楊洋，孫雪梅,李傳龍

(青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院　生態(tài)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島　266042)

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毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)香草扁桃酸和高香草酸

楊洋，孫雪梅,李傳龍

(青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院生態(tài)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266042)

利用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光(CE-ECL)法檢測(cè)了尿樣中的香草扁桃酸(VMA)和高香草酸(HVA)，得到了最佳的分離檢測(cè)條件：50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.2)；分離電壓16 kV；檢測(cè)電勢(shì)1.2 V(相對(duì)于飽和甘汞電極).在最佳條件下，VMA和HVA的濃度檢測(cè)限(S/N=3)分別為5.0×10-7mol/L和6.1×10-7mol/L，線性回歸系數(shù)分別為0.999 3和0.997 9.并以此方法將尿液中的VMA和HVA在10 min內(nèi)有效地分離檢測(cè)，不受其他干擾，得到加標(biāo)回收率分別為98%和99%，取得了滿意的結(jié)果.

毛細(xì)管電泳;電化學(xué)發(fā)光檢測(cè);香草扁桃酸;高香草酸

香草扁桃酸(vanilla mandelic acid,VMA)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)是人體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺的主要終末代謝產(chǎn)物，兒茶酚胺由腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的激素通過(guò)生物合成而得，這2種產(chǎn)物可以作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤的腫瘤標(biāo)記物，大約有90%的患者尿液中VMA和HVA的含量都會(huì)升高[1]，因此，檢測(cè)尿中VMA 和HVA對(duì)2種細(xì)胞瘤早期診斷及病情監(jiān)測(cè)有著重要的臨床意義.對(duì)于VMA或HVA的檢測(cè)前人做了大量的工作，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有重氮法[2]、微柱法[3]、層析法[4]等，但這些方法過(guò)程繁瑣，易受外界干擾，所以很難用于臨床檢測(cè).高效液相色譜法對(duì)于尿液中HVA和VMA 的檢測(cè)具有可靠性強(qiáng)、特異性高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但是因?yàn)槠鋬x器設(shè)備特殊，并且價(jià)格昂貴，所以難以廣泛應(yīng)用于臨床[5].毛細(xì)管電泳作為一種新型的有效的分離分析技術(shù)，具有分析速度快、分辨率高、試樣消耗量小等優(yōu)點(diǎn).電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)選擇性好、靈敏度高、線性范圍寬，經(jīng)常與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合來(lái)達(dá)到更低的檢測(cè)限，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥科學(xué)、生命科學(xué)、分子生物學(xué)[6-8]等多個(gè)領(lǐng)域.國(guó)內(nèi)雖然有關(guān)于用毛細(xì)管電泳來(lái)檢測(cè)尿液中神經(jīng)遞質(zhì)的代謝產(chǎn)物的報(bào)道，但是要預(yù)處理樣本，操作比較麻煩[9].本文結(jié)合了毛細(xì)管電泳與電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，建立了一種能夠簡(jiǎn)單快速分離檢測(cè)尿樣中VMA和HVA的方法.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；三電極體系由自制的碳纖維簇微盤(pán)電極(工作電極)、飽和甘汞電極(參比電極)、鉑絲電極(輔助電極)組成.彈性石英毛細(xì)管(60 cm×25 μm I.D.,375 μm O.D.)(河北永年光導(dǎo)纖維廠)；香草扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)品，高香草酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，市售分析純?cè)噭蝗?lián)吡啶釕.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)中CE分離系統(tǒng)和ECL檢測(cè)池的俯視圖同參考文獻(xiàn)[10]，簡(jiǎn)單地說(shuō)，由高壓電源在毛細(xì)管兩端提供高壓(0～30 kV)，毛細(xì)管兩端插在存有緩沖液的檢測(cè)池中，在進(jìn)樣端施加高壓，檢測(cè)池采用的三電極體系為：碳纖維素微盤(pán)電極(工作電極)，其制作過(guò)程同文獻(xiàn)[11]，飽和甘汞電極(參比電極)，鉑絲電極(輔助電極).把工作電極固定在檢測(cè)池上,在三維顯微鏡下將毛細(xì)管與工作電極間的距離調(diào)節(jié)為80～100 μm，將1.2 V作為檢測(cè)電勢(shì),進(jìn)樣方式為12 kV下電遷移進(jìn)樣10 s.當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)電滲流達(dá)到恒定值后開(kāi)始進(jìn)樣并記錄電泳圖.

2　結(jié)果與討論

2.1香草扁桃酸和高香草酸電化學(xué)發(fā)光行為

采用循環(huán)伏安法，在含有5.0×10-3mol/L Ru(bpy)32+的50 mmol/L pH 為8.2的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到如圖1a所示的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度譜圖，在上述條件下分別加入VMA和HVA，循環(huán)伏安掃描所得的相應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光譜圖，如圖1b、c所示.

圖1曲線a反應(yīng)出，Ru(bpy)32+溶液本身在這種實(shí)驗(yàn)條件下電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度不是很明顯.但隨著VMA和HVA的加入，Ru(bpy)32+的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)明顯增強(qiáng)(圖1b,c)，說(shuō)明了VMA和HVA可以與Ru(bpy)32+相互作用，產(chǎn)生比較強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，因此，本實(shí)驗(yàn)可通過(guò)加入Ru(bpy)32+采用電化學(xué)發(fā)光的方法來(lái)檢測(cè)VMA和HVA.

a.Ru(bpy)32+;b.Ru(bpy)32++VMA;c.Ru(bpy)32++HVA.圖1　電化學(xué)發(fā)光曲線Fig.1　Curves of the ECL emission

2.2VMA與HVA分離條件的選擇

2.2.1緩沖溶液種類的選擇

緩沖溶液的成分直接影響毛細(xì)管內(nèi)的電滲流和待測(cè)組分的遷移及最后的分離效果，實(shí)驗(yàn)考察了硼酸鹽和磷酸鹽緩沖體系，結(jié)果得出，在磷酸鹽緩沖體系中，樣品峰形好，基線平穩(wěn)，因此選擇磷酸鹽作為電泳緩沖溶液.

2.2.2緩沖溶液pH值的選擇

在50 mmol/L不同pH值的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系中分別檢測(cè)VMA和HVA，得到2種物質(zhì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與pH值的關(guān)系，見(jiàn)圖2.由圖2可知，當(dāng)緩沖液pH為8.2時(shí)，2物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均最大，因此選擇緩沖液的pH為8.2.

1.VMA;2.HVA.圖2　電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨緩沖液pH變化的曲線Fig.2　Curves of ECL intensity along with the change of the buffer pH

2.2.3緩沖液濃度的選擇

在不同濃度磷酸鹽(pH為8.2)的條件下分別檢測(cè)了VMA和HVA，所得的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度以及遷移時(shí)間tm隨緩沖溶液濃度cB的變化曲線如圖3所示.綜合考慮2種物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度以及背景噪音和遷移時(shí)間的因素，采用NaH2PO4-Na2HPO4的濃度為50 mmol/L做為實(shí)驗(yàn)條件.

a.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度曲線；b.遷移時(shí)間曲線；1.VMA;2.HVA.圖3　化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和遷移時(shí)間隨緩沖液濃度變化的曲線Fig.3　Curves of ECL intensity and tm along with the change of the buffer concentration

2.2.4分離電壓的選擇

在不同分離電壓US下，對(duì)VMA和HVA分別進(jìn)行檢測(cè)，圖4為電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和遷移時(shí)間tm隨分離電壓US的變化曲線.綜合考慮被測(cè)組分的分離度、基線噪音、分析時(shí)間等因素，選擇了16 kV作為分離電壓.

a.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度曲線；b.遷移時(shí)間曲線；1.VMA;2.HVA.圖4　化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與遷移時(shí)間隨Us變化的曲線Fig.4　 Curves of ECL intensity and tm along with the change of Us

2.2.5檢測(cè)電勢(shì)的選擇

在不同檢測(cè)電勢(shì)Ed下，對(duì)VMA和HVA分別進(jìn)行檢測(cè)，得到檢測(cè)電勢(shì)與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系如圖5所示.由圖5可看出，VMA和HVA的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨檢測(cè)電勢(shì)的增大而增強(qiáng)，但噪音信號(hào)也隨之呈上升趨勢(shì)，導(dǎo)致基流不穩(wěn)，為保證檢測(cè)的靈敏度與較好的信噪比，故選擇1.2 V作為檢測(cè)電勢(shì).

2.2.6Ru(bpy)32+的濃度的選擇

在不同濃度的Ru(bpy)32+的磷酸鹽緩沖溶液中，分別檢測(cè)2種物質(zhì)，得到VMA和HVA的發(fā)光強(qiáng)度隨緩沖液中Ru(bpy)32+的濃度變化規(guī)律如圖6所示.綜合考慮2組分的分離度和基線噪音等因素，故選擇5.0 mmol/L作為Ru(bpy)32+檢測(cè)分離組分的最佳濃度.

圖5　化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨電勢(shì)Ed變化的曲線圖6　化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨Ru(bpy)32+濃度變化的曲線Fig.5　Curves of ECL intensity of along withFig.6　Curves of ECL intensity of along with the the change of Ed change of Ru(bpy)32+ concentration

本實(shí)驗(yàn)確定了分離檢測(cè)VMA和HVA的最佳條件為50 mmol/L pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液、初始電位為1.2 V、16 kV下電遷移進(jìn)樣10 s、發(fā)光劑Ru(bpy)32+的濃度為5.0 mmol/L.在最優(yōu)條件下，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光來(lái)檢測(cè)濃度均是1.0×10-5mol/L 的2待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)混合液，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨遷移時(shí)間變化的譜圖如7所示，可以看出，VMA和HVA已經(jīng)有效分離.

圖7　VMA與HVA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳Fig.7　Electropherogram of the standard mixture solution of VMA and HVA

2.3重現(xiàn)性、線性范圍及檢測(cè)限

配一系列2組分的混合標(biāo)準(zhǔn)液(濃度范圍1.0×10-6～1.0×10-3mol/L)，在上述最優(yōu)條件下，測(cè)定待測(cè)物的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度I與濃度的關(guān)系，考察了各組分的線性范圍，得出2組分的線性回歸方程，并以信噪比為3時(shí)得到檢測(cè)下限，結(jié)果如表1.

在最優(yōu)條件下，連續(xù)檢測(cè)6次濃度均是1.0×10-5mol/L的2組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%(VMA)和3.1%(HVA)，以及遷移時(shí)間的RSD為1.1%(VMA)和0.9%(HVA).

表1　VMA與HVA的線性范圍和檢測(cè)下限Tab.1　Linear ranges and the LOD of VMA and HVA

2.4樣品的檢測(cè)及回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確取10 mL成人尿液標(biāo)準(zhǔn)樣品，將濃度均為1.0×10-5mol/L的VMA與HVA的標(biāo)準(zhǔn)混合液用尿液標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋10倍，得到樣品混合液.在以上優(yōu)化條件下對(duì)樣品混合液進(jìn)行檢測(cè)，得到電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度譜圖如下，2待測(cè)物在10 min內(nèi)被有效地分離與檢測(cè).

圖8　尿樣中VMA與HVA的電泳譜Fig.8　Electropherogram of VMA and HVA in urine

在最佳條件下的回收率實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，結(jié)果如表2，VMA和HVA的加標(biāo)回收率分別為98%和99%，上述結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度很高，給尿液中的2物質(zhì)的分離與檢測(cè)提供了一種可靠易行的方法.

表2　加標(biāo)回收率的結(jié)果 (n=5)Tab.2　Results of recovery (n=5)

3　結(jié)論

采用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法分離并檢測(cè)了尿液中的VMA和HVA，得到最佳檢測(cè)條件.在此條件下，VMA與HVA的濃度檢測(cè)限分別為5.0×10-7mol/L和6.1×10-7mol/L，其加標(biāo)回收率分別為98%和99%，此方法設(shè)備簡(jiǎn)單，快速易行，2被測(cè)物在10 min內(nèi)有效地分離與檢測(cè)，且無(wú)干擾，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，筆者期望在以后的臨床醫(yī)學(xué)中能夠得到實(shí)際應(yīng)用.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Determination of vanilla mandelic acid and homovanillic acid based on capillay electrophoresis combinated with electrochemiluminescence detection

YANG Yang，SUN Xuemei，LI Chuanlong

(Key Laboratory of Eco-chemical Engineering,Ministry of Education,College of Chemistry and Molecular Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

Vanilla mandelic acid(VMA) and homovanillic acid(HVA) in the urine were detected by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection(CE-ECL).The following conditions were suitable for the determination of VMA and HVA:running buffer,50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4(pH=8.2);separation voltage,16 kV;detection potential,1.2 V(vs.saturated calomel electrode (SCE)).Under the optimum conditions of detection,satisfactory sensitivities (LOD of 5.0×10-7mol/L for VMA and 6.1×10-7mol/L for HVA at S/N=3) were obtained,the correlation coefficients of the method were 0.999 3 and 0.997 9,respectively.The determination of these metabolites in human urine was completed within 10 min without any interferences,the recoveries were VMA 98% and HVA 99%,the result obtained is satisfactory.

capillary electrophoresis;electrochemiluminescence detection;vanilla mandelic acid;homovanillic acid

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.007

2015-08-23

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2009BM029)

楊洋(1990—)，女，河北滄州人，青島科技大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail：1193428612@qq.com

孫雪梅(1967—)，女，山東青島人，青島科技大學(xué)副教授，主要從事毛細(xì)管電泳研究.E-mail：2634702755@qq.com

O657.8

A

1000-1565(2016)03-0257-07