戎蓉，歐杰

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306

響應(yīng)面法優(yōu)化普魯蘭多糖發(fā)酵工藝條件

戎蓉，歐杰*

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306

為了提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量，本文利用響應(yīng)面分析法對(duì)普魯蘭多糖的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)確定時(shí)間、轉(zhuǎn)速、初始pH為影響出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭多糖的三個(gè)顯著因素。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法分析來確定最佳的發(fā)酵條件。最終確定優(yōu)化條件為溫度25℃，時(shí)間5.5 d，轉(zhuǎn)速240 r/min，初始pH 6.6，裝液量30 mL，接種量2%。優(yōu)化后的普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到26.31 mg/mL，與預(yù)測(cè)值26.68 mg/mL接近，比初始產(chǎn)量16.13 mg/mL提高了63.1%。

響應(yīng)面法；普魯蘭多糖；發(fā)酵工藝

普魯蘭多糖是由素有“黑酵母”之稱的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種天然的、類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性粘質(zhì)多糖［1］，它是先由葡萄糖按α-1，4糖苷鍵結(jié)合成麥芽三糖，在其兩端再以α-1，6糖苷鍵將麥芽三糖結(jié)合，如此反復(fù)連接而形成的一種線性高分子物質(zhì)［2］。

我國(guó)在20世紀(jì)80年代左右開始對(duì)普魯蘭多糖進(jìn)行研究，但由于出芽短梗霉細(xì)胞形態(tài)極其多樣化等條件的制約，目前對(duì)普魯蘭多糖的研究還存在諸多難題［3］。出芽短梗霉在其發(fā)酵過程中會(huì)進(jìn)行許多變種，其可呈現(xiàn)酵母狀細(xì)胞，膨大細(xì)胞，厚垣孢子和菌絲等多種形態(tài)［4］，這些細(xì)胞合成有用代謝產(chǎn)物的能力有差異，而其發(fā)酵過程中的一些發(fā)酵條件如溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值、時(shí)間等等都在很大程度上影響這些細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化。Nishat Sharma等［5］人經(jīng)研究表明出芽短梗霉的發(fā)酵溫度的變化值從25～30℃以及100 r/min到350 r/min之間不同的轉(zhuǎn)速值的變化對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響都較大。K.R. Sugumaran等［6］人經(jīng)過研究表明在發(fā)酵過程中，前7天普魯蘭的多糖產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，而在之后繼續(xù)培養(yǎng)過程中產(chǎn)量則逐漸下降，在144 h產(chǎn)量達(dá)到最大值?？拙S甲等人經(jīng)過試驗(yàn)表明在最適pH條件下，出芽短梗霉生長(zhǎng)繁殖以酵母狀細(xì)胞或膨大細(xì)胞為主，而pH2.2或pH7.0時(shí)出芽短梗霉形成分生組織狀結(jié)構(gòu)，使其具有不同的產(chǎn)普魯蘭多糖的能力［7］。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵產(chǎn)量的高低由菌種的遺傳物質(zhì)決定，發(fā)酵所需的營(yíng)養(yǎng)成分提供給了菌種能發(fā)揮其性能的必要條件。但遺傳基因的表達(dá)也受到發(fā)酵條件的影響，發(fā)酵過程中的各種物理化學(xué)因素都會(huì)對(duì)菌種產(chǎn)生影響［8］。因此，對(duì)發(fā)酵過程中一些物理化學(xué)參數(shù)進(jìn)行合理的調(diào)控是對(duì)于提高代謝產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)量的一個(gè)有利措施［9］。因此優(yōu)化出較為合適的發(fā)酵條件是提高普魯蘭多糖產(chǎn)量的必要途徑。

目前國(guó)內(nèi)外主要利用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭多糖的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化［10］，常帆等人利用響應(yīng)面法優(yōu)化出芽短梗霉As3.933產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，使其產(chǎn)量從初始的17.32 mg/mL提高到22.29 mg/mL，提高了28.7%的產(chǎn)量［11］。而利用此方法對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化選擇的較少。

本文就針對(duì)溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值、裝液量、時(shí)間、接種量這六個(gè)主要的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分析，利用這種優(yōu)化試驗(yàn)條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)用較少的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推算出目標(biāo)值的最優(yōu)條件，最終有效提高優(yōu)化效率［12，13］。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌種出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）：IFO4464購(gòu)于上海市工業(yè)微生物研究所，由本實(shí)驗(yàn)室保存于PDA斜面培養(yǎng)基上。

1.1.2培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）

種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖59.8、（NH4）2SO40.7、K2HPO45.0、MgSO40.3、NaCl1.5、KCl0.5酵母膏2.5、pH自然、1×105Pa滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖59.8、（NH4）2SO40.7、K2HPO45.0、MgSO40.3、NaCl1.5、KCl0.5酵母膏2.5、pH自然、1×105Pa滅菌20 min。

1.1.3儀器及設(shè)備滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司YXQ-LS-18SI），離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司H-2050R-1），振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器ZQLY-300），pH計(jì)（METTLER TOLEDO 320S）。

1.2分析方法

1.2.1總糖的測(cè)定培養(yǎng)一定時(shí)間后，于4500 r/min下離心20 min，然后取上清液加入2倍體積的無水乙醇，在4℃下靜置24 h，將沉淀物放于3000 r/min下離心10 min，用乙醇再洗，60℃下烘干至恒重，此為普魯蘭多糖粗品，用蒽酮比色法測(cè)量其中多糖的量［14］。

1.2.2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以普魯蘭多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值選用N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)6種因子（溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值、裝液量、時(shí)間、接種量）進(jìn)行考察，另外取5個(gè)虛擬項(xiàng)進(jìn)行誤差估計(jì)。每個(gè)因子取2個(gè)水平，高水平編碼為+1，低水平編碼為-1。各因子水平取值見表1。用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析水平表Table 1 Values of coded levels used for the Plackett-Burman experimental design

1.2.3響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，用Design-Expert 8.0.6軟件，在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照N=12進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Plackett-Burmen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表2，各因素效應(yīng)值及顯著性分析見表3。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)Placktt-Burman設(shè)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行方差分析得出，對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量產(chǎn)生顯著性影響的因素為時(shí)間、初始pH和轉(zhuǎn)速，其中時(shí)間和轉(zhuǎn)速為顯著正效應(yīng)，初始pH值為顯著負(fù)效應(yīng)，且根據(jù)表中的P值分析可知時(shí)間、初始pH和轉(zhuǎn)速的三因素的置信度均在90%以上，因此可將這三個(gè)因素作為下一步研究對(duì)象，其他因素定為非顯著因素，它們的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

表2　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results for the Plackett-Burman experiment

表3　因素效應(yīng)值及顯著性分析Table 3 Values of effect size and analysis of significance for factors

2.2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

通過以上Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，確定了時(shí)間、初始pH和轉(zhuǎn)速為影響普魯蘭多糖產(chǎn)量的顯著因素。為了得到這三個(gè)因素對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的確切影響情況及其最佳配比，下面需要利用Design-Expert 8.0.6軟件，使用Box-Behnken試驗(yàn)方法對(duì)這三個(gè)因素進(jìn)行考查。實(shí)驗(yàn)因素水平的選取見表4，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表4　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 4 Values of coded levels used for the Box-Behnken experimental design

表5　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results for the Box-Behnken experiment

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到的回歸方程為：普魯蘭多糖產(chǎn)=29.61-1.49×A+1.91×B+2.86×C+3.89×A×B+0.065×A×C-0.42×B×C-2.72×A2-8.83×B2-5.93×C2。

由表6可知，根據(jù)該模型的F值和P值可得出該模型具有高度顯著性［Probability＞F）=0.0032］。模型的相關(guān)系數(shù)為R2=92.70%，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合的很好，能很好地預(yù)測(cè)普魯蘭多糖發(fā)酵條件與多糖產(chǎn)量的關(guān)系；而分析表B2、C2和C具有顯著性，其他項(xiàng)的系數(shù)均不顯著，說明試驗(yàn)因子C在所選范圍內(nèi)和二次項(xiàng)B2、C2對(duì)響應(yīng)值都有很大關(guān)系，A、B在設(shè)定的范圍內(nèi)對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響不顯著。校正決定系數(shù)（Adj R-Squared）為0.8330，說明該模型能解釋83.3%響應(yīng)值的變化；而本模型的信噪比（Adeq Precision）為9.087，一般來說，模型的信噪比大于4就可以說明這個(gè)模型是比較好的，從而進(jìn)一步說明該模型合理可靠。

表6　Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 6Analysis of variance for response surface quadratic model

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到響應(yīng)面立體分析圖（圖1）。每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。由圖可知，時(shí)間、初始pH和轉(zhuǎn)速與普魯蘭多糖的產(chǎn)量存在顯著相關(guān)性，其中時(shí)間和初始pH值對(duì)普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響較為顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加和初始pH的提高，普魯蘭多糖的產(chǎn)量明顯增加。但隨著時(shí)間和初始pH的進(jìn)一步增加，普魯蘭多糖產(chǎn)量會(huì)有不同程度的下降。并且由相應(yīng)的等高線圖可以看出，時(shí)間與初始pH的等高線圖接近圓形，交互作用是不顯著的，而時(shí)間與轉(zhuǎn)速、初始pH與轉(zhuǎn)速的等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著。

圖1　響應(yīng)面法分析AB為初始pH和轉(zhuǎn)速之間的相互作用；CD為時(shí)間和轉(zhuǎn)速之間的相互作用；EF為時(shí)間和初始pH之間的相互作用Fig.1 Response surface method for pullulan productionAB：The interaction between initial pH and speed；CD：The interaction between time and speed；EF：The interaction between time and initial pH

2.3最佳發(fā)酵條件的驗(yàn)證

為了證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得普魯蘭多糖產(chǎn)量為26.31 mg/mL，與模型預(yù)測(cè)值一致（相對(duì)誤差0.99%）。

3　結(jié)論

通過對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵條件進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分析，最終確定優(yōu)化條件為溫度25℃，時(shí)間5.5 d，轉(zhuǎn)速240 r/min，初始pH 6.6，裝液量30 mL，接種量2%。優(yōu)化后的普魯蘭多糖產(chǎn)量達(dá)到26.31 mg/mL，比初始產(chǎn)量16.13 mg/mL提高了63.1%。

4　討論

本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化普魯蘭發(fā)酵工藝條件，實(shí)驗(yàn)得出的預(yù)測(cè)結(jié)果與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，具有很好的重現(xiàn)性，可見該模型可以較好的預(yù)測(cè)普魯蘭多糖實(shí)際發(fā)酵情況。并且考慮到各參數(shù)之間的相互影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化將三個(gè)主要影響因素同時(shí)進(jìn)行最佳條件的選擇，更加高效地達(dá)到優(yōu)化的效果，使普魯蘭多糖的產(chǎn)量大幅上升達(dá)到26.31 mg/mL，該產(chǎn)量在已有研究報(bào)道中仍是具有優(yōu)勢(shì)的數(shù)據(jù)，高于Jianxiong Kang［15］等人之前的研究報(bào)道中的產(chǎn)量。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化普魯蘭多糖發(fā)酵工藝條件是行之有效的。

［1］Rajeeva G，Singh R，Kumar G.Aureobasidium pullulans，an economically important polymorphic yeast with special reference to pullulan［J］.African Journal of Biotechnology，2010，9（47）：7989-7997

［2］Singh RS，Saini GK，Kennedy JF.Maltotriose syrup preparation from pullulan using pullulanase［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80：401-407

［3］郭法利，歐杰，馬晨晨，等.出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）生物合成普魯蘭多糖的研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（13）：113-115

［4］孔維甲，徐瓊，靳建忠，等.環(huán)境pH誘導(dǎo)出芽短梗霉細(xì)胞多形化［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31（2）：7-12

［5］Sharma GS，Anirban RC.Utilization of corn steep liquor for biosynthesis of pullulan，an important exopolysaccharide［J］. Carbohydrate Polymers，2013，93：95-101

［6］Sugumaran KR，Gowthami E，Swathi B，et al.Production of pullulan by Aureobasidium pullulans from Asian palm kernel：Anovel substrate［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92：697-703

［7］Vipul DP，Girish KJ，Simin M.Khanda.Pullulan：An exopolysaccharide and its various applications［J］.Carbohydrate Polymers，2013，95：540-549

［8］Anirban RC，Saluja P，Prasad GS.Pullulan production by an osmotolerant Aureobasidium pullulans RBF-4A3 isolated from flowers of Caesulia axillaris［J］.Carbohydrate Polymers，2011，83：1547-1552

［9］Qian X，Loong-Tak L，Tong QY.Properties of pullulan-based blend films as affected by alginate content and relative humidity［J］.Carbohydrate Polymers，2012，87：227-234

［10］Singh RS，Saini GK，Kennedy JF.Pullulan：Microbial sources，production and applications［J］.Carbohydrate Polymers，2008，73：515-531

［11］常帆，薛文嬌，安超，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化出芽短梗霉As3.933產(chǎn)普魯蘭多糖發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.化學(xué)與生物工程，2013，30（5）：42-45

［12］周喻，吳文惠，蘇同偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化海洋鐮刀腐皮菌產(chǎn)出HMG-CoA還原酶抑制劑的培養(yǎng)條件［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（8）：1516-1524

［13］Eriola B，Ezekiel AT.Modeling and optimization of bioethanol production from breadfruit starch hydrolyzate vis-a-vis response surface methodology and rtificial neural network［J］.Renewable Energy，2015，74：87-94

［14］寧正祥.食品成分分析手冊(cè)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997：26-27

［15］Kang JX，Chen XJ，Chen WR，et al.Enhanced production of pullulan in Aureobasidium pullulans by a new process of genome shuffling［J］.Process Biochemistry，2011，46：792-795

Optimization of Fermentation Technological Conditions for Pullulan Production by Response Surface Method

RONG Rong，OU Jie*
College of Food Science and Technology/Shanghai Ocean University；Shanghai Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center，Shanghai 201306，China

To improve the Pullulan production，the response surface method（RSM）was used to optimize the fermentation technological conditions of pullulan producing strain in this study.On the basis of single factor tests，Plackett-Burmen experiment was employed with six factors and showed culture time，agitation speed and initial pH were three significant factors.Then the optimized technological conditions were obtained by Box-Behnken RSM.The optimum fermentation technological conditions were determined，namely，25℃culture temperature；5.5 d culture fermentation time；240 r/min culture agitation speed，initial pH 6.6，30 mL loaded liquid and 2%（V/V）inoculum concentration.Under these fermentation technological conditions，the predicted maximal pullulan production was 26.31 mg/mL which closed to the predicted value 26.68 mg/mL，it had increased by about 63.1%compared with the previous condition 16.13 mg/mL.

Response surface method；Pullulan；fermentation technology

Q939.97

A

1000-2324（2016）05-0659-05

2015-03-15

2015-04-27

上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）

戎蓉（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù).E-mail：1026989282@qq.com

Author for correspondence.E-mail：jou@shou.edu.cn