孫　也，王艷萍，李淑雅，劉兆賢，劉　媛*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

氨基酸修飾可食用生物膜載體的制備與性質(zhì)

孫也，王艷萍，李淑雅，劉兆賢，劉媛*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

為拓展乳酸菌生物膜在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，構(gòu)建可食用型高分子載體，本實(shí)驗(yàn)以可介導(dǎo)乳酸菌黏附的氨基酸為配體，將其修飾在海藻酸鈉材料上，通過核磁共振技術(shù)、氨基酸含量、ζ電勢(shì)和水接觸角等物理量表征載體性質(zhì)，培養(yǎng)馬奶酒樣乳桿菌ZW3，研究載體對(duì)乳桿菌生長(zhǎng)和胞外多糖分泌的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示：培養(yǎng)4 d后，精氨酸修飾載體表面乳桿菌數(shù)量達(dá)到3.8×107CFU/cm2，是賴氨酸修飾載體的3.5 倍；同時(shí)胞外多糖分泌量達(dá)到28.2 μg/cm2，是賴氨酸修飾載體的2.4 倍。與賴氨酸修飾載體相比，精氨酸修飾載體更有利于乳桿菌的生長(zhǎng)和胞外多糖的分泌。該結(jié)果表明可以通過配體種類的選擇促進(jìn)乳酸菌生物膜的形成。

氨基酸；海藻酸鈉；生物膜；乳酸菌；配體

細(xì)菌生物膜由于菌體間特殊的排列結(jié)構(gòu)和胞外聚合物的保護(hù)作用，能使細(xì)菌更好地生存和適應(yīng)環(huán)境。與游離狀態(tài)的細(xì)菌相比，生物膜形式的細(xì)菌具有更好的系統(tǒng)穩(wěn)定性和對(duì)一些不利環(huán)境的抗逆性［1］。乳酸菌作為有益菌中重要的一類，具有良好的發(fā)酵特性、食品保藏性能、營養(yǎng)價(jià)值和保健作用［2］。研究證明乳酸菌生物膜形式可提高發(fā)酵產(chǎn)率和體系穩(wěn)定性［3-4］，增加對(duì)不良因素的耐受性等［5-6］。如果能將乳酸菌以生物膜的形式添加到食品中，必將在改善人類健康方面發(fā)揮更大的作用［7］。

為形成高效穩(wěn)定的乳酸菌生物膜，除培養(yǎng)條件的調(diào)控外，最重要的是載體性質(zhì)對(duì)生物膜形成的誘導(dǎo)作用。這是由于生物膜的形成起始于菌表面黏附素與材料表面的黏附，進(jìn)而分泌胞外聚合物將自身包繞其中而形成。然而，目前研究所使用的載體多為商業(yè)化產(chǎn)品，如玻璃、陶瓷片、不銹鋼和塑料等［8-11］。該類載體多為非可食用型材料，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)限制了乳酸菌生物膜在食品添加領(lǐng)域的應(yīng)用。

一些小分子物質(zhì)可以介導(dǎo)乳酸菌的黏附，如單克隆抗體、抗生素和氨基酸［12-15］等。其中，氨基酸類配體生物相容性好、食用安全、結(jié)構(gòu)易于修飾，最重要的是不會(huì)對(duì)乳酸菌的活性造成負(fù)面影響。因此，本研究將氨基酸（精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys））修飾在天然高分子材料海藻酸鈉上，培養(yǎng)馬奶酒樣乳桿菌ZW3，考察生物膜形成情況。研究結(jié)果將為乳酸菌生物膜更廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種

馬奶酒樣乳桿菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）分離自西藏靈菇，為本實(shí)驗(yàn)自主分離、保藏菌種。保存于-80 ℃，改良MRS培養(yǎng)基30 ℃活化2 代即可使用。

1.2試劑與培養(yǎng)基

海藻酸鈉（sodium alginate，Alg） 天津市博迪化工有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 北京伊諾凱科技有限公司；精氨酸鹽酸鹽、賴氨酸鹽酸鹽、3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，A P T E S） 美國S i g m a公司。2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic Acid，MES）、濃硫酸、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）等試劑均為分析純。

改良MRS培養(yǎng)基：乳糖4 g、葡萄糖16 g、酵母浸粉45 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸錳0.2 g、氯化鈉0.1 g、半胱氨酸鹽酸鹽1 g、乙酸鈉15 g、吐溫-80 1 g，pH 6.2，蒸餾水定容至1 L，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.3儀器與設(shè)備

Multiskan GO酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo Fisher Scientifi c公司；Avance III核磁共振波譜儀 德國Bruker公司；JY-82水接觸角儀 北京哈科試驗(yàn)儀器廠；Mastersizer 3000激光粒度儀 英國Malvern公司；SU-1510掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.4方法

1.4.1氨基酸修飾海藻酸鈉的制備

將250 mg海藻酸鈉溶解于50 mL MES緩沖液（pH 6.5）中，冰水浴條件下加入125 mg EDC和75 mg NHS活化30 min，加入300 mg賴氨酸鹽酸鹽或250 mg精氨酸鹽酸鹽，用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5，避光反應(yīng)24 h。將反應(yīng)液對(duì)水透析72 h，凍干，得到氨基酸修飾海藻酸鈉材料。

1.4.2氨基酸修飾海藻酸鈉的表征

海藻酸鈉（A l g）、精氨酸修飾海藻酸鈉（Alg-Arg）和賴氨酸修飾海藻酸鈉（Alg-Lys）的材料結(jié)構(gòu)與組成通過核磁共振進(jìn)行檢測(cè)（400 MHz，D2O）。氨基酸含量通過水合茚三酮法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm。將材料配成1 mg/mL的溶液后，采用激光粒度儀測(cè)定ζ電勢(shì)。

1.4.3載體的固載

將圓形蓋玻片（直徑15 mm）依次用無水乙醇、丙酮、雙蒸水超聲清洗10 min，110 ℃烘干。將烘干的蓋玻片浸泡在50 mL新鮮配制的食人魚溶液（V（H2O2）∶V（濃H2SO4）=3∶7）中，30 min后用大量水洗至中性，110 ℃烘干冷卻至室溫。將蓋玻片浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的 APTES無水丙酮溶液中2 h，依次用無水丙酮、乙醇、雙蒸水超聲清洗，烘干，冷卻至室溫待用。

將1 g/100 mL的Alg、Alg-Lys和Alg-Arg分別溶于MES緩沖液中，以1.4.1節(jié)相同的方法進(jìn)行EDC、NHS活化，加入到蓋玻片上，反應(yīng)24 h，用蒸餾水清洗，37 ℃烘干待用。

1.4.4載體親疏水性的表征

固載有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的載體，其親疏水性以載體水接觸角為表征，通過靜態(tài)水接觸角儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5乳桿菌生物膜的形成

將固載有Alg、Alg-Lys和Alg-Arg的載體放置在24 孔板中，紫外照射滅菌。將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的馬奶酒樣乳桿菌ZW3以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量添加到新鮮的改良MRS培養(yǎng)基中［16］，1 mL/孔接種到載體上，每2 d更換新鮮的培養(yǎng)基，30 ℃厭氧培養(yǎng)2、3、4 d后用磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，MTT染色，孵育4 h后用二甲基亞砜溶解，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

通過涂板計(jì)數(shù)活菌數(shù)量；將菌液梯度稀釋，以相同方法進(jìn)行MTT染色，以活菌數(shù)-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載體表面活菌數(shù)。

1.4.6生物膜胞外多糖分泌量的檢測(cè)

將厭氧培養(yǎng)至2、3、4 d的生物膜分別用PBS清洗，每孔加入200 μL蒸餾水、100 μL 6%苯酚溶液和500 μL濃硫酸，靜止10 min，25 ℃搖勻20 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，扣除胞內(nèi)多糖吸光度。以葡萄糖溶液含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載體表面多糖分泌量。

1.4.7生物膜形態(tài)的觀察

將培養(yǎng)至4 d的生物膜用PBS清洗，加入2.5%戊二醛溶液固定30 min，PBS清洗2 次，室溫晾干，噴金，電子顯微鏡觀察形貌。

1.4.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1氨基酸修飾海藻酸鈉的制備及表征

氨基酸修飾海藻酸鈉核磁對(duì)比譜圖如圖1所示，Alg核磁譜圖中δ3.5～4.0為Alg糖環(huán)上氫的吸收峰，而Al-Arg和Alg-Lys譜圖中δ1.5～2.0、2.8～3.0分別出現(xiàn)氨基酸上亞甲基氫的吸收峰［17］，說明材料合成成功。

圖1　海藻酸鈉（A）與精氨酸修飾海藻酸鈉（B）、賴氨酸修飾海藻酸鈉（C）核磁共振對(duì)比譜圖Fig.1　1H NMR spectra of Alg （A）， Alg-Arg （B） and Alg-Lys （C）

通過水合茚三酮法檢測(cè)制備材料的氨基酸含量，結(jié)果如表1所示，Alg中未發(fā)現(xiàn)含有氨基酸，而Alg-Arg和Alg-Lys中氨基酸含量較為接近，均約為17%。研究表明材料的表面電荷會(huì)對(duì)細(xì)菌黏附造成影響［18］。通過與Alg相比，發(fā)現(xiàn)Alg-Arg和Alg-Lys的ζ電勢(shì)均顯著提高，這是由于Arg和Lys均為堿性氨基酸，通常情況下容易帶正電荷。但Alg-Arg和Alg-Lys材料總體仍呈負(fù)電性，兩修飾材料電勢(shì)無明顯差異，可在同等水平上進(jìn)行載體固載。

表1　海藻酸鈉與修飾海藻酸鈉氨基酸含量及ζ電勢(shì)Table1　Amino acid contents and zeta potentials of Alg， Alg-Arg and Alg-Lys

2.2載體的固載及表征

由于氨基酸修飾海藻酸鈉材料為水溶性材料，為便于研究，本實(shí)驗(yàn)將其固載于玻璃載體上進(jìn)行后續(xù)性質(zhì)研究，反應(yīng)過程如圖2所示。

圖2　載體固載示意圖Fig.2　Schematic diagram of carrier immobilization

表2　海藻酸鈉與修飾海藻酸鈉載體水接觸角Table2　Water contact angles of Alg， Alg-Arg and Alg-Lys carriers

除表面電荷，載體的親疏水性也會(huì)對(duì)細(xì)菌黏附造成影響［18］。因此，通過比較修飾載體的水接觸角發(fā)現(xiàn)（表2），Alg-Arg和Alg-Lys的水接觸角較Alg降低，這是由于Arg和Lys分別含有胍基和氨基等極性基團(tuán)，均為親水性氨基酸。該結(jié)果說明材料固載成功，且兩者間無顯著差異，不會(huì)對(duì)細(xì)菌生物膜的形成產(chǎn)生影響。

2.3生物膜形成

馬奶酒樣乳桿菌ZW3為本課題組自主分離自西藏靈菇的新菌種，其形成生物膜的性質(zhì)還未被研究。通過靜態(tài)厭氧培養(yǎng)，乳桿菌ZW3可在Alg-Arg和Alg-Lys載體表面黏附，并持續(xù)生長(zhǎng)，而在Alg載體表面則無生長(zhǎng)（圖3）。培養(yǎng)2 d后3 種載體表面的活菌數(shù)量無顯著差異，這可能與菌株ZW3生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)（2 d）有關(guān)。3 d后Alg-Arg、Alg-Lys載體表面活菌數(shù)量顯著提高，以Alg-Arg載體最為突出，活菌數(shù)是Alg載體的2.3 倍。而4 d后，Alg載體表面活菌數(shù)量下降，這說明Alg載體可能不是乳桿菌ZW3生物膜形成的適宜載體。已有文獻(xiàn)報(bào)道親水性陰離子載體與某些細(xì)菌的結(jié)合能力較弱［19］；而Alg-Arg和Alg-Lys載體表面活菌數(shù)量持續(xù)上升，說明乳桿菌ZW3可能在載體表面形成了生物膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)。其生長(zhǎng)趨勢(shì)與盧志山等［20］報(bào)道的糞腸球菌生物膜菌體生長(zhǎng)情況一致。其中Alg-Arg的優(yōu)勢(shì)仍然最為明顯，活菌數(shù)是Alg載體的3.5倍，達(dá)到3.8×107CFU/cm2，也與王坤等［21］報(bào)道的混菌不銹鋼網(wǎng)布密度相近。

圖3　不同載體表面乳桿菌數(shù)量Fig.3　Amounts of ZW3 adhered to different carriers

Jin Yinjia等［14］曾報(bào)道Arg和Lys修飾的磁性納米粒子都能和革蘭氏陽性菌（芽孢桿菌）快速結(jié)合，10 min內(nèi)可富集107CFU/mL。但本研究結(jié)果顯示Arg修飾載體在乳桿菌ZW3生物膜形成能力上明顯優(yōu)于Lys修飾載體。這可能是由于結(jié)合只是生物膜形成初期的關(guān)鍵一步［22］，表現(xiàn)為Alg-Arg和Alg-Lys載體表面早期（2 d）菌體數(shù)量無顯著差異。而形成穩(wěn)定的生物膜還取決于多種因素（如胞外多糖、蛋白的分泌等）的共同影響，進(jìn)而導(dǎo)致后期（3～4 d）產(chǎn)生顯著差異。為驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究又進(jìn)行了胞外多糖分泌量的測(cè)定。

2.4生物膜胞外多糖分泌量

圖4　不同載體表面乳桿菌多糖分泌量Fig.4　Secretion amounts of exopolysaccharide on different carriers

乳桿菌ZW3本身具有良好的產(chǎn)胞外多糖特性［23］，其不溶性胞外多糖是生物膜的主要成分，在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用，決定生物膜的結(jié)構(gòu)、細(xì)菌生長(zhǎng)外環(huán)境等［24-25］。不同載體表面胞外多糖的分泌量如圖4所示，2 d后Alg-Arg和Alg-Lys載體表面胞外多糖分泌量明顯高于Alg載體，這為兩種載體表面活菌數(shù)量的增長(zhǎng)奠定了基礎(chǔ)；培養(yǎng)3、4 d后各載體表面胞外多糖分泌量趨勢(shì)與細(xì)菌量基本一致，很好地印證了胞外多糖對(duì)生物膜形成的作用。4 d后Alg-Arg表面胞外多糖分泌量為Alg-Lys的2.4 倍，這可能一定程度上解釋Arg修飾載體在ZW3生物膜形成能力上明顯優(yōu)于Lys修飾載體。

2.5掃描電子顯微鏡觀察

圖5　不同載體表面電子顯微鏡掃描圖Fig.5　SEM images of different carriers

Alg-Arg和Alg-Lys載體表面是否形成乳桿菌ZW3生物膜，可通過形貌觀察進(jìn)行判斷。由圖5可知，Alg載體表面乳桿菌數(shù)量稀少，且呈分散分布，未形成明顯的生物膜結(jié)構(gòu)，其結(jié)果與2.3、2.4節(jié)相吻合；而Alg-Arg和Alg-Lys載體表面乳桿菌數(shù)量明顯增加，菌體緊密聚集，形成團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。由圖可知菌體間有錯(cuò)落的生物膜通道（圖5B中箭頭所示），這是生物膜傳送營養(yǎng)和信息的重要結(jié)構(gòu)。菌體間片狀物質(zhì)可能主要為分泌的胞外物質(zhì)。

3　結(jié) 論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功合成氨基酸修飾海藻酸鈉載體，并通過核磁、氨基酸含量、ζ電勢(shì)和水接觸角等表征載體性質(zhì)，在物理性質(zhì)基本一致的條件下比較Alg-Arg和Alg-Lys對(duì)乳酸菌生物膜形成的促進(jìn)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Alg-Arg和Alg-Lys載體均可以促進(jìn)馬奶酒樣乳桿菌ZW3的生長(zhǎng)，進(jìn)而分泌胞外多糖，形成生物膜。其中，Alg-Arg載體效果優(yōu)于Alg-Lys載體。因此，氨基酸修飾海藻酸鈉載體可作為一種食用性乳酸菌生物膜載體，應(yīng)用于食品領(lǐng)域并可以通過配體種類的選擇促進(jìn)乳酸菌生物膜的形成。

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Preparation and Properties of Edible Amino Acid-Modified Biofilm Carrier

SUN Ye， WANG Yanping， LI Shuya， LIU Zhaoxian， LIU Yuan*
（College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

In order to expand the application of lactic acid bacterial biofilm in the food industry and construct edible functional carrier， amino acids which could be used as ligands for bacterial adhesion were modifi ed onto alginate in this study. The structures， compositions， electrical properties and hydrophilicity of the modifi ed carriers （Alg-Arg and Alg-Lys）were characterized by nuclear magnetic resonance， amino acid content analysis， and ζ potential and water contact angle measurement. Lactobacillus kefi ranofaciens ZW3 was cultured on the carriers to investigate its growth and extracellular exopolysaccharide secretion. The results showed that after cultivation for 4 d， the amount of ZW3 on Alg-Arg reached up to 3.8 × 107CFU/cm2， which was 3.5 times as high as that on Alg-Lys. The secretion amount of extracellular exopolysaccharide was 28.2 μg/cm2， which was increased by 2.4 times in comparison with that on Alg-Lys. Compared with lysine-modifi ed carrier， arginine-modifi ed carrier was better for ZW3 growth and the secretion of extracellular exopolysaccharide. These results demonstrated that biofi lm formation could be enhanced by the appropriate ligand.

amino acid； sodium alginate； biofi lm； Lactobacillus； ligand

10.7506/spkx1002-6630-201619010

TS201.3

A

1002-6630（2016）19-0059-05

孫也， 王艷萍， 李淑雅， 等. 氨基酸修飾可食用生物膜載體的制備與性質(zhì)［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 59-63. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619010. http：//www.spkx.net.cn

SUN Ye， WANG Yanping， LI Shuya， et al. Preparation and properties of edible amino acid-modified biofilm carrier［J］. Food Science，2016， 37（19）： 59-63. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619010. http：//www.spkx.net.cn

2015-10-30

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA10090405）；天津科技大學(xué)大學(xué)生實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新基金項(xiàng)目（1414A208）；天津科技大學(xué)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014CXLG04）

孫也（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：962275351@qq.com

劉媛（1981—），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称犯叻肿硬牧稀-mail：liuyuan0816@tust.edu.cn