能力Fig.3　Ethanol fermentation by different thermotolerant yeasts

如圖3所示，同種酵母的乙醇發(fā)酵能力也存在顯著差異，如東方伊薩酵母菌株IOWHH-1與其他3 株?yáng)|方伊薩酵母的耐溫能力相同，但發(fā)酵能力卻偏低。40 ℃條件下所挑選的4 株馬克斯克魯維酵母的發(fā)酵能力均強(qiáng)于其他酵母菌株，發(fā)酵72 h后平均乙醇產(chǎn)量為體積分?jǐn)?shù)6.22%。其次為東方伊薩酵母，乙醇產(chǎn)量最高可達(dá)5.58%，4 株菌株的平均乙醇產(chǎn)量為體積分?jǐn)?shù)4.89%。熱帶假絲酵母和季也蒙畢赤酵母在40 ℃條件下的乙醇發(fā)酵能力均較弱，而C. palmioleophila在40 ℃條件下幾乎不產(chǎn)乙醇。圖4表明在乙醇發(fā)酵過(guò)程中，馬克斯克魯維酵母、東方伊薩酵母與釀酒酵母的最大生長(zhǎng)量較為相似，介于1.8×108～2.73×108CFU/mL之間。而季也蒙畢赤酵母與C. palmioleophila長(zhǎng)勢(shì)較弱，所達(dá)到最高菌落數(shù)僅為0.99×108CFU/mL和1.15×108CFU/mL。

圖4　不同耐高溫酵母菌株乙醇發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.4　Growth curves of different thermotolerant yeasts during ethanol fermentation

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)5 個(gè)省的29 份土樣的耐高溫酵母菌進(jìn)行了分離鑒定并對(duì)相關(guān)發(fā)酵特性進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，耐高溫酵母菌的物種具有一定的多樣性，而且在分布地域上存在一定的差異。從常年氣溫較高的云南省采集的土壤中更容易分離到耐高溫性能更好的酵母菌株，其中馬克斯克魯維酵母占優(yōu)勢(shì)；而從湖北省分離獲取的耐高溫酵母菌株中，東方伊薩酵母占優(yōu)勢(shì)，其耐熱性?xún)H次于馬克斯克魯維酵母；熱帶假絲酵母在多個(gè)土壤樣品中被分離獲得，分布地域較廣。

本研究曾利用豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基和YPD液體兩種富集培養(yǎng)基對(duì)采自湖北省黃岡市的同一種土壤進(jìn)行酵母菌的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基可以篩選到熱帶假絲酵母和馬克斯克魯維酵母兩種不同的酵母菌株，而利用YPD液體培養(yǎng)基，則可篩選到熱帶假絲酵母，K. bovina和東方伊薩酵母3 種酵母菌；這一現(xiàn)象表明，從土壤中分離得到的酵母菌種類(lèi)與所采用的培養(yǎng)基密切相關(guān)。王辰等［17］對(duì)海南熱帶雨林腐木上的酵母菌物種多樣性進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，同一樣品用兩種不同富集培養(yǎng)基所分離獲取的菌株，其種屬差異較大。此外，不同種屬的酵母菌以及同種酵母菌不同菌株之間在耐溫性和產(chǎn)乙醇能力等方面具有明顯差異。其中，馬克斯克魯維酵母在耐高溫性和乙醇發(fā)酵能力方面均明顯高于其他6 種耐高溫酵母，而東方伊薩酵母的耐乙醇能力最好。馬克斯克魯維酵母可在42～45 ℃條件下良好生長(zhǎng)，能夠在38～45 ℃間高效發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。Singh等［22］研究發(fā)現(xiàn)耐高溫的馬克斯克魯維酵母IMB3在42 ℃條件下發(fā)酵可以產(chǎn)生60 g/L的乙醇，和釀酒酵母在較低溫度條件下的乙醇產(chǎn)量相差無(wú)幾。Limtong等［23］以甘蔗汁為碳源并加入4%乙醇作培養(yǎng)基篩選到一株在40 ℃條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵的馬克斯克魯維酵母DMKU 3-1042，發(fā)酵48 h后乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到7.23%。Pang Zongwen等［24］在40 ℃條件下使用馬克斯克魯維酵母GX-15進(jìn)行發(fā)酵，乙醇最高產(chǎn)量為58 g/L。本研究所篩選得到的馬克斯克魯維酵母 KMBM1-2在40 ℃條件下發(fā)酵后，乙醇產(chǎn)量達(dá)到6.56%（53 g/L）顯著高于相同條件下其他耐高溫酵母的乙醇產(chǎn)量，與馬克斯克魯維酵母GX-15的發(fā)酵能力較為相似。由于高溫馴化，誘變技術(shù)以及發(fā)酵工藝改良已被證明可以提高乙醇產(chǎn)量，因此馬克斯克魯維酵母KMBM1-2的高溫乙醇發(fā)酵能力仍具有一定的提升空間。此外，馬克斯克魯維酵母可以在高溫條件下利用多種糖類(lèi)（包括：阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和木糖等）［9，25-26］，有利于充分利用各種生物質(zhì)原料，提高乙醇產(chǎn)量，具有良好的開(kāi)發(fā)利用潛力。

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Isolation and Alcohol Fermentation Characteristics of Thermotolerant Yeasts

LIU Chaodi， MIAO Lihong*， CHEN Jin， LIU Pulin
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

In this study， 69 thermotolerant yeast strains were isolated from 29 different soil samples， and the fermentation performance of these strains at high temperature was also detected. Based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and physiological characterization， these strains were phylogenetically related to 7 species in 6 genera， including Candida tropicalis （39.1% of the total yeast strains）， K. marxianus （23.4%）， I. orientalis （29.7%）， M. guilliermondii （1.6%）， K. bovina（1.6%）， C. palmioleophila （1.6%） and S. cerevisiae （3.1%）. C. tropicalis were the most widely distributed species. The best thermotolerant and ethanol fermentation ability were detected in K. marxianus. The ethanol production reached up to 6.56%（V/V） in 72 h at 40 ℃. These results demonstrated that K. marxianus has obvious advantages in ethanol fermentation at high temperature， which makes it a good potential candidate for commercial biomass ethanol production.

thermotolerant yeast； biodiversity； 26S rDNA； alcohol fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201619022

Q939.97

A

1002-6630（2016）19-0128-07

劉超帝， 繆禮鴻， 陳瑾， 等. 耐高溫酵母菌的篩選及其乙醇發(fā)酵特性［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 128-134. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619022. http：//www.spkx.net.cn

LIU Chaodi， MIAO Lihong， CHEN Jin， et al. Isolation and alcohol fermentation characteristics of thermotolerant yeasts［J］. Food Science，2016， 37（19）： 128-134. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619022. http：//www.spkx.net.cn

2015-11-13

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102805）

劉超帝（1989—），女，碩士研究生，主要從事環(huán)境與資源微生物研究。E-mail：liunan3585@163.com

繆禮鴻（1965—），男，教授，博士，主要從事環(huán)境與資源微生物研究。E-mail：miaowhpu@126.com