林觀康，黃東暉，蔡凌峰，王慧賢

1.廣東省中醫(yī)院呼吸科，廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院呼吸科，廣東 珠海 519000

◆實(shí)驗(yàn)研究◆

痰熱清注射液對COPD大鼠體內(nèi)炎癥因子及氣道黏液高分泌的影響

林觀康1，黃東暉1，蔡凌峰1，王慧賢2

1.廣東省中醫(yī)院呼吸科，廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院呼吸科，廣東 珠海 519000

目的：觀察痰熱清注射液對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）大鼠白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及黏蛋白5AC（MUC5AC）表達(dá)的影響，初步探討痰熱清注射液通過炎性介質(zhì)路徑干預(yù)COPD大鼠氣道黏液高分泌的作用機(jī)制。方法：清潔級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為空白組、模型組、痰熱清組，每組20只，除空白組外，其余2組采用脂多糖（LPS）聯(lián)合煙熏建立COPD大鼠模型。痰熱清組腹腔注射痰熱清注射液，空白組和模型組同時給予等量生理鹽水腹腔注射。檢測大鼠肺功能，肺組織切片行HE染色，測定肺組織勻漿中IL-8、TNF-α及肺泡灌洗液中MUC5AC的含量。結(jié)果：與空白組比較，模型組和痰熱清組大鼠體量明顯下降，模型組氣道阻力（RI）和肺總量（TLC）顯著升高，第0.1秒用力呼氣量與用力肺活量的比值（FEV0.1/ FVC）顯著降低，肺泡灌洗液中MUC5AC的含量和肺組織勻漿中的炎癥因子IL-8、TNF-α顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；肺動態(tài)順應(yīng)性（Cdyn） 無顯著變化。與模型組比較，痰熱清組大鼠體量增加，RI和TLC下降，F(xiàn)EV0.1/FVC升高，MUC5AC和TNF-α含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；IL-8和Cdyn無顯著變化。結(jié)論：痰熱清注射液可以通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放、調(diào)節(jié)MUC5AC分泌，來減輕氣道炎癥，從而改善氣道黏液高分泌癥狀，在一定程度上起到延緩肺功能惡化的作用。

慢性阻塞性肺疾病；痰熱清注射液；氣道黏液高分泌；肺功能；黏蛋白5AC（MUC5AC）；白細(xì)胞介素-8（IL-8）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）；動物實(shí)驗(yàn)

DOI：10.13457/j.cnki.jncm.2016.10.095

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是以持續(xù)氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)常見病，其發(fā)病率高、住院率高、致殘率高、醫(yī)療費(fèi)用高，給患者和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）是COPD患者就診以及住院治療的主要原因，也是龐大醫(yī)療費(fèi)用的主要來源。氣道黏液高分泌是AECOPD重要的病理生理特征，在急性發(fā)作期氣道黏液分泌量增加，且其黏度也明顯增加，從而使氣道阻塞程度和病情迅速加重。目前認(rèn)為黏液高分泌已經(jīng)成為影響COPD病情和預(yù)后的關(guān)鍵危險因素，在COPD發(fā)病和治療中具有重要意義，已經(jīng)成為新的治療靶點(diǎn)［1］。本課題組總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)和前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，痰熱清注射液有改善AECOPD患者支氣管通氣功能和提高肺功能的作用［2］，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究以氣道炎癥和黏液高分泌為切入點(diǎn)，觀察痰熱清注射液對COPD大鼠肺組織、肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及黏蛋白5AC（MUC5AC）表達(dá)的影響，初步探討其在COPD治療中的抗炎和改善氣道黏液高分泌的作用。

1　材料和方法

1.1動物分組、造模及給藥雄性SD大鼠60只，SPF級，體量（200±20g），由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號44002100004220。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組：空白組、模型組、痰熱清組，每組20只，使用品紅和苦味酸在大鼠身體的不同部位標(biāo)記涂點(diǎn)，記錄大鼠體量。除空白組外，其余2組氣管內(nèi)滴注LPS加煙霧煙熏復(fù)制COPD大鼠模型，在第1、8、15天，用1%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將小號灌胃針快速插入氣管，用1 mL注射器抽取200 uL LPS溶液（把1 mg LPS溶解于1 mL生理鹽水配制成濃度為1 g/L的LPS溶液），緩緩注入氣管，然后將固定板直立旋轉(zhuǎn)，使LPS能夠均勻分布于兩肺。第2～40天（第8、15天除外）將大鼠置入60 cm×50 cm×40 cm熏吸箱內(nèi)，10支香煙內(nèi)熏，每天上午、下午各30 min?？瞻捉M同期氣管內(nèi)注入生理鹽水，其余無特殊處理。造模40天后，痰熱清組按成人最大劑量40 mL/60 kg計算，將痰熱清注射液用生理鹽水按1∶5進(jìn)行稀釋，腹腔注射，每天1次，空白組和模型組同期給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)10天。在實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠死亡3只，痰熱清組死亡2只。

1.2藥物與試劑痰熱清注射液（10 mL/支），上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號Z20030054。脂多糖（LPS，貨號L2880-10MG）。大鼠IL-8、TNF-α及MUC5AC ELISA試劑盒購自廣州妙博生物有限公司。大前門香煙（焦油量23 mg/支，上海卷煙廠）。

1.3主要儀器AllegraX-22R多功能臺式冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter公司）；VICTOR X5酶標(biāo)儀（Perkin Elmer公司）；Eppendorf系列微量移液器（德國，Eppendorf公司）；光學(xué)顯微鏡、顯微攝像儀（日本OLYMPUS公司）；自制動物熏吸箱（60 cm×50 cm×40 cm）。

2　檢測指標(biāo)與統(tǒng)計學(xué)方法

2.1一般情況分別觀察各組大鼠造模后及治療后的一般情況，如精神狀態(tài)、皮毛色澤、活動情況、呼吸、飲水量、體重等情況。

2.2檢測大鼠肺功能用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，剝離暴露氣管，行氣管插管，連接固定后，置于動物肺功能檢測儀上，檢測肺功能，測定大鼠第0.1秒用力呼氣量與用力肺活量的比值（FEV0.1/FVC），氣道阻力（RI），肺總量（TLC），肺動態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）。

2.3肺組織病理檢查檢測肺功能后，迅速開胸分離肺臟，結(jié)扎左主支氣管，向右肺注入4%多聚甲醛溶液，將右肺連帶右主支氣管一同拉出，然后剪斷右主支氣管，將右肺放入4%多聚甲醛瓶中固定，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色，然后行病理學(xué)檢查。

2.4ELISA法檢測肺泡灌洗液（BALF） 中MUC5AC含量BALF：拔出氣管套管，用22G靜脈留置針的套針部分經(jīng)術(shù)口插入氣管，用手術(shù)線結(jié)扎固定。用1 mL注射器抽取生理鹽水0.8 mL，接于留置針后緩慢注入，同時稍微用力按摩胸部，以便灌洗充分，然后緩慢抽出，灌洗3次，回收約2.4 mL，得到的BALF置于5 mL離心管中，然后在低溫離心機(jī)4℃3000 r/min條件下離心10 min，離心后吸取上清液2 mL分裝到2個1.5 mL的離心管中，分別裝得1 mL灌洗上清，-80℃凍存。采用ELISA法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。選取10個合格樣本進(jìn)行檢測。

2.5ELISA法檢測肺組織IL-8、TNF-α含量肺組織勻漿：取冰凍肺組織勻漿后，在低溫離心機(jī)4℃，3000 r/min條件下離心10 min，離心后吸取上清液，ELISA法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。選取10個合格樣本進(jìn)行檢測。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用SPSS19進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間均數(shù)符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)的比較運(yùn)用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布或不符合方差齊性檢驗(yàn)運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，取α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

3　結(jié)果

3.1一般情況空白組：一般狀況好，大鼠毛發(fā)有光澤、密度均勻，雙目有神，呼吸平穩(wěn)，飲水量正常，無死亡。模型組：大鼠在煙熏早期出現(xiàn)狂躁不安，第9天起有大鼠出現(xiàn)打噴嚏（類似人擤鼻涕的聲音）癥狀，之后所有大鼠陸續(xù)出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽及呼吸加深癥狀，部分大鼠口鼻部有少許黏性分泌物，煙熏后期大鼠神情倦怠，活動減少，毛發(fā)易脫毛、黃澀，飲水量增加。痰熱清組：大鼠在煙熏過程中表現(xiàn)同模型組，神情倦怠，出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽及呼吸加深等癥狀，后經(jīng)痰熱清注射液腹腔注射，大鼠打噴嚏、咳嗽及呼吸加深等癥狀逐漸減輕，毛發(fā)黃染，精神狀態(tài)、行為活動較模型組好轉(zhuǎn)，飲水量較正常。

3.2各組大鼠體重變化比較見表1。分別于第1、20、50天測定大鼠體重。與空白組比較，模型組和痰熱清組大鼠體量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，痰熱清組大鼠體量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組大鼠體重變化比較（x±s）

3.3各組大鼠肺功能測定結(jié)果比較見表2。與空白組比較，模型組RI和TLC顯著升高，F(xiàn)EV0.1/FVC顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；Cdyn無顯著變化。與模型組比較，痰熱清組RI和TLC下降，F(xiàn)EV0.1/FVC升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Cdyn無顯著變化。

表2　各組大鼠肺功能測定結(jié)果比較（x±s）

3.4各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察見圖1。各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果?？瞻捉M：支氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，管腔內(nèi)無滲出物，支氣管周圍較少炎性細(xì)胞浸潤，未見腺體增生，血管壁未見增厚，肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)，肺泡壁完整，肺泡腔未見病理性擴(kuò)大。模型組：支氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)排列紊亂，可見部分上皮脫落，管腔內(nèi)可見炎性滲出，腺體及杯狀細(xì)胞顯著增生肥大，周圍可見淋巴增生，支氣管壁周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，血管壁增厚，肺泡擴(kuò)張，肺泡壁變薄或斷裂，融合形成肺泡氣腫，肺間質(zhì)血管充血，與人類COPD病理形態(tài)學(xué)改變相符合，表明COPD大鼠模型復(fù)制成功。痰熱清組：與模型組比較，炎癥有所減輕，炎性浸潤減少，腺體及杯狀細(xì)胞增生減少，血管壁輕度增厚，病理改變有所減輕，從病理角度證實(shí)痰熱清注射液能有效抑制COPD的氣道炎癥反應(yīng)及減輕氣道黏液高分泌。

圖1　各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果 （100×）

3.5各組大鼠BALF中MUC5AC含量比較見表3。與空白組比較，模型組BALF中的MUC5AC顯著升高；與模型組比較，痰熱清組BALF中的MUC5AC顯著下降；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3　各組大鼠BALF中MUC5AC含量比較（x±s）

3.6各組大鼠肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量比較見表4。與空白組比較，模型組肺組織勻漿中的炎癥因子IL-8、TNF-α均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，痰熱清組的TNF-α下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；IL-8無顯著變化。

表4　各組大鼠肺組織勻漿中IL-8、TNF-α含量比較（x±s）

4　討論

COPD是呼吸系統(tǒng)最常見的慢性氣道炎癥性疾病，以持續(xù)氣流受限為特征，與氣道和肺對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。吸煙和感染是引起COPD發(fā)生的重要因素，本研究采用煙熏加氣管內(nèi)滴注LPS的方法建立COPD大鼠模型。從大鼠的一般情況及病理情況看，模型組氣道和肺實(shí)質(zhì)的炎癥比較嚴(yán)重，且出現(xiàn)肺氣腫，肺功能檢測顯示模型組TLC和氣道阻力明顯升高，F(xiàn)EV0.1/FVC顯著下降，說明煙熏加氣管內(nèi)滴注LPS成功復(fù)制COPD大鼠模型。

慢性氣道炎癥和氣道黏液高分泌是COPD的主要病理基礎(chǔ)，在急性期氣道黏液分泌量增加，且其黏度也增加，加重氣道堵塞，從而加重喘息及咳嗽癥狀，并且細(xì)菌容易在局部造成感染，而感染又加重黏液高分泌，從而形成惡性循環(huán)。其中MUC5AC是慢性氣道炎癥性疾病病理性增加的主要黏蛋白（MUC）表型［3］。在對COPD患者氣道MUC分子表型的研究中發(fā)現(xiàn)，COPD緩解期MUC2 mRNA表達(dá)水平明顯增加，MUC5AC表達(dá)水平因小氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量的明顯增加而有所升高；在COPD急性發(fā)作期MUC5AC mRNA表達(dá)水平顯著增高，而MUC2 mRNA變化不明顯，因而認(rèn)為在COPD急性發(fā)作期由杯狀細(xì)胞分泌為主的MUC5AC過度表達(dá)具有特殊的病理意義［4］。

IL-8、TNF-α己經(jīng)被國內(nèi)外研究證實(shí)是參與COPD氣道炎癥的重要炎癥因子，它們均可刺激氣道上皮細(xì)胞合成MUC。大量的研究發(fā)現(xiàn)IL-8在慢性呼吸道炎癥中起著關(guān)鍵性作用，它可以激活中性粒細(xì)胞多方面的功能，包括外形的改變、溶酶體酶的釋放、超氧化物的產(chǎn)生和增加、黏附分子的表達(dá)［5］。TNF-α是慢性氣道炎癥中的重要前炎性介質(zhì)，已有研究證明在TNF-α的刺激下，呼吸道上皮表達(dá)IL-8，最終反復(fù)引起呼吸道慢性炎癥和肺組織損傷［6］。TNF-α可引起中性粒細(xì)胞在氣道聚集，從而參與中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)黏蛋白合成，以濃度依賴關(guān)系刺激MUC5AC分泌。

痰熱清注射液是由熊膽粉、山羊角、金銀花、黃芩、連翹組成，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)它具有清熱、解毒、化痰、鎮(zhèn)驚、抑菌、止咳化痰等功效［7］，在抑制炎癥、抗病毒、增強(qiáng)免疫等方面具有明顯的療效。彭桂蘭采用痰熱清治療慢性支氣管炎急性發(fā)作患者60例，治療組在控制咳嗽、咯痰等癥狀方面較對照組療效顯著，總有效率治療組（88.3%）明顯優(yōu)于對照組（64.58%），可以迅速縮短病程，提高臨床治愈率［8］。龔國良和李欣證明痰熱清注射液可有效調(diào)節(jié)COPD氣道炎癥過程中的細(xì)胞因子IL-10、TNF-α、MPO的釋放，臨床使用安全，無明顯的不良反應(yīng)［9］。

本研究運(yùn)用痰熱清注射液腹腔注射干預(yù)COPD模型大鼠，肺組織病理結(jié)果提示大鼠氣管、支氣管黏膜上皮紊亂，脫落以及杯狀細(xì)胞增生的情況較模型組有所減少，腺體增生及血管壁增厚情況有所減輕，肺組織勻漿中TNF-α含量、BALF中MUC5AC的含量較模型組大鼠明顯下降，提示痰熱清注射液可以通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)黏蛋白分泌，從而減輕氣道炎癥，改善氣道黏液高分泌癥狀，在一定程度上減輕和改善COPD大鼠肺部的氣道重塑，起到延緩肺功能惡化的作用。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Tanreqing Injection on Inflammatory Factor and Airway Mucus Hypersecretion in COPD Rats

LIN Guankang，HUANG Donghui，CAI Lingfeng，WANG Huixian

Objective：To observe the effect of Tanreqing injection on expressions of interleukin-8（IL-8），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and mucoprotein 5AC（MUC5AC）of rats with chronic obstructive pulmonary disease（COPD），and to discuss preliminarily mechanism of Tanreqing injection intervening COPD rats airway mucus hypersecretion via inflammatory medium path.Methods：Selected 60 cases of class grade male SD rats，and divided them into the blank group，model group，Tanreqing group randomly，20 cases in each group，and established COPD rats models with lipopolysaccharide（LSP）combined with smudging.Tanreqing group received Tanreqing injection from enterocoelia，at the same time blank group and model group received equivalent normal saline from enterocoelia.Detected lung function of rats，cut lung tissue into slice and HE stained，detected levels of IL-8，TNF-α and MUC5AC in bronchoalveolar lavage fluid of lung tissue homogenate. Results：Comparing with blank group，rats body mass of model group and Tanreqing group were decreased obviously，model group's airway resistance（RI）and total lung capacity（TCL）were increased obviously，ratio of forced expiratory volume at 0.1 second and forced vital capacity（FEV 0.1/FVC）were decreased obviously，levels of MUC5AC in bronchoalveolar lavage fluid and inflammatory factor IL-8 and TNF-α in lung tissue homogenate were increased obviously in model group（P＜0.01）. There was no obvious change on lung dynamic compliance（Cdyn）.Comparing with model group，rats body mass of Tanreqinggroup was increased，RI and TLC decreased，F(xiàn)EV0.1/FVC increased，levels of MUC5AC and TNF-α decreased obviously，differences being significant（P＜0.01）.There were no obvious changes on IL-8 and Cdyn.Conclusions：Tanreqing injection can relieve airway inflammation by restraining release of inflammatory mediator and adjusting MUC5AC secretion，then improve airway mucus hypersecretion symptom and delay lung function deterioration to some extent.

Chronic obstructive pulmonary disease（COPD）；Tanreqing injection；Airway mucus hypersecretion；Lung function；Mucoprotein 5AC（MUC5AC）；Interleukin-8（IL-8）；Tumor necrosis factor-α（TNF-α）；Animal experiment

R285.5

A

0256-7415（2016）10-0224-04

2016-04-28

廣東省科技計劃項(xiàng)目（粵科函規(guī)財字［2014］807號）

林觀康（1988-），女，住院醫(yī)師，研究方向：呼吸內(nèi)科。

黃東暉，E-mail：13600001163@139.com。