林偉東

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑對(duì)CHD患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響

林偉東①

目的：探討可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑（sEHi）tAUCB對(duì)冠心病（CHD）患者內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）功能產(chǎn)生的影響。方法：隨機(jī)選取2013年7月-2014年12月于本院心內(nèi)科住院治療的38例CHD患者作為觀察組，另?yè)裢诮】刁w檢的38例健康者作為對(duì)照組。分析新型sEHi tAUCB對(duì)兩組EPCs功能和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)等產(chǎn)生的影響。結(jié)果：觀察組EPCs遷移和血管生成能力均明顯低于對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，tAUCB呈濃度依賴性增加，CHD患者EPCs遷移和血管生成能力對(duì)其EPCs表達(dá)VEGF具有促進(jìn)作用。結(jié)論：sEHi對(duì)CHD患者的EPCs功能具有良好的調(diào)節(jié)作用。

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑； CHD； 內(nèi)皮祖細(xì)胞

First-author's address：Longhua New District Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518000，China

內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在干細(xì)胞治療心肌梗死過程中發(fā)揮著重要作用［1］，可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑（Soluble epoxide hydrolase inhibitor sEHi）為目前臨床中普遍應(yīng)用于心血管疾病治療的一類藥物，其通過作用于可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH），進(jìn)而阻止sEH環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）降解為二羥基化合物（DHEH）［2-3］。本次研究旨在探討sEHi對(duì)CHD患者EPCs功能產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2013年7月-2014年12月于本院心內(nèi)科住院治療的38例CHD患者作為觀察組，其中男20例，女18例；年齡50～69歲，平均（57.9±2.6）歲。所有入選患者臨床上均明確存在心肌缺血表現(xiàn)，同時(shí)經(jīng)冠脈造影均已經(jīng)確診為CHD患者。排除嚴(yán)重創(chuàng)傷或接受重大手術(shù)者、半年內(nèi)發(fā)生腦血管意外者、甲狀腺機(jī)能減退者、腎病綜合征者、孕婦及哺乳期婦女、存在自身免疫性疾病者、存在急慢性肝膽疾病者、惡性腫瘤者、瓣膜性心臟病者、結(jié)締組織病者、心功能Ⅳ級(jí)者、過敏體質(zhì)及精神病患者。另?yè)裢诮】刁w檢的38例健康者作為對(duì)照組，其中21例，女17例；年齡50～68歲，平均（58.1±1.8）歲。兩組性別和年齡方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)試劑 胎牛血清為Gibco公司生產(chǎn)，VEGF為美國(guó)Peprotech公司生產(chǎn)，EGM-2培養(yǎng)液為美國(guó)Clonetics公司研發(fā)，淋巴細(xì)胞分離液為中國(guó)科學(xué)院血液研究所研發(fā)。人纖維粘連蛋白、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素均為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。Di標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍诪槊绹?guó)Moiecular Probe公司生產(chǎn)，Matrigel-Matrix為美國(guó)BD biosciences公司生產(chǎn)，VEGF抗體、GAPDH抗體均為英國(guó)Abcam研發(fā)。

1.2.2EPCs分離及培養(yǎng) 清晨于無(wú)菌條件下抽取兩組研究對(duì)象空腹肘靜脈血，抽取量均為30 mL作為樣本。將血液樣本放入含有200 μL肝素的50 mL無(wú)菌離心管中，然后將等體積的PBS液加入離心管，并進(jìn)行混勻搖動(dòng)。沿著管壁緩慢地將已經(jīng)過稀釋的抗凝血加入盛有淋巴細(xì)胞分離液的無(wú)菌離心管（15 mL）中，淋巴細(xì)胞分離液與抗凝血的比例控制為1∶2。完成離心操作后，將乳白色單個(gè)核細(xì)胞層吸出，將其放入新的無(wú)菌離心管（15 mL）中，然后將等量的PBS液加入離心管中，并進(jìn)行充分混勻［4-5］。進(jìn)行離心操作之后將洗滌液去凈，然后將4 mL的EGM-2完全培養(yǎng)基加入離心管中，同時(shí)進(jìn)行充分混勻。EGM-2完全培養(yǎng)基中含有濃度為20%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素，100 U/mL的鏈霉素［6-7］。將等量的細(xì)胞移入已包被人纖維粘連蛋白的6孔板中，然后放置于37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第4、6天分別進(jìn)行半量換液。

1.2.3EPCs雙染色鑒定 使用PBS液將非貼壁細(xì)胞清洗掉，將2.4 mg/L Dil-acLDL貼壁細(xì)胞放置于37 ℃環(huán)境中進(jìn)行1 h的孵育之后，對(duì)EPCs對(duì)Dil-acLDL的攝取情況進(jìn)行檢測(cè)［7］。使用濃度為2%的多聚甲醛迪歐細(xì)胞進(jìn)行10 min的固定，然后使用PBS液進(jìn)行洗滌。完成洗滌之后在標(biāo)本中加入10 mg/L的FITC-UEA-I，并將標(biāo)本放置在37 ℃環(huán)境中進(jìn)行1 h的孵育。使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)FITC-UEA-I、Dil-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為處于正在分化狀態(tài)的EPCs進(jìn)行鑒定。

1.2.4EPCs的流式細(xì)胞儀鑒定 PBS液將非貼壁細(xì)胞洗掉之后，使用濃度為0.125%的胰酶進(jìn)行5 min的消化之后將細(xì)胞進(jìn)行收集。實(shí)施1000 r/min的離心操作之后使用PBS液對(duì)待測(cè)細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整為2×108萬(wàn)個(gè)/mL。分別將10 mL的FITC標(biāo)記CD31、抗CD34抗體加入，然后進(jìn)行30 min的避光反應(yīng)。使用冷的PBS液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，將未結(jié)合的相關(guān)抗體全部去除，然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。

1.2.5EPCs藥物處理 實(shí)施時(shí)間為7 d的EPCs培養(yǎng)之后，更換培養(yǎng)液濃度為1%的胎牛血清EGM-2進(jìn)行24 h的培養(yǎng)，然后分別與0、10-6、10-5、10-4mol/L的sEHi tAUCB作用，作用時(shí)間為24 h。同時(shí)取對(duì)照組研究對(duì)象的EPCs進(jìn)行上述處理作為對(duì)照，該組標(biāo)本不加入任何藥物進(jìn)行干預(yù)。

1.2.6EPCs遷移檢測(cè) 使用含有0.02% EDTA的胰蛋白酶（0.25%）對(duì)各組經(jīng)過處理之后的細(xì)胞進(jìn)行消化，再用沒有添加生長(zhǎng)因子的EGM-2對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整為1×105/400 μL［8-9］。將細(xì)胞添加到趨化性實(shí)驗(yàn)裝置中的上層，裝置中的Transwell小室濾膜是孔徑為8 μm的聚碳酸脂微孔濾膜。將含有0、10-6、10-5、10-4mol/L的tAUCB培養(yǎng)液添加到下層，進(jìn)行時(shí)間為24 h的孵育之后，使用細(xì)胞刷將存在于濾膜上層的未遷移細(xì)胞全部刮除，分別使用戊二醛（2.5%）和甲醇（100%）進(jìn)行固定，實(shí)施HE復(fù)染，使用200倍顯微鏡隨機(jī)對(duì)10個(gè)視野進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)EPCs遷移細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)定［10-11］。

1.2.7EPCs體外血管形成能力檢測(cè)及Westem印跡 對(duì)Matrigel進(jìn)行1∶2的稀釋后，將其平鋪于24孔板上，放置于37 ℃的培養(yǎng)箱進(jìn)行1 h的培養(yǎng)，使得Matrigel充分聚合。取EPCs（1×104個(gè)）接種到Matrigel板，分別將含0、10-6、10-5、10-4mol/L的tAUCB培養(yǎng)液加入，進(jìn)行24 h的孵育之后，倒置于顯微鏡對(duì)新生血管的生成情況進(jìn)行觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EPCs鑒定結(jié)果 EPCs形態(tài)：通過分離操作所得的外周血單個(gè)核細(xì)胞處于培養(yǎng)的第3～4天時(shí)，可以觀察到部分貼壁細(xì)胞呈不規(guī)則三角形或者梭形，梭形細(xì)胞的數(shù)量不斷增加。在培養(yǎng)的第7～8天時(shí)，出現(xiàn)諸多個(gè)集落，貼壁的梭形細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)邊緣出芽并不斷生長(zhǎng)，表現(xiàn)為放射狀分布。該種細(xì)胞中央呈圓形，周邊為放射狀梭形細(xì)胞結(jié)構(gòu)為典型集落。培養(yǎng)至14 d時(shí)，細(xì)胞緊密融合生長(zhǎng)，表現(xiàn)為“鋪路石”樣形態(tài)特征。使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)EPCs結(jié)果進(jìn)行初步鑒定，細(xì)胞可攝取Dil-acLDL，同時(shí)可與FITC-UEA-1相互結(jié)合。其中，雙染陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是處于正在分化狀態(tài)的EPCs。使用流式細(xì)胞儀對(duì)接受7 d培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，表達(dá)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)記CD34+、CD31+的陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（53.58±5.64）%和（40.45±6.58）%。

2.2tAUCB對(duì)EPCs遷移活性和體外血管形成能力產(chǎn)生的影響 觀察組EPCs遷移活性明顯低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與接受處理前（0 mol/L）相比較，10-6、10-5、10-4mol/L濃度的tAUCB EPCs遷移活性隨tAUCB濃度增加而不斷增加，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組EPCs體外血管形成長(zhǎng)度明顯低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與接受處理前（0 mol/L）相比較，10-6、10-5、10-4mol/L濃度的tAUCB作用新生血管形成長(zhǎng)度隨tAUCB濃度增加而不斷增加，新生血管形成長(zhǎng)度均表現(xiàn)為濃度依賴性，見表1。

表1　 tAUCB對(duì)EPCs遷移活性和體外血管形成能力產(chǎn)生的影響（±s）

表1　 tAUCB對(duì)EPCs遷移活性和體外血管形成能力產(chǎn)生的影響（±s）

新生血管形成長(zhǎng)度（mm/高倍視野）組別tAUCB濃度遷移功能（個(gè)/200視野）觀察組（n=38）0 50.21±3.64 8.68±0.11 10-6mol/L 81.25±6.5415.46±1.25 10-5mol/L 138.57±16.5446.58±3.67 10-4mol/L218.24±6.3553.64±4.61對(duì)照組（n=38） 90.32±1.3621.59±1.63

2.3CHD患者tAUCB對(duì)其EPCs表達(dá)VEGF產(chǎn)生的作用 處理前觀察組EPCs VEGF表達(dá)為0，處理后tAUCB 濃度為10-6mol/L時(shí)，患者EPCs VEGF表達(dá)為1.43 mol/L；tAUCB 濃度為10-5mol/L時(shí)，EPCs VEGF表達(dá)為1.49 mol/L；tAUCB濃度為10-4mol/L時(shí)，EPCs VEGF表達(dá)為1.52 mol/L，與處理前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），tAUCB對(duì)其EPCs表達(dá)VEGF呈濃度依賴性增強(qiáng)，提示CHD患者tAUCB對(duì)其EPCs表達(dá)VEGF表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

3 討論

EPCs為一類血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，其直接參與到胚胎時(shí)期的血管發(fā)生和出生之后的血管新生［13］。因?yàn)镋PCs存在轉(zhuǎn)化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)血管生成的能力，其目前已經(jīng)成為對(duì)缺血性疾病進(jìn)行研究的一種不可或缺的靶細(xì)胞。冠心?。–HD）實(shí)質(zhì)上為一種缺血性疾病，因此，在臨床上治療CHD的關(guān)鍵及根本在于促進(jìn)新生血管形成，實(shí)現(xiàn)血運(yùn)重建［14］。

EPCs作為一類可循環(huán)、可增殖、存在多重分化功能的前體細(xì)胞，其成為治療CHD的重要研究?jī)?nèi)容。李振等［15］研究結(jié)果顯示，EPCs可通過分化和遷移等方式直接參與到缺血組織損傷修復(fù)及新生血管重建中。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）為目前已知的一種具有最強(qiáng)促血管生長(zhǎng)功能的因子，其高度特異性地對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生作用，對(duì)其遷移、分化及增殖產(chǎn)生良好的誘導(dǎo)作用，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成［13］。所以通過增加VEGF水平促進(jìn)血循環(huán)中的EPCs活性得到有效增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)血管新生，進(jìn)而促進(jìn)缺血心肌血液灌注得到有效改善［16］。本次研究結(jié)果顯示，與健康者比較，CHD患者EPCs的VEGF表達(dá)明顯下降，而應(yīng)用tAUCB之后，CHD患者EPCs的VEGF表達(dá)又表現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)，且該作用表現(xiàn)為濃度依賴性。同時(shí)本次研究還發(fā)現(xiàn)，CHD患者EPCs遷移活性和血管生成能力亦有明顯增加，其增加速度與tAUCB也表現(xiàn)為量效關(guān)系。由此可見，sEHi制劑tAUCB對(duì)CHD患者的EPCs功能存在正向調(diào)節(jié)作用，該種作用對(duì)血管新生產(chǎn)生良好的促進(jìn)作用，故其在促進(jìn)心肌缺血缺氧狀態(tài)改善上發(fā)揮著重要作用［17］。sEH環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）為一類具有較強(qiáng)生物活性的內(nèi)生性脂質(zhì)環(huán)氧化合物，但是EETs在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較短，經(jīng)過可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）迅速催化后其失活便被降解?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶抑制劑（sEHi）通過對(duì)sEH產(chǎn)生抑制作用而促進(jìn)EETs效用得到明顯增強(qiáng)。白潔等［18］的臨床研究結(jié)果顯示，EETs對(duì)VEGF介導(dǎo)的血管生成作用具有良好的促進(jìn)作用，所以可以推斷，sEHi-EETs-VEGF為sEHi對(duì)EPCs功能進(jìn)行正向調(diào)節(jié)的一個(gè)重要通路。EPCs為血管病變細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)的一種種子細(xì)胞，使用EPCs對(duì)相關(guān)心血管疾病進(jìn)行治療的方式為一種新型治療策略。在對(duì)新型藥物進(jìn)行開發(fā)的過程中，應(yīng)使藥物具備對(duì)EPCs特性進(jìn)行調(diào)節(jié)的功能，只有這樣才能更好地實(shí)現(xiàn)治療效果的提高［19］。在本次研究中，對(duì)38例CHD患者應(yīng)用新型sEHi制劑tAUCB之后，患者EPCs的VEGF表達(dá)得到有效促進(jìn)。這個(gè)研究結(jié)果為CHD防治藥物的研制提供了一條新思路，對(duì)CHD防治效果的提高具有重要價(jià)值。

綜上所述，對(duì)CHD患者應(yīng)用sEHi可對(duì)患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而促進(jìn)患者臨床癥狀及體征得到更好改善。sEHi制劑tAUCB可能成為治療CHD的一種新型藥物。

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The Influence of Soluble Epoxide Hydrolase Inhibitor for Endothelial Progenitor Cells Function in Patients with Coronary Heart Disease

L
IN Wei-dong.//Medical Innovation of China，2016，13（28）：059-062

Objective：To study the influence of soluble epoxide hydrolase inhibitor（sEHi）tAUCB for endothelial progenitor cells（EPCs） function in patients with coronary heart disease （CHD）.Method：From July 2013 to December 2014，38 cases of CHD in our hospital department of cardiology were randomly selected as the observation group and another 38 healthy persons were selected as the control group.Effects of new sEHi tAUCB on the expression of EPCs and vascular endothelial growth factor （VEGF） in two groups were analyzed. Result：The EPCs migration and angiogenesis ability in the observation group were significantly lower than control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In addition，tAUCB showed a concentrationdependent increase，CHD patients with EPCs migration and angiogenesis in its EPCs expression of VEGF has a role in promoting.Conclusion：sEHi has an excellent regulating effect on EPCs function in patients with CHD.

Soluble epoxide hydrolase inhibitor； Coronary heart disease； Endothelial progenitor cells

①?gòu)V東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院 廣東 深圳 518000

林偉東

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.28.016

（2015-12-25） （本文編輯：李穎）