陳璇吳人照王剛龍華晴戴關(guān)海任澤明童曄玲楊鋒

（1浙江省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)實驗研究所，310007；2浙江省中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究所，310007）

油菜蜂花粉總RNA（含小RNA）大量提取及RT-qPCR檢測

陳璇1吳人照1王剛2龍華晴1戴關(guān)海1任澤明1童曄玲1楊鋒1

（1浙江省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)實驗研究所，310007；2浙江省中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究所，310007）

大量提取含小RNA的油菜蜂花粉總RNA，為研究油菜蜂花粉所含外源性miRNA在動物和人體內(nèi)發(fā)揮的生理和病理功能研究奠定基礎(chǔ)。改良苯酚-氯仿法大量提取油菜蜂花粉總RNA，Nanodrop 2000檢測濃度和質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；所得的總RNA經(jīng)過RT-qPCR擴增。提取的總RNA260/280為2.11，產(chǎn)量高于1‰。電泳條帶清晰，完整性良好。可擴增出油菜基因組中的miR-159和miR-166a，且可進行豐度差異比較。本方法能大量提取包括油菜蜂花粉在內(nèi)的植物RNA（含小RNA），為中草藥和其他植物來源天然產(chǎn)物中功能性miRNA在動物和人體內(nèi)發(fā)揮的生物學功能研究奠定基礎(chǔ)。

油菜蜂花粉；總RNA大量提??；miRNA；RT-qPCR

miRNA是一類22個核苷酸長度左右的非編碼小RNA，通過堿基互補配對的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，從而參與幾乎所有的生物學過程［1,2］，包括疾病過程［3］和營養(yǎng)調(diào)控［4］。2012年，南京大學張辰宇教授團隊報道了一個有趣的現(xiàn)象，來自飲食的植物miRNA能跨界調(diào)控人類和其他哺乳動物的基因表達［5］。這項研究一經(jīng)公布就受到生物學和生命科學領(lǐng)域研究人員的廣泛重視，開始重復及拓展這一研究領(lǐng)域。這一領(lǐng)域的研究剛剛起步，而這類研究的開展，需要大量提取含有miRNA的植物總RNA，用于臨床實驗或動物實驗，然而利用試劑盒從植物中大量提取含有miRNA的植物總RNA價格非常昂貴。

油菜蜂花粉是油菜花的雄性配子體，富含RNA（4‰）［6］，被廣泛應(yīng)用在食品、保健品和藥品中，體內(nèi)外試驗證明花粉具有防治前列腺疾病、抗氧化、抗炎等功能［7-10］。本文以油菜蜂花粉為例，介紹一種從植物中大量提取含小RNA的總RNA方法，該方法基于苯酚-氯仿提取法［11］，并做了一些改進。

1　儀器與材料

1.1儀器

DL-6000B型冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；Centrifuge 5810R離心機（Eppendorf）；BSA124S電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；TD12001B電子分析天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；SYNERGY UV超純水儀（德國Millipore公司）；DK-600S型三用恒溫水箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；basic 1磁力攪拌機（德國IKA公司）；分液漏斗；pH儀；研缽；容量瓶。

1.2材料

油菜蜂花粉，由安徽農(nóng)業(yè)大學蜂業(yè)研究所提供，執(zhí)行標準GB/T11758-89-蜂花粉，單一花粉率≥95%。

2　方法與結(jié)果

2.1試劑配制

2.1.1研磨緩沖液：0.18 M Tris；0.09 M LiCl；4.5 mM EDTA；1%SDS；用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2后定容。

2.1.2TLE溶液：0.2 M Tris；0.1 M LiCl；5 mM EDTA；用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2后定容。

2.1.3平衡苯酚：苯酚需要現(xiàn)平衡現(xiàn)用。先將苯酚預熱至68℃，然后混合等體積的苯酚和TLE溶液，加入總體積1‰體積的15M NaOH，用磁力攪拌器混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜止分層后收集下層有機相，然后用等體積的TLE溶液再抽提兩次。

2.2RNA提取

所有器皿和溶液按照《分子克隆》說明進行處理，另外，預冷研缽和研棒，提取步驟如下：①稱取15 g油菜蜂花粉，研磨成粉后迅速轉(zhuǎn)移至含有150 ml研磨緩沖液和50 ml TLE溶液平衡過的苯酚的燒杯中。②磁力攪拌器中速勻漿2 min后，加50 ml氯仿，磁力攪拌器混勻。③50℃溫浴20 min。④離心，20 min，5000 rpm，4℃，然后轉(zhuǎn)移上清于一新的離心瓶。加入50 ml TLE平衡過的苯酚，震蕩混勻，然后加入50 ml氯仿，磁力攪拌器混勻。⑤轉(zhuǎn)移剩余上清、中間層和下層于50 ml離心管，離心20 min，4000 rpm，4℃。轉(zhuǎn)移上清合并到上一步驟中收集到的液體中。⑥離心15 min，5000 rpm，4℃，轉(zhuǎn)移上清液于一新的離心瓶，加入50 ml TLE溶液平衡過的苯酚，磁力攪拌器混勻，然后加50 ml氯仿，磁力攪拌器混勻。抽提3次，直至中間層消失。⑦最后用氯仿抽提一次，離心后取上層水相，加入2倍體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜。⑧離心，30 min，5000 rpm，4℃，棄上清液。⑨75%乙醇漂洗沉淀2次，超凈臺中揮干酒精。⑩加入60 ml DEPC水。進行質(zhì)量檢測和電泳后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3Nanodrop純度和完整性檢測

2.3.1Nanodrop質(zhì)量檢測：取1 μl RNA溶液，用Nanodrop 2000進行純度檢測，結(jié)果OD260和OD280的比值為2.1，說明本實驗獲得了高質(zhì)量的RNA。

2.3.2瓊脂糖凝膠電泳：對RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，28sRNA的亮度約為18sRNA的兩倍，說明RNA無降解，完整性好。

圖1　油菜蜂花粉總RNA（1 μg）1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4RT-qPCR檢測miRNA

本實驗采用兩步法RT-qPCR。反轉(zhuǎn)錄利用Taq－ManmiRNA Reverse Transcription ki（tApplied Biosystems），15 μl體系含有80 ng的總RNA，3 μl的Taq－Man miRNA頸環(huán)引物（Applied Biosystems），按照試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為PCR的模板。采用TaqManUniversal Master Mix II試劑在8聯(lián)管中進行（TaKaRa），每個樣品3個重復，10 μl的反應(yīng)體系包含Taqman探針0.5 μl、Master mix 5 μl和模板4.5 μl，設(shè)一個水為模板的反應(yīng)作為陰性對照，一個水作為空白對照，由于比較的兩個micrRNA來自同一個樣本，故未設(shè)內(nèi)參基因，定量PCR在Applied Biosystems StepOnePlus熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）上進行。結(jié)果如圖2所示，miR-159和miR-166a均得到了有效擴增，miR-166a（CT值：23.8±0.23）的豐度約為miR-159（CT值：31.22±0.33）的170倍。

3　討論

傳統(tǒng)觀點認為，miRNA僅僅作為內(nèi)源性miRNA在產(chǎn)生它們的個體內(nèi)調(diào)控基因的表達。實際上，研究發(fā)現(xiàn)有些miRNA能超越個體之間的界限，作為外源性miRNA被輸送到其他個體并調(diào)控后者的基因表達［12］，而食物含有的外源性植物miRNA能調(diào)控動物的生理和病理狀況是其中一種有趣而重要的現(xiàn)象，而且食物來源的miRNA可能和維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分一樣，有資格成為一種新的營養(yǎng)成分，并作為信息的載體調(diào)控哺乳動物基因的表達，從而維持和塑造動物的身體結(jié)構(gòu)和功能。不僅如此，功能性食品和中草藥中含有的miRNA可能發(fā)揮了重要的生理病理調(diào)控作用，有待我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

圖2　miR-159和miR-166aqPCR擴增曲線

上述研究需要大量提取含miRNA的總RNA用以開展體內(nèi)研究。用試劑盒從植物中大量提取含有miRNA的植物總RNA價格昂貴。本實驗提供一種從油菜蜂花粉中大量提取含miRNA的總RNA的方法，操作步驟簡單，獲得的RNA經(jīng)Nanodrop2000和電泳檢測證明質(zhì)量高，RT-qPCR能夠檢測到油菜蜂花粉miR-159和miR-166a的表達，且miR-166a的豐度約為miR-159的170倍。在本試驗中，花粉總RNA的提取效率略高于1‰，這一結(jié)果低于王開發(fā)報道的油菜蜂花粉總RNA含量［6］，可能是由于獲得RNA的純度提高了，得率相對有所降低。此外，大量提取油菜蜂花粉時，可能研磨不夠完全，可通過增加研磨時間和研磨力度提高總RNA得率。

本方法能用于大量提取包括油菜蜂花粉在內(nèi)的植物RNA（含小RNA），為油菜花粉所含miRNA在動物和人體內(nèi)發(fā)揮的生物學功能研究奠定基礎(chǔ)。

［1］Bartel,D.P.MicroRNAs：Genomics,biogenesis,mechanism,and function［J］.Cell,2004,116：281-297.

［2］Ambros,V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature, 2004,431：350-355.

［3］Garcia IA and Miska EA.MicroRNA functions in animal development and human disease［J］.Development,2005,132：4653-4662.

［4］Hoen ENMN,Rooij EV,Bushell M,et al.The role of microRNA in nutritional control［J］.Journal of Internal Medicine,2015,278：99-109.

［5］Zhang L,Hou D,Chen X,et al.Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1：evidence of cross-kingdom regulation by microRNA［J］.Cell Research,2011,22（1）：107-126.

［6］王開發(fā),張玉蘭,張盛隆.花粉中核酸的研究［J］.蜜蜂雜志, 1997,（7）：11-12.

［7］Pascoal A,Rodrigues S,Teixeira A,et al.Biological activities of commercial bee pollens：Antimicrobial,antimutagenic,antioxidant and anti-inflammatory［J］.Food and Chemical Toxicology,2014,63：233-239.

［8］陳璇,童曄玲,楊鋒,等.花粉治療前列腺增生及有效組分研究進展［J］.中國蜂業(yè)中旬刊（學術(shù)）,2013,64（1）：29-31.

［9］Wu YD and Lou YJ.A steroid fraction of chloroform extract from bee pollen of Brassica campestris induces apoptosis in human prostate cancer PC-3 cells［J］.Phytotherapy Research,2007,21（11）：1087-1091.

［10］Campos MG,Webby RF,Markham KR,et al.Age-induced diminution of free radical scavenging capacity in bee pollens and the contribution of constituent flavonoids［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51：742-745.

［11］John Wiley&Sons,Inc.Current Protocols in Molecular Biology［M］,1990.

［12］Sarkies P,Miska EA.Is There Social RNA［J］.Science,2013, 341（6145）：467-468.

Mass extraction of total RNA（containing small RNA）and RT-qPCR detection of rape（Brassica napus）bee pollen

Chen Xuan1，Wu Renzhao1，Wang Gang2,Long Huaqing1,Dai Guanhai1,Ren Zeming1,Tong Yeling1,Yang feng1
（1 Institute of Basic Medicine,Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China；2 Institute of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine in Cancer Research,Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China）

Total RNA that contain miRNAs were extracted from rape bee pollen,which laid a foundation to study the physiological and pathological functions of exogenous miRNAs of rape bee pollen in animals and human.Total RNA from mass rape bee pollen were extracted using a modified phenol-chloroform method,and the concentration and quality were determined by Nanodrop2000 as well as electrophoresis with 1%agarose gel.The total RNA was amplified by RT-qPCR.The ratios of A260/A280 of total RNA was 2.11,and the yield was over 1‰.The bands were clear on agarose gel and the integrity of RNA was good.Different abundance of miR-159 and miR-166a were amplified.The method can extract RNA（containing small RNA）from mass plant including rape bee pollen,which laid a foundation to study biological functions of functional miRNAs from herb and other natural products of plant origin in animals and human.

rape bee pollen；mass extraction of total RNA；miRNA；RT-qPCR

浙江省自然科學基金青年基金（LQ13C170002）；浙江省科技計劃項目科技條件建設(shè)（2013F10001）

陳璇（1984-），女，助理研究員，博士。E-mail：chenxuan001564@163.com