趙燕燕，孫東，劉麗艷，柳亞飛，王靜

( 1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定　071002；2.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定　071002；3.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定　071000)

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甘草酸18位差向異構(gòu)體不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp功能的影響

趙燕燕1,2，孫東1，劉麗艷3，柳亞飛1，王靜1

( 1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002；2.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定071002；3.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定071000)

研究甘草酸18位差向異構(gòu)體18α-甘草酸(18α-Gly)與18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和濃度對(duì)結(jié)腸癌(Caco-2)細(xì)胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影響，選擇最佳濃度比例.建立細(xì)胞模型，選擇甘草酸總濃度為1∶10∶30∶60∶120∶240 μmol/L，18α-Gly與18β-Gly物質(zhì)的量比分別為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10，根據(jù)細(xì)胞存活率，選擇合適濃度比例，利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，尋找熒光強(qiáng)度最大的濃度比，即對(duì)P-gp抑制作用最強(qiáng)，P-gp功能最弱.研究結(jié)果表明甘草酸總濃度為1 μmol/L時(shí)，隨著18α-Gly比例的減少，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，P-gp誘導(dǎo)作用逐漸增加.甘草酸總濃度為10 μmol/L和60 μmol/L時(shí)，隨著兩者物質(zhì)的量比的變化，熒光強(qiáng)度變化明顯；當(dāng)總濃度為10 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6時(shí)，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，抑制作用明顯；當(dāng)總濃度為60 μmol/L，兩者物質(zhì)的量比為5∶5時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，抑制作用最強(qiáng).

18α-甘草酸；18β-甘草酸；P-糖蛋白功能；Caco-2細(xì)胞；不同配比/濃度

甘草是一味重要的傳統(tǒng)中草藥，甘草酸是甘草中最主要的活性成分，具有解毒、消炎、抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等多方面藥理作用[1].18位H的立體構(gòu)型不同，使甘草酸存在2種差向異構(gòu)體，即18α-甘草酸(18α-glycyrrhizin，18α-Gly)和18β-甘草酸(18β-glycyrrhizin，18β-Gly).兩者空間構(gòu)型存在微小差異，但在藥理學(xué)、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及不良反應(yīng)等方面卻有著顯著不同[2].近年來，其在抗SARS病毒[3]和抗HIV病毒[4]活性方面的重要作用，使得18α-Gly和18β-Gly的比較研究越來越受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注[5-9].

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一種能量依賴性蛋白，通過轉(zhuǎn)運(yùn)作用降低細(xì)胞內(nèi)化合物濃度，減輕了藥物的不良反應(yīng)，同時(shí)也降低了藥物對(duì)細(xì)胞的作用，使藥效降低，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[10]；同時(shí)，P-gp的表達(dá)水平的變化，可影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性[11].近年來研究表明，18α-Gly和18β-Gly在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)表現(xiàn)出一定的立體選擇性，對(duì)P-gp功能和表達(dá)的影響分別表現(xiàn)為抑制作用和誘導(dǎo)作用，2種異構(gòu)體的影響截然相反.目前國內(nèi)外在轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面對(duì)甘草酸的研究，僅限于18α-Gly和18β-Gly單體分別對(duì)CYP3A表達(dá)或P-gp功能和表達(dá)的影響[12-13]，尚未見不同比例的18α-Gly和18β-Gly混合物在此方面的研究.上市制劑眾多，大部分制劑為18α-Gly和18β-Gly混合物，二者所占比例各不相同[5]，現(xiàn)有各國藥典及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚沒有對(duì)2種異構(gòu)體的組成比例做出規(guī)定.本實(shí)驗(yàn)就2種甘草酸差向異構(gòu)體不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp功能的影響進(jìn)行了研究，為新制劑的研發(fā)，臨床用藥選擇，以及相關(guān)藥物的研究與開發(fā)提供依據(jù)和新的研究思路.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；ELX800酶標(biāo)儀(美國寶特公司)；CKX41型倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)；BHC-1300ⅡA/B3超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Allegar X-22R Centriguge低溫高速離心機(jī)(美國BECKMAN)；MCO-18AIC恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋設(shè)備有限公司)；MLS-3780型高壓滅菌鍋(日本三洋設(shè)備有限公司)；WZD-160型微量振蕩器(上海創(chuàng)發(fā)電子科技有限公司)；移液槍(美國GIBCO)；25 cm2培養(yǎng)瓶(美國Costar Corning)；75 cm2培養(yǎng)瓶(美國Costar Corning)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning Costar)；吸管.

Caco-2細(xì)胞(30代，購自中國武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清(美國GIBCO，批號(hào)：141104)；100 U/mL青-鏈霉素雙抗(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：423A0522)；丙酮酸鈉(美國MERCK，批號(hào)：HG3-1166-78)；Eagle’s minimum essential medium (MEM) 培養(yǎng)基(美國GIBCO，批號(hào)：1460618)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma-Aldrich，批號(hào)：0231)；噻唑藍(lán)(MTT)(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0793)；羅丹明123(中國Solarbio，批號(hào)：1015A053)；Hepes鹽(中國Solarbio，批號(hào)：710130411)；18α-Gly對(duì)照品(18α，20β-glycyrrhizic acid，ALPS制藥，批號(hào)：10B001S)；18β-Gly對(duì)照品(18β，20β-glycyrrhizinic acid，ALPS制藥，批號(hào)：05C11S).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

MEM培養(yǎng)基制備：取1袋MEM培養(yǎng)基，稱取HEPES 鹽2.38 g和丙酮酸鈉0.11 g，用800 mL去離子水溶解稀釋，磁力攪拌3 h，加入Na2CO32.00 g，加入200 mL去離子水，磁力攪拌1 h，調(diào)pH為7.2～7.4，然后用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝，4 ℃保存.

胰蛋白酶制備：稱取胰蛋白酶0.25 g，EDTA-Na 0.30 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.04 g，葡萄糖0.1 g，苯酚紅0.000 5 g，加入100 mL去離子水溶解，磁力攪拌2～3 h，調(diào)pH為7.8～8.0，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝，-20 ℃保存.

凍存液制備：全培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO 3者體積比為7∶2∶1.用前配制.

羅丹明123溶液配制：精確稱取0.38 mg羅丹明123，用400 μL PBS溶解，備用.使用時(shí)用PBS稀釋到500 μmol/L和0.550 0 μmol/L.

MTT溶液制備：稱取250 mg MTT，溶于50 mL PBS，磁力攪拌30 min，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝至1.5 mL EP管，4 ℃避光保存，保質(zhì)期為2周.

細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察：Caco-2細(xì)胞以2×105/mL接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)10% FBS的MEM培養(yǎng)基6 mL和0.1 U/L青霉素-鏈霉素雙抗.將細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，細(xì)胞換液，在第4天，細(xì)胞長到80%～90%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的胰蛋白酶消化并傳代，當(dāng)細(xì)胞生長到30～50代時(shí)用于實(shí)驗(yàn).

1.2.218α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性的考察

將處于對(duì)數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞以2×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為200 μL，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.18β-Gly用DMSO(終體積分?jǐn)?shù)<1%)溶解，18α-Gly用MEM培養(yǎng)基溶解，并加入等量的DMSO，用MEM培養(yǎng)基稀釋，使甘草酸最終總濃度均為1、10、30、60、120、240 μmol/mL，兩者物質(zhì)的量比為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10；將每孔培養(yǎng)24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液吸盡，于陰性對(duì)照孔加入培養(yǎng)基和溶劑DMSO，實(shí)驗(yàn)孔加入不同配比和濃度的18α-Gly和18β-Gly混合液，每孔中DMSO含量相等；空白調(diào)零孔為不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h.每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物溶解.以空白對(duì)照孔調(diào)零后，測量490 nm處的吸光度(A)(實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次).計(jì)算細(xì)胞的存活率，觀察各濃度細(xì)胞的存活狀況.

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/陰性對(duì)照組平均吸光度值)×100%.

選取細(xì)胞存活率≥90%的藥物配比和濃度，進(jìn)行下一步非細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn).

1.2.318α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對(duì)P-糖蛋白功能影響的考察

依據(jù)“1.2.2”實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)[14-15]，選取18α-Gly 和18β-Gly總濃度為60、10、1 μmol/mL高中低3個(gè)濃度，在實(shí)驗(yàn)孔中分別加入以上3個(gè)濃度18α-Gly和18β-Gly不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液.將處于對(duì)數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞用0.1 mol/L胰酶消化，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，用PBS分散成1×106/mL的細(xì)胞懸液，接種于2 mL的EP管中.離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，按實(shí)驗(yàn)分組分別在實(shí)驗(yàn)孔加入高中低濃度的不同配比的18α-Gly和18β-Gly混合液，將細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min.置冰上終止作用(約10 min)，離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，用冰冷的PBS洗2次，離心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，棄上清液.按實(shí)驗(yàn)分組加入Rh-123或PBS，將細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，置冰上終止作用(約10 min)，離心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，棄上清液，冰冷的PBS清洗2次，離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，加0.5 mL PBS輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液.具體分組見表1.

流式細(xì)胞儀選擇F1通道，每次采集1萬個(gè)細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)Rh-123平均熒光強(qiáng)度，分析時(shí)設(shè)門以除去細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾.

表1　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對(duì)P-糖蛋白功能影響分組Tab.1　Groups of the different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on P-gp function

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果與討論

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞傳代于25 cm2培養(yǎng)瓶中，很快開始貼壁，48 h換液，再經(jīng)48 h細(xì)胞貼壁80%～90%.在倒置相差顯微鏡下觀察，Caco-2細(xì)胞成鋪路石狀鑲嵌排列，形態(tài)正常，與文獻(xiàn)報(bào)道[16]相似，見圖1.

a.消化后的細(xì)胞；b.細(xì)胞形態(tài).圖1　消化后的細(xì)胞和細(xì)胞形態(tài)Fig.1　Digestion cell and the morphology cell

2.218α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性的考察

實(shí)驗(yàn)分別考察了18α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性.結(jié)果表明，甘草酸總濃度一定時(shí)，18α-Gly和18β-Gly比例不同對(duì)細(xì)胞存活率影響不同.在7種不同配比的條件下，甘草酸總濃度在1～60 μmol/L，細(xì)胞存活率均大于90%，為非細(xì)胞毒性濃度.其中當(dāng)甘草酸總濃度在1～30 μmol/L，n(18α-Gly)：n(18β-Gly)=8∶2時(shí)，以及總濃度為60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6時(shí)，細(xì)胞總體存活率表現(xiàn)較高(>110%)，見圖2 a、b、c、d；總濃度在120～240 μmol/L內(nèi)，18α-Gly和18β-Gly在7種不同配比的條件下，細(xì)胞存活率均小于90%，為細(xì)胞毒性濃度.隨著濃度增加，毒性表現(xiàn)增強(qiáng)，見圖2 e、f.因此選取甘草酸總濃度分別為1、10、60 μmol/L，18α-Gly和18β-Gly物質(zhì)的量比分別為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10進(jìn)行下一步研究.

甘草酸總濃度(μmol/L)分別為a.1;b.10;c.30;d.60;e.120;f.240.圖2　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.2　Different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on the cell survival rate

2.318α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對(duì)P-gp功能影響的考察

實(shí)驗(yàn)分別考察了18α-Gly與18β-Gly總濃度(1、10、60 μmol/L)及不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)混合液對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)Rh-123的影響，見表2.結(jié)果表明，18α-Gly單體濃度為10 μmol/L和60 μmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Rh-123攝取量增多，與陰性對(duì)照相比熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，對(duì)P-gp功能表現(xiàn)出抑制作用；18β-Gly單體濃度為1、10、60 μmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Rh-123攝取量減少，與陰性對(duì)照相比熒光強(qiáng)度減弱，對(duì)P-gp功能表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，見圖3.

甘草酸總濃度為1 μmol/L時(shí)，隨著18α-Gly與18β-Gly 2種異構(gòu)體比例的減小，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)；在濃度為10 μmol/L，二者物質(zhì)的量比為4∶6時(shí)，以及濃度為60 μmol/L，物質(zhì)的量比為5∶5時(shí)，熒光較強(qiáng)，抑制作用明顯，見圖3.

表2　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)Rh-123熒光強(qiáng)度的影響(n=3)Tab.2　Different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on the fluorescence intensity of Rh-123 in Caco-2 cells (n=3)

圖3　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)Rh-123聚積作用比較Fig.3　Different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on Rh-123 accumulation compared with the control group in Caco-2 cells

甘草酸由于C18位H構(gòu)型不同，存在2種立體異構(gòu)體，18α-Gly為反式構(gòu)型，18β-Gly為順式構(gòu)型，根據(jù)位阻效應(yīng)，前者大于后者，易于受體蛋白結(jié)合，導(dǎo)致兩者比例不同時(shí)，甘草酸的藥效不同.甘草酸2個(gè)差向異構(gòu)體雖然在自然界、制劑中或在體內(nèi)很難發(fā)生差向異構(gòu)化，但在一定的化學(xué)條件下能發(fā)生構(gòu)型的改變.本實(shí)驗(yàn)前期工作中已經(jīng)研究了不同的炮制條件對(duì)甘草藥材中主成分異構(gòu)體的含量及比例的影響[17]，結(jié)果表明，生甘草中18α-Gly與18β-Gly的物質(zhì)的量比始終為1∶7，未發(fā)現(xiàn)炮制條件的變化，對(duì)甘草酸2個(gè)差向異構(gòu)體比例的影響.并對(duì)國內(nèi)外上市的4代甘草酸制劑中主成分18α-甘草酸和18β-甘草酸進(jìn)行了含量測定[5]，對(duì)同一代制劑不同劑型、不同代制劑同一劑型中兩差向異構(gòu)體的組成比例進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，甘草酸制劑不同，18α-Gly與18β-Gly所占比例各不相同，第1代與第2代、第3代與第4代甘草酸不同劑型制劑中，18α-Gly與18β-Gly的物質(zhì)的量比分別為1∶20～1∶109、3∶1～500∶1.甘草酸上市制劑眾多，各制劑選用的原料藥不同以及采取的制劑工藝不同，都可能會(huì)導(dǎo)致甘草酸制劑中主成分差向異構(gòu)體組成比例的不同.

從天然產(chǎn)物中提取、精制18β-Gly比較簡單，成本比較低，而直接合成18α-Gly成本高，多數(shù)廠家選用由前者轉(zhuǎn)化的方式制造18α-Gly.目前市售的甘草酸制劑的主成分均以18α-Gly與18β-Gly混合物的形式存在，以α體占主體的第4代甘草酸制劑-異甘草酸鎂，也含有少量的18β-Gly (n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=500∶1[5]).所以研究甘草酸18位差向異構(gòu)體18α-甘草酸(18α-Gly)與18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和濃度對(duì)結(jié)腸癌(Caco-2)細(xì)胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影響，對(duì)新制劑的研發(fā)和臨床用藥選擇具有重要的意義.

P-gp可以將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，減輕細(xì)胞的毒副作用，保護(hù)機(jī)體免受外源毒素作用，這也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性的重要原因.Caco-2細(xì)胞來源于人類結(jié)腸癌及直腸癌，P-gp是其中的一種主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.Rh-123是P-gp的特異性底物，可以用來評(píng)價(jià)P-gp的功能活性，當(dāng)P-gp功能受抑制時(shí)，Rh-123從Caco-2細(xì)胞的外排量將減少.

18β-Gly甘草可以通過誘導(dǎo)P-gp功能以加速藥物排出細(xì)胞外，起到解毒的作用，而18α-Gly對(duì)于P-gp的抑制作用，則可以減弱細(xì)胞外排，使藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮最大藥效.誘導(dǎo)和抑制作用，對(duì)于其他治療藥物的輔助作用非常大，可以使藥物發(fā)揮最大藥效同時(shí)，對(duì)機(jī)體的毒性降到最低，因此尋找合適的濃度比例非常重要.

本實(shí)驗(yàn)首先培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞模型，配制甘草酸總濃度為1、10、30、60、120、240 μmol/L 6個(gè)濃度系列，18α-Gly與18β-Gly比例分別為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10，通過毒性實(shí)驗(yàn)，選擇了1，30，60 μmol/L作為低中高3個(gè)濃度系列，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh-123熒光強(qiáng)度，判斷P-gp的功能活性，從而推斷甘草酸合適的濃度比，最終得出在總濃度為60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5時(shí)，熒光最強(qiáng)，細(xì)胞的外排作用最弱，細(xì)胞內(nèi)藥物最多，抗藥性最弱.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草酸的作用強(qiáng)度及安全性與18α-Gly和18β-Gly的濃度和比例有關(guān).通過甘草酸總濃度(1、10、60 μmol/L)及不同配比物質(zhì)的量比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)Rh-123作用影響的比較研究，在濃度為60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)P-gp抑制作用最強(qiáng)，對(duì)于藥物外排最弱，可減弱抗藥性，可能是18α-GL和18β-Gly發(fā)揮最大協(xié)同作用的的最佳濃度配比.具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究.

[1]ABE M，AKBAR F，HASEBE A，et al.Glycyrrhizin enhances interleukin-10 production by liver dendritic cells in mice with hepatitis[J].J Gastroenterol，2003，38(10)：962-967.

[2 ]宋紅波，劉茜，趙輝，等.甘草酸銨類制劑中甘草酸差向異構(gòu)體的分析[J].藥物分析雜志，2012，32(5)：883-886.

SONG Hongbo，LIU Qian，ZHAO Hui，et al.Analysis of 2 epimers in ammonium glycyrrhizinate drugs[J].China J Pharm Anal，2012，32(5)：883-886.

[3]CINML J，MORGENSTEM B，BAUER G，et al.Glycyrrhizin，all active component of liquorice roots，and replication of SARS-associated coronavirus[J].Lancet，2003，361(9374)：2045-2046 DOI：10.1016/S0140-6736(03)13615-X.

[4]PLIASUNOVA OA，HONA，KISELEVA I，et al.The anti-HIV activity of glycyrrhizic acid penta-O-nicotinate[J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2004(11)：42-46.

[5]趙燕燕，石敏健，劉麗艷，等.4代甘草酸制劑主成分異構(gòu)體及雜質(zhì)含量差異分析與變化趨勢[J].藥物分析雜志，2014，34(2)：247-254.

ZHAO Yanyan，SHI Minjian，LIU Liyan，et al.Analysis of content differences and variation trends of the principal component isomers and related substances in the four generations of glycyrrhizin preparations[J].Chin J Pharm Anal，2014，34(2)：247-254.

[6]ZOU Q G，WEI P，LI J，et al.Simultaneous determination of 18a-and18β-glycyrrhetic acid in human plasma by LC-ESI-MS and its application to pharmacokinetics[J].Biomed Chromatogr，2009，23：54-62.

[7]楊柏燦，潘穎宜.甘草“調(diào)和”的影響因素探析[J].中成藥，2013，35(1)：155-156.

YANG Bocan，PAN Yingyi.Influence factors analysis of licorice “reconciliation”[J].Chinese Traditional Patent Medicine，2013，35(1)：154-156.

[8]周倩，孫立立.蜜炙對(duì)甘草化學(xué)成分影響研究[J].中國藥學(xué)雜志，2013，48(10)：768-772.

ZHOU Qian，SUN Lili.Changes of chemical constituents in radix glycyrrhizae before and after honey processing[J].Chin Pham J，2013，48(10)：768-772.

[9]席先蓉，陳慶.正交設(shè)計(jì)研究甘草蜜制工藝[J].中國中藥雜志，2001，26(7)：460-462.

XI Xianrong，CHEN Qing.Research of licorice honey processing with Orthogonal design[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2001，26(7)：460-462.

[10]LAURETTA M S CHAN，SIMON LOWES，BARRY H HIRST.The ABCs of drug transport in intestine and liver：efflux proteins limiting drug absorption and bioavailability[J].Eur J Pharm Sci，2004，21(1)：25-51.DOI：10.1016/j.ejps.2003.07.003.

[11]LIN J H.Drug-drug interaction mediated by inhibition and induction of P-glycoprotein[j].Adv Drug Dev，2003，55：1:53.

[12]王宇光，楊明會(huì)，馬增春，等.18β-甘草酸和18α-甘草酸對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞CYP3A酶表達(dá)的影響[J].中國中藥雜志，2009，34(3)：307-311.

WANG Yuguang，YANG Minghui，MA Zengchun，et al.Effects of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid on mRNA and protein expression of cytochrome P450 3A in cultured rat primary hepatocyte[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2009，34(3)：307-311.

[13]顏苗，李蘭芳，李煥德，等.18α-甘草酸和18β-甘草酸對(duì)Caco-2細(xì)胞P-gp功能和表達(dá)的影響[J].中國中藥雜志，2012，37(1)：99-103.

YAN Miao，LI Lanfang，LI Huande，et al.Effect of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid on P-gp function and expression in Caco-2 cells[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2012，37(1)：99-103.

[14]SUN Li，SHEN Jingfang，PANG Xiaoyun，et al.Phase I safety and pharmacokinetic study of magnesium isoglycyrrhizinate after single and multiple intravenous doses in Chinese healthy volunteers[J].J Clin Pharmacol，2007,47(6)：767-773 DOI：10.1177/0091270007299757.

[15]張喜全，夏萬光，萬順之.天晴甘美[J].中國新藥雜志，2006，15(16)：1409-1410.

[16]孫敏捷，盛星，胡一橋.Caco-2細(xì)胞單層模型的建立與驗(yàn)證[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41(18)：1431-1434.

[17]趙燕燕，李楊，劉麗艷，等.甘草炮制條件對(duì)18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影響[J]:河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，35(2):138-146.DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006.

ZHAO Yanyan，LI Yang，LIU Liyan，et al.Effects of licorice processing conditions on content and proportion of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid[J].Journal of Hebei University(Naturnal Science Edition)，2015，35(2)：138-146.DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006.

(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Different proportion and concentration of Glycyrrhizic acid -18-epimers effect on P-gp function in Caco-2 cells

ZHAO Yanyan1，2,SUN Dong1,LIU Liyan3,LIU Yafei1,WANG Jing1

(1.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China;2.College of Pharmaceutical Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;3.Experimental Center of Medicine,Hebei University,Baoding 071000,China)

To evaluate the effect of glycyrrhizic acid 18 epimers,18α-glycyrrhizic acid (18α-Gly) and 18β-glycyrrhizic acid (18β-Gly) at different proportion and concentration on the P-glycoprotein (P-gp) activity in colon cancer Caco-2 cell to select their appropriate concentration and proportion in use.Making a cell model,selecting the total glycyrrhizic acid concentration of 1,10,30,60,120,240 μmol/L and proportion of 10∶0,8∶2,6∶4,5∶5,4∶6,2∶8,0∶10,determining their optimum concentration and proportion by cell survival rate,and detecting the maximum fluorescence value by flow cytometer,that is,thestrongest inhibitory effect of P-gp and its weakest function.When the concentration of glycyrrhizic acid was 1 μmol/L,the fluorescence intensity became gradually weak and its induction fuction was strengthed gradually with the reduction in proportion of 18α-Gly.When the concentration of glycyrrhizic acid was 10 μmol/L and 60 μmol/L,the fluorescence intensity changed significantly.When the concentration of glycyrrhizic acid was 10 μmol/L and their proportion wasn(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6,the fluorescence intensity became stronger and its inhibitory effect was remarkable.When the concentration of glycyrrhizic acid was 60 μmol/L and their proportion wasn(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5,the fluorescence intensity was the highest,and the strongest inhibitory effect of P-gp appeared.

18α-glycyrrhizic acid;18β-glycyrrhizic acid;P-glycoprotein;Caco-2 cell;different proportion/ concentration

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.006

2015-10-08

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2013201203)；河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科專項(xiàng)資金建設(shè)項(xiàng)目(2014A1003)

趙燕燕(1960—)，女，天津人，河北大學(xué)教授，主要從事藥學(xué)以及將現(xiàn)代分離技術(shù)用于臨床、藥學(xué)、食品、環(huán)境等方面的研究.E-mail：zhaoyany606@tom.com

R285.5

A

1000-1565(2016)03-0249-08