石蕓潔，林慧敏*，金圖南，鄧尚貴

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000）

磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的制備及對CW-2細(xì)胞膜流動性的影響

石蕓潔，林慧敏*，金圖南，鄧尚貴

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316000）

目的：制備磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒，并研究其對CW-2細(xì)胞膜流動性的影響。方法：以磁性Fe3O4納米微粒為內(nèi)核，負(fù)載具有抑制腫瘤增殖作用的帶魚酶解小肽，通過共沉淀法合成磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒，采用X射線衍射、透射式電子顯微鏡、原子力顯微鏡等方法對該納米粒子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；利用熒光偏振法研究該微粒在非磁場與交變磁場中對CW-2人結(jié)腸癌細(xì)胞膜流動性的影響。結(jié)果：共沉淀法合成的磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒呈球形，粒徑約10 nm，分布較均勻，顆粒之間有黏連現(xiàn)象，形成纏繞彎曲的線狀。與單體磁性Fe3O4納米微粒相比，帶魚酶解小肽的包覆增強(qiáng)了納米鐵微粒的分散穩(wěn)定性；該粒子最佳使用pH值范圍是6.5～9.0，比較適合于在生物體系中應(yīng)用。細(xì)胞膜流動性檢測顯示24 h時實(shí)驗(yàn)組CW-2細(xì)胞膜熒光偏振度P值顯著減小、平均微黏度η值減小，表明磁性Fe3O4納米帶魚肽微?？墒笴W-2細(xì)胞膜流動性增大，作用呈量效關(guān)系。結(jié)論：磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒在交變磁場中增強(qiáng)了帶魚酶解小肽的抗腫瘤活性。

磁性Fe3O4納米微粒；帶魚酶解小肽；結(jié)構(gòu)表征；CW-2細(xì)胞；細(xì)胞膜流動性

海洋生物資源豐富，從海洋動物中提取的化合物約10%具有抗癌活性［1-2］，但是很多海洋生物中提取的活性物質(zhì)組織器官靶向性不強(qiáng)，為了將活性物質(zhì)盡可能有選擇性地運(yùn)送到靶部位，提高靶部位的藥物濃度，減少藥物對全身正常組織的毒副作用，同時可減少用藥量并使治療費(fèi)用降低，靶向給藥已成為腫瘤治療的主要途徑［3-4］。

以超順磁性納米顆粒作為載體及藥物載體的研究近年來在各領(lǐng)域不斷發(fā)展［5］，由于磁性Fe3O4納米微粒的制作簡單，直徑可達(dá)10 nm以下，具有比表面積效應(yīng)和磁效應(yīng)，在外加磁場的作用下可具有靶向性，且Fe3O4的晶體對細(xì)胞無毒［6］。在磁性Fe3O4的晶體表面可很容易地包埋生物高分子，如多聚糖［7-8］、蛋白質(zhì)等形成核殼式結(jié)構(gòu)［9-10］，使得其被廣泛地應(yīng)用于藥物釋放等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［11-12］。

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤。由于腫瘤組織和正常組織的細(xì)胞都在微米級別，且電性能差別不大，采用現(xiàn)有的射頻、微波等加熱方法很難使某一特定靶區(qū)獲得完整的、均勻的升溫效果，這樣腫瘤加溫治療就難以達(dá)到理想的效果。利用納米級金屬顆粒作為熱介質(zhì)具有突出的優(yōu)點(diǎn)：便于從細(xì)小的毛細(xì)血管或狹窄的血竇中通過；增加導(dǎo)體的表面積，極大提高介質(zhì)的電性能，使其產(chǎn)生的熱量最大化；特定的活性肽修飾的金屬納米微粒具有特殊的靶向性親和能力。

前期研究中發(fā)現(xiàn)帶魚酶解小肽（分子質(zhì)量小于1 kD）具有抗氧化、抗菌功效，同時對多種腫瘤細(xì)胞具有抗增殖能力，但抗腫瘤活性較低［13-14］。主要原因可能是分子粒徑較大，且沒有腫瘤靶向性。本實(shí)驗(yàn)以磁性Fe3O4納米微粒為內(nèi)核，負(fù)載具有抑制腫瘤增殖作用的帶魚酶解小肽，通過共沉淀法合成磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒，采用X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、透射式電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）等檢測方法對該納米粒子晶體結(jié)構(gòu)、粒徑等進(jìn)行表征；利用熒光偏振法研究該微粒在非磁場與交變磁場中對CW-2人結(jié)腸癌細(xì)胞膜流動性影響，以期為海洋酶解活性肽的進(jìn)一步高效利用提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

帶魚酶解小肽：參照文獻(xiàn)［13-14］方法自行制備；磁性Fe3O4納米微粒購于重慶威斯騰公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基于-20 ℃保存，臨用前根據(jù)需要加10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）；培養(yǎng)用抗菌素溶液：用100萬 U/瓶的青-鏈霉素溶于5 mL三蒸水中，按0.5 mL/L加入培養(yǎng)基中；滅活補(bǔ)體的FBS：將FBS置于56 ℃水浴30 min，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2交變電磁場裝置

型號：SPG-20G；頻率：237 kHz；電流：50 A；匝數(shù)：7 圈；測溫范圍：-150～+150 ℃；線圈直徑：9 cm。實(shí)驗(yàn)組維持磁場60 min，去除磁場。對照組細(xì)胞的處理?xiàng)l件除無磁場照射外，其余與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的制備

取5 mg的帶魚酶解小肽溶解于0.07 mL的無水乙醇中，用蒸餾水緩慢稀釋至50 mL，置于分液漏斗中，30 min內(nèi)逐滴滴入到勻速攪拌的40 mL磁性Fe3O4納米微粒（5 mg）水溶液中，在磁力攪拌器中600 r/min攪拌反應(yīng)2 h，最后3 000 r/min離心40 min，倒掉上清液，加入蒸餾水，超聲分散，重復(fù)3 次，純化的磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒分散在水中，4 ℃冷藏備用。

1.4磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的結(jié)構(gòu)表征

晶體結(jié)構(gòu)分析：利用BedeD1型射線衍射儀對樣品晶體結(jié)構(gòu)及化學(xué)計量成分進(jìn)行測試，所采用的X射線源為射線GuKa，波長為0.154 06 nm。

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析：采用KBr壓片法制備試樣，用智能傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行鑒定與結(jié)構(gòu)分析，測定波數(shù)范圍為4 000～1 000 cm-1。

晶體的尺寸和形態(tài)分析：采用負(fù)染法，取5 μL樣品晶體混懸液滴于TEM載樣銅網(wǎng)上，在室溫放置后取出，用濾紙吸干，滴加5 μL 3%的磷鎢酸負(fù)染，并且自然晾干，在加速電壓下觀察納米晶體的形態(tài)。用ZAFM-II型號的原子力顯微鏡來測定磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的直徑、高度和粗糙度等形貌特征。

1.5磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒對CW-2細(xì)胞膜流動 性的影響

參照文獻(xiàn)［15-16］，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及對照組細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次后，用PBS配成終濃度為2×108個/L的單細(xì)胞懸液，取l mL細(xì)胞懸液與l mL 1，6-二苯基-1，3，5-己三烯溶液混合，37 ℃保溫30 min，用PBS洗滌2 次后，細(xì)胞混勻在3 mL的PBS中，在激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長430 nm的條件下測定IVV、IVH、IHV、IHH的熒光強(qiáng)度，其中H為偏振光垂直方向，V為偏振光水平方向，前腳注為發(fā)射光，后腳注為激發(fā)光，由公式（1）～（3）計算出熒光偏振度P和膜的平均微黏度η。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0版統(tǒng)計分析軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或秩和檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1晶體結(jié)構(gòu)分析

圖1　磁性Fe3O4納米微粒、帶魚酶解小肽和磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的XRD對比光譜Fig.1　XRD spectra of Fe3O4nanoparticle， hairtail pe ptides， magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides

由圖1可知，純磁性Fe3O4納米微粒的X射線衍射譜峰大致出現(xiàn)在2θ=30.24°、35.40°，分別對應(yīng)立方相（220）、（311）晶面［17-18］。在復(fù)合帶魚酶解小肽后，樣品中Fe3O4的特征衍射峰消失，F(xiàn)e3O4的最強(qiáng)衍射峰的強(qiáng)度也明顯消失，說明帶魚酶解小肽對Fe3O4的嚴(yán)密包覆導(dǎo)致了曲線中Fe3O4的特征衍射信號強(qiáng)度減弱或消失，這一點(diǎn)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中被TEM結(jié)果證實(shí)。以上結(jié)果說明帶魚酶解小肽與磁性Fe3O4納米微粒成功地結(jié)合在一起。

2.2FTIR分析

圖2是磁性Fe3O4納米微粒、帶魚酶解小肽和磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的FTIR圖。在磁性Fe3O4納米微粒FTIR圖中3 439 cm-1附近出現(xiàn)的峰是由—OH的伸縮振動產(chǎn)生的，589 cm-1和632 cm-1處的峰分別是磁性Fe3O4納米微粒中的鐵氧鍵和亞鐵氧鍵的特征吸收峰。在帶魚酶解小肽和磁性Fe3O4納米微?；旌隙傻奈⒘５腇TIR圖中可以看出，磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒在1 635、1 114、589 cm-1處具有特征吸收峰，并且與Fe3O4的紅外光譜一致。其中，磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒在589 cm-1處出現(xiàn)Fe—O—Fe吸收峰，其他特征吸收峰幾乎不變，表明復(fù)合材料中有Fe3O4的存在。與帶魚酶解小肽相比，磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒在1 817、1 201、837 cm-1處吸收峰消失，表明帶魚酶解小肽的甲基（—CH3）、亞甲基（—CH2）、酮基（C=O）與磁性Fe3O4納米微粒之間存在化學(xué)鍵的結(jié)合。

圖2　磁性FFee3O4納米微粒、帶魚酶解小肽和磁性FFee3O4納米帶魚肽微粒的FFTTIIRR圖Fig.2　FTIR spectra of Fe3O4nanoparticle， hairtail peptides， magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides

2.3TEM圖像分析

圖3　磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的TTEEMM照片F(xiàn)ig.3　TEM pictures of magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides

圖3是磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的TEM照片，合成的樣品呈球形，顆粒之間有黏連現(xiàn)象，形成纏繞彎曲的線狀。樣品粒徑約10 nm，球形，邊緣呈無定形的即為帶魚酶解小肽。圖3C是樣品的高分辨TEM圖片，可以清晰地看到磁性Fe3O4納米微粒的晶格，證明其結(jié)晶性能非常好，晶格間距為0.298 nm，屬于（220）晶面。圖3D是磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的能譜圖，可以看到N元素的存在，這應(yīng)該可以歸結(jié)為帶魚酶解小肽含有的N元素；Fe和O元素的原子比例為41.95∶58.05，與磁性Fe3O4納米微粒的成分相符合。

2.4AFM圖像分析

通過AFM測試每一層的掃描圖像、高度成像（三維圖）、相位圖像，結(jié)果如圖4所示。AFM可以測試樣品的粗糙度，測試結(jié)果的表面根均方值會因?yàn)闃悠窛舛群蜆悠贩N類的不同而改變，由圖4A可知，帶魚酶解小肽微粒分布不均勻，而且很不平坦。由圖4B可知，磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒分布非常均勻，由于帶魚酶解小肽的膠黏作用，磁性Fe3O4納米微粒與帶魚酶解小肽形成了團(tuán)聚，微粒分布很平坦。

圖4　帶魚酶解小肽（A）和磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒（B）的AFM照片F(xiàn)ig.4　AFM pictures of hairtail peptides （A） and magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides （B）

2.5樣品的穩(wěn)定性

樣品在pH 6.5的條件下，存放3 周都不產(chǎn)生任何聚集；調(diào)整pH值到9.0以上時，會產(chǎn)生少量的聚集。這是由于氨基的等電點(diǎn)在pH 9.0左右，堿性過強(qiáng)時，會中和掉氨基所帶的正電荷；改變pH值降低到5.0以下時，由于納米粒子本身有堿性氧化物組成，因此放置2 d以后，納米粒子會被溶解掉。因此，磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的最佳使用pH值范圍是6.5～9.0，比較適合于在生物體系中應(yīng)用。

2.6CW-2細(xì)胞膜流動性變化

表1　磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒對CW--22細(xì)胞膜P、η值的影響Table1　Effect of magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtaill peptides on membrane fluidity in CW-2 cells in terms of and value

細(xì)胞膜流動性可以用熒光偏振度P、微黏度η表示，P和η越小，細(xì)胞膜的流動性越大［19］。由表1可知，磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒在交變磁場作用于CW-2細(xì)胞24 h后，P值顯著減小，η值減小，表明樣品可使CW-2細(xì)胞膜流動性增大，且作用呈量效關(guān)系。

細(xì)胞膜流動性是生物膜最基本的物理性質(zhì)，生物膜的各項(xiàng)功能如能量轉(zhuǎn)化、物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞等都與膜的流動性密切相關(guān)，細(xì)胞要發(fā)揮正常的生理功能要求膜處于一定的流動狀態(tài)［20］。研究表明，細(xì)胞癌變后，細(xì)胞膜流動性會發(fā)生改變，且因瘤細(xì)胞來源的不同其變化趨勢也不同，但基本上遵循下述規(guī)律：實(shí)體瘤細(xì)胞膜的流動性比相應(yīng)的正常細(xì)胞低，腹水瘤、白血病等細(xì)胞膜流動性較相應(yīng)正常細(xì)胞高［21］。

熒光偏振法是應(yīng)用最廣的測定膜脂流動性的方法［22-23］，由熒光偏振度計算出的微黏度值反映了脂質(zhì)的有序程度和脂鏈擺動的速率。在流體力學(xué)中，微黏度值的倒數(shù)被稱為流動性。膜脂區(qū)無序性越大，脂質(zhì)分子排列越不整齊，微黏度值越小，流動性越大，反之，流動性越小。本實(shí)驗(yàn)采用該法檢測磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒對CW-2細(xì)胞膜流動性的影響。結(jié)果表明，CW-2細(xì)胞作為實(shí)體瘤細(xì)胞，其膜流動性較正常細(xì)胞低，在交變磁場經(jīng)磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒處理后細(xì)胞膜流動性增加。這有助于誘導(dǎo)細(xì)胞分化、從而降低其癌變的惡性程度。同時由于膜流動性的改變，會影響細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的位 置，導(dǎo)致細(xì)胞膜上抗原決定簇的暴露或掩蓋，從而引起細(xì)胞免疫原性的改變［24］。另外，細(xì)胞膜流動性增大可加速細(xì)胞膜內(nèi)一些蛋白分子的擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，促進(jìn)藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡［25］。

3　結(jié) 論

裸露的納米Fe3O4粒子易沉淀。為了增加裸露的超順磁性Fe3O4顆粒懸浮穩(wěn)定性及生物相容性，通常需對其進(jìn)行表面修飾，這種修飾同時也增強(qiáng)了包覆分子的生物活性。本實(shí)驗(yàn)通過共沉淀法合成磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒，粒徑約10 nm，分布較均勻，帶魚酶解小肽包覆的納米Fe3O4具有較好的生物相容性。熒光偏振法研究表明該微粒在交變磁場中對CW-2人結(jié)腸癌細(xì)胞膜流動性有明顯的增強(qiáng)作用，提示交變磁場作用下Fe3O4納米帶魚肽微粒引起的細(xì)胞膜流動性增強(qiáng)可能是結(jié)腸癌細(xì)胞死亡的一個原因。

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Preparation of Magnetic Fe3O4Nanoparticles Loading Peptides Derived from Enzymatic Hydrolysis of Hairtail Waste Proteins and Its Effect on Membrane Fluidity in CW-2 Cells

SHI Yunjie， LIN Huimin*， JIN Tunan， DENG Shanggui
（College of Food and Pharmacy， Zhejiang Ocean University， Zhoushan 316000， China）

Objective： To prepare magnetic Fe3O4nanoparticles loading peptides derived from enzymatic hydrolysis of hairtail processing waste proteins and explore its effect on membrane fluidity in CW-2 cells. Methods： The target product was synthesized by co-precipitation method， and its structure characteristics and particle size distribution were observed with X-ray diffraction （XRD）， transmission electron micros cope （TEM） and atomic force microscope （AFM）. Meanwhile， its effect on membrane fluidity in human colon cancer CW-2 cells was explored by fluorescence polarization in a non-magnetic field and an alternating magnetic field. Results： Magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides were uniformly distributed with a size of approximately 10 nm and they were found to adhere to each other to form intertwined curves. Compared with the single magnetic Fe3O4particles， loading of hairtail peptides enhanced dispersion stability of magnetic nano-Fe3O4particles. The optimum pH for magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides was 6.5-9.0. Cell membrane fluidity tests showed that P and η values in the experimental group were significantly reduced after 24 h of alternating magnetic field exposure， indicating that the magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides could increase cell membrane fluidity. Conclusion： Magnetic Fe3O4nanoparticles loading hairtail peptides can enhance the anti-tumor activity of hairtail peptides in an alternating magnetic field.

magnetic Fe3O4nanoparticles； hairtail enzymatic peptides； structure characterization； CW-2 cell； cell membrane fluidity

10.7506/spkx1002-6630-201619005

S38

A

1002-6630（2016）19-0031-05

石蕓潔， 林慧敏， 金圖南， 等. 磁性Fe3O4納米帶魚肽微粒的制備及對CW-2細(xì)胞膜流動性的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（19）： 31-35. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619005. http：//www.spkx.net.cn

SHI Yunjie， LIN Huimin， JIN Tunan， et al. Preparation of magnetic Fe3O4nanoparticles loading peptides derived from enzymatic hydrolysis of hairtail waste proteins and its effect on membrane fluidity in CW-2 cells［J］. Food Science， 2016，37（19）： 31-35. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619005. http：//www.spkx.net.cn

2015-11-22

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301597）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471609）；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（2013418013-4）

石蕓潔（1995—），女，本科生，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail：2278560458@qq.com

林慧敏（1979—），女，副教授，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail：linhuixiaomin@126.com