朱俊杰，吳天祥，2，*，吳彩云，劉　昕，趙群麗

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省發(fā)酵與釀造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

對(duì)羥基苯甲醇對(duì)灰樹(shù)花產(chǎn)胞外多糖的影響及其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

朱俊杰1，吳天祥1，2，*，吳彩云1，劉昕1，趙群麗1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省發(fā)酵與釀造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

通過(guò)向灰樹(shù)花發(fā)酵液中添加不同質(zhì)量濃度梯度的對(duì)羥基苯甲醇，分析其對(duì)灰樹(shù)花菌體生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響，并且進(jìn)一步研究了添加對(duì)羥基苯甲醇后發(fā)酵液中菌絲體生長(zhǎng)、殘?zhí)牵ㄟ€原糖）含量、胞外多糖產(chǎn)量、pH值、對(duì)羥基苯甲醇和天麻素含量的變化情況，并做動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表明：當(dāng)對(duì)羥基苯甲醇添加量為200 mg/L時(shí)效果最佳，相比于空白組（未添加對(duì)羥基苯甲醇）使菌絲體生物量提高了22.73%，胞外多糖產(chǎn)量提高了10.24%，均顯著高于空白組（P＜0.05）。動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明：在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，灰樹(shù)花生長(zhǎng)從第8天趨于穩(wěn)定，葡萄糖作為碳源不斷被消耗并且胞外多糖逐漸合成，到第10天二者趨于穩(wěn)定。此外，對(duì)羥基苯甲醇含量減少，部分轉(zhuǎn)化為天麻素。

對(duì)羥基苯甲醇；灰樹(shù)花；胞外多糖；生物量；發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

灰樹(shù)花（Grifola frondosa），俗稱(chēng)“栗蘑”，又名貝葉多孔菌，屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina），多孔菌科（Polyporaceae），是一種含豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的藥食兩用真菌。其中灰樹(shù)花多糖是其主要生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤［1-2］、抗氧化［3-4］、抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）［5］、清除自由基［4］等生物活性。采用液體發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)獲得藥用真菌多糖被認(rèn)為是一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的方法。為了最大量獲得真菌胞外多糖，很多研究在藥用真菌液體發(fā)酵體系中添加一定的刺激物，來(lái)促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成［6-7］。Liu Gaoqiang等［8］發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加乙酸乙酯到靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中可顯著促進(jìn)靈芝多糖的合成和菌絲體生長(zhǎng)。Yang Hailong等［9］發(fā)現(xiàn)通過(guò)添加乙醇到靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中可顯著促進(jìn)靈芝多糖的合成和菌絲體生長(zhǎng)。Tang Yajie等［10］同樣也發(fā)現(xiàn)乳糖可以促進(jìn)靈芝菌體生長(zhǎng)和胞外多糖合成。而在灰樹(shù)花液體發(fā)酵過(guò)程中，Hsieh等［11-12］添加植物油和橄欖油，Chen Huabing等［13］添加適量聚乙二醇，侯曉梅等［14］添加適量的白花蛇草、黃芪、連翹、薏苡仁等中藥，趙亮等［15］添加苦蕎、山藥均可以促進(jìn)灰樹(shù)花細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖的合成。此外，微生物能產(chǎn)生豐富的酶系可以用來(lái)發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥，Kim等［16］研究發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花可以將牛蒡子苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子，朱紅莉等［17］篩選到一株華根霉，可以轉(zhuǎn)化對(duì)羥基苯甲醛合成天麻素，董亞晨等［18］利用黃綠蜜環(huán)菌將對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化合成天麻素。

本課題組前期研究結(jié)果表明，在灰樹(shù)花液體發(fā)酵體系中添加天麻提取物可顯著促進(jìn)灰樹(shù)花細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖的生物合成［19-23］。但是天麻本身是一種中藥且價(jià)格昂貴。因此，本實(shí)驗(yàn)在灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基中添加天麻素的前體物質(zhì)對(duì)羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol），分析不同質(zhì)量濃度的對(duì)羥基苯甲醇對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和胞外多糖合成的影響，并且動(dòng)態(tài)分析了添加對(duì)羥基苯甲醇后發(fā)酵液中菌絲體生長(zhǎng)、殘?zhí)牵ㄟ€原糖）含量、胞外多糖含量、pH值、對(duì)羥基苯甲醇含量的變化情況。此外還研究了是否存在對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化合成天麻素，以更好地了解對(duì)羥基苯甲醇提高胞外多糖產(chǎn)量的機(jī)理。

1　材料與方法

1.1菌株、試劑與培養(yǎng)基

灰樹(shù)花菌株（Grifola frondosa）51616，購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

天麻素、對(duì)羥基苯甲醇 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、酵母膏6 g/L、蛋白胨2 g/L、MgSO4?7H2O 0.5 g/L、KH2PO40.5 g/L，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L、酵母膏6 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO4?7H2O 2 g/L、KH2PO42 g/L，pH值自然。

1.2儀器與設(shè)備

BXM-30R立式滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TG2-16G低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SW-CJ-1D凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀及檢測(cè)器 美國(guó)Agilent公司。

1.3方法

1.3.1種子培養(yǎng)

1.3.1.1斜面種子培養(yǎng)

于母種試管中挑取黃豆粒大小的菌絲塊接于PDA試管斜面中部，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)9 d。

1.3.1.2液體種子培養(yǎng)

先將斜面試管培養(yǎng)基上的菌絲用接種鏟輕輕刮下，加入一定量的無(wú)菌水以使菌絲與固體培養(yǎng)基脫離，然后倒入250 mL三角錐形瓶液體種子培養(yǎng)基中，置于25 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床、培養(yǎng)4～7 d。三角錐形瓶中應(yīng)長(zhǎng)出大量均勻細(xì)小的菌絲球且菌液澄清為最佳。

1.3.1.3發(fā)酵培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL、25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)14 d。

1.3.2指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1菌絲體生物量的測(cè)定

灰樹(shù)花生長(zhǎng)以其菌絲體生物量為指標(biāo)。將發(fā)酵培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾固液分離，得到菌絲體，菌絲體再用蒸餾水沖洗3 次，于數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量得菌絲體干質(zhì)量，結(jié)果以單位體積發(fā)酵液中的菌絲體干質(zhì)量為菌體生物量（g/L）。

1.3.2.2葡萄糖含量測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定，取1 mL發(fā)酵液于50 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，取定容后的1 mL稀釋液于25 mL的比色管中，與1.5 mL DNS溶液混勻，在沸水中煮沸5 min定容至25 mL，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

1.3.2.3胞外多糖含量測(cè)定

取上述濾液，加入4 倍體積95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置24 h。然后離心（4 000 r/min，15 min），去除上清液，再用95%乙醇清洗沉淀3 次，最后將沉淀在60 ℃條件下烘干，再加蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖含量。

1.3.3HPLC分析

取1 mL發(fā)酵液進(jìn)行膜過(guò)濾（45 μm）用于HPLC檢測(cè)，色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相C）。洗脫梯度：0～35 min，3%～30% C；35～45 min，30%～70% C。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

由于模板投影位置與投影角度是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以簡(jiǎn)單利用在角度對(duì)照表中搜索具有最小的相對(duì)誤差歸一化的歐氏距離值的項(xiàng)來(lái)確定具體的投影角度：

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)羥基苯甲醇添加量對(duì)灰樹(shù)花生物量和胞外多糖合成的影響

圖1　對(duì)羥基苯甲醇添加量對(duì)灰樹(shù)花生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1　Effect of p-hydroxybenzyl alcohol concentration on biomass and extracellular polysaccharide production by submerged culture of G. frondosa

在灰樹(shù)花發(fā)酵液中添加不同質(zhì)量濃度的對(duì)羥基苯甲醇，發(fā)酵8 d后菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量如圖1所示。隨著對(duì)羥基苯甲醇質(zhì)量濃度的增加，灰樹(shù)花菌絲生物量和胞外多糖產(chǎn)量均先增加至最大量后降低，這說(shuō)明一定質(zhì)量濃度的對(duì)羥基苯甲醇可能刺激灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)和胞外多糖的合成，尤其是能使合成多糖途徑中一些相關(guān)酶活性的增強(qiáng)，例如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，從而使多糖合成增加，而質(zhì)量濃度過(guò)高又可能會(huì)抑制菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)而使胞外多糖產(chǎn)量有所降低。當(dāng)對(duì)羥基苯甲醇質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，對(duì)灰樹(shù)花菌絲生物量和胞外多糖合成具有明顯促進(jìn)作用（P＜0.05），分別達(dá)到最大值（2.365±0.05） g/L和（397.54±1.72） mg/L，與空白組（不加對(duì)羥基苯甲醇）相比，分別增加了22.73%和10.24%?；诤笃谘芯浚菊n題組將進(jìn)一步考察對(duì)羥基苯甲醇在灰樹(shù)花發(fā)酵體系中的代謝及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，選取對(duì)羥基苯甲醇添加量為200 mg/L作后期實(shí)驗(yàn)。

2.2發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)

在灰樹(shù)花發(fā)酵液中添加對(duì)羥基苯甲醇至質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L，取第0天和第8天的發(fā)酵液進(jìn)行膜過(guò)濾（45 μm），然后用于HPLC進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)第8天灰樹(shù)花發(fā)酵液中對(duì)羥基苯甲醇含量減少，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照發(fā)現(xiàn)天麻素的吸收峰明顯增加，這說(shuō)明對(duì)羥基苯甲醇添加到灰樹(shù)花發(fā)酵體系中可能不僅促進(jìn)了菌絲生長(zhǎng)及胞外多糖的合成，也有可能一部分自身被轉(zhuǎn)化。接下來(lái)會(huì)繼續(xù)跟蹤考察對(duì)羥基苯甲醇在灰樹(shù)花發(fā)酵體系中的代謝變化。

圖2　對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析Fig.2　HPLC analysis of transformation product of p-hydroxybenzyl alcohol

2.3發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

在灰樹(shù)花發(fā)酵液中添加對(duì)羥基苯甲醇至質(zhì)量濃度200 mg/L進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔2 d取樣，研究發(fā)酵過(guò)程中菌絲量、殘?zhí)牵ㄟ€原糖）、胞外多糖、對(duì)羥基苯甲醇、天麻素含量和pH值的變化。進(jìn)一步揭示對(duì)羥基苯甲醇能促進(jìn)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)及胞外多糖的合成，也為獲取灰樹(shù)花菌絲體和胞外多糖的實(shí)際應(yīng)用提供了參考依據(jù)。胞外多糖的積累與灰樹(shù)花菌絲體的生長(zhǎng)密切相關(guān)，菌絲體生長(zhǎng)過(guò)程中消耗了大量的碳源，8 d后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，同時(shí)對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化成天麻素也基本完成。這預(yù)示著實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中如果要連續(xù)培養(yǎng)，第8天是最佳的補(bǔ)料時(shí)間。

2.3.1菌體的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

圖3　菌絲體生物量和殘?zhí)牵ㄆ咸烟牵┖康膭?dòng)力學(xué)曲線Fig.3　Kinetic curves of biomass and reducing sugar （glucose）

2.3.2胞外多糖產(chǎn)量和pH值的動(dòng)力學(xué)曲線

圖4　胞外多糖產(chǎn)量和pH值的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4　Kinetic curves of extracellular polysaccharide and pH

由圖4可知，在灰樹(shù)花整個(gè)發(fā)酵周期中，一開(kāi)始合成胞外多糖較緩慢，當(dāng)從第6天開(kāi)始合成速率加快，第10天開(kāi)始趨于平穩(wěn)。最終第14天檢測(cè)到灰樹(shù)花胞外多糖產(chǎn)量達(dá)（402.23±13.76） mg/L。發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花胞外多糖的合成稍微滯后于菌絲體的生長(zhǎng)。而剛開(kāi)始第0天能夠檢測(cè)到少量多糖，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中酵母膏里的成分。此外發(fā)酵過(guò)程中pH值也是略微下降的，從4.64±0.02下降到3.56±0.05，可能的原因是隨著灰樹(shù)花的生長(zhǎng)，能夠利用碳源產(chǎn)生了少量的有機(jī)酸，當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)（第8天），發(fā)酵液的pH值變化也趨于平緩。

2.3.3對(duì)羥基苯甲醇和天麻素含量的動(dòng)力學(xué)曲線

圖5　對(duì)羥基苯甲醇和天麻素的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5　Kinetic curves of p-hydroxybenzyl alcohol and gastrodin

由圖5可知，在灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基中添加對(duì)羥基苯甲醇，第4天之前對(duì)羥基苯甲醇和天麻素含量變化不明顯。第4～6天時(shí)，對(duì)羥基苯甲醇含量迅速?gòu)模?85.12±4.21） mg/L下降到（77.34±9.23） mg/L并最終轉(zhuǎn)化完全，天麻素含量從（0.23±0.04） mg/L上升到（30.27±2.17） mg/L，但隨著灰樹(shù)花繼續(xù)發(fā)酵又會(huì)略微減少。這現(xiàn)象可能是剛開(kāi)始灰樹(shù)花能夠合成一些酶（如葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶將對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化成天麻素），隨著菌絲體生長(zhǎng)，后期可能會(huì)吸收對(duì)羥基苯甲醇用以促進(jìn)胞外多糖的合成并且有可能產(chǎn)生一些能使天麻素降解的酶。

3　結(jié) 論

目前提高灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)和多糖產(chǎn)量的研究主要集中在灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及向培養(yǎng)基中添加適量的中藥。這些傳統(tǒng)的研究方法對(duì)提高灰樹(shù)花菌絲量和胞外多糖產(chǎn)量是可行的，但本實(shí)驗(yàn)從另外的角度研究了對(duì)羥基苯甲醇對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖合成的影響。在灰樹(shù)花發(fā)酵體系中，添加不同質(zhì)量濃度的對(duì)羥基苯甲醇能在一定程度上促進(jìn)灰樹(shù)花菌體的生長(zhǎng)和胞外多糖的合成，其中對(duì)羥基苯甲醇添加量為200 mg/L時(shí)對(duì)灰樹(shù)花菌體生物量和胞外多糖合成的促進(jìn)作用效果最明顯，比空白組（未添加對(duì)羥基苯甲醇）分別提高了22.73%和10.24%。胞外多糖合成酶是菌體分泌的一種誘導(dǎo)胞外多糖產(chǎn)生的一類(lèi)酶的總稱(chēng)。王瓊［24］和張清麗［25］等的研究認(rèn)為α-磷酸葡萄糖變位酶（α-phosphate glucose mutase，α-PGM）、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、二磷酸尿苷-葡萄糖焦磷酸化酶、胸苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶等是胞外多糖合成的關(guān)鍵酶。Xu Xiaobao等［20］的研究表明通過(guò)添加中藥天麻醇提物可以提高α-PGM活力，而天麻醇提物主要成分也包括對(duì)羥基苯甲醇和天麻素。本研究中對(duì)羥基苯甲醇對(duì)灰樹(shù)花胞外多糖生物合成的促進(jìn)作用可能與天麻醇提取物的作用一致，這一點(diǎn)需要作進(jìn)一步研究。此外本研究重點(diǎn)進(jìn)行了添加對(duì)羥基苯甲醇后灰樹(shù)花發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，考察了發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量、殘?zhí)牵ㄟ€原糖）含量、胞外多糖產(chǎn)量、pH值、對(duì)羥基苯甲醇和天麻素含量的變化。研究結(jié)果表明可以通過(guò)添加對(duì)羥基苯甲醇以及對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化，縮短發(fā)酵時(shí)間，獲得灰樹(shù)花胞外多糖，更好地應(yīng)用到中試和實(shí)際生產(chǎn)中。另外對(duì)于對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化合成一種重要的中藥活性物質(zhì)——天麻素要做進(jìn)一步研究。

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Effect of p-Hydroxybenzyl Alcohol on the Biosynthesis of Exopolysaccharide by Submerged Culture of Grifola frondosa and Fermentation Kinetics

ZHU Junjie1， WU Tianxiang1，2，*， WU Caiyun1， LIU Xin1， ZHAO Qunli1
（1. School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiyang 550025， China；2. Key Laboratory of Fermentation and Brewing of Guizhou Province， Guiyang 550025， China）

The effect of adding different concentration gradients of p-hydroxybenzyl alcohol to the culture medium of Grifola frondosa on mycelial growth and the production of extracellular polysaccharide in submerged fermentation. Meanwhile， we determined changes in mycelial growth， reducing sugar （residual sugar） content， extracellular polysaccharide content， pH，p-hydroxybenzyl alcohol and gastrodin contents in the fermentation broth of Grifola frondosa， and we also made a dynamic analysis. Results showed that addition of 200 mg/L p-hydroxybenzyl alcohol was found to be optimal， resulting in an increase in mycelial biomass of 22.73% and an increase in extracellular polysaccharide production of 10.24% as compared with the control group without added p-hydroxybenzyl alcohol； both increases were signifi cant （P ＜ 0.05）. Dynamic analysis results showed that the growth of Grifola frondosa remained stable from day 8 onwards； glucose was consumed as the carbon source， and residual glucose and the production of extracellular polysaccharide both remained stable from day 10 onwards. In addition， the gastrodin content increased as a result of partial conversion of p-hydroxybenzyl alcohol into gastrodin.

p-hydroxybenzyl alcohol； Grifola frondosa； extracellular polysaccharide； biomass； fermentation kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201619021

Q936

A

1002-6630（2016）19-0123-05

朱俊杰， 吳天祥， 吳彩云， 等. 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)灰樹(shù)花產(chǎn)胞外多糖的影響及其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）: 123-127. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619021. http://www.spkx.net.cn

ZHU Junjie， WU Tianxiang， WU Caiyun， et al. Effect of p-hydroxybenzyl alcohol on the biosynthesis of exopolysaccharide by submerged culture of Grifola frondosa and fermentation kinetics［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 123-127. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619021. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（［2014］31460537）

朱俊杰（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：15761621242@163.com

吳天祥（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程與生物轉(zhuǎn)化。E-mail：ce.txwu@gzu.edu.cn