張芮，夏桂民，呂凱，柳珊，張俊，劉明亮

凡德他尼衍生物的設(shè)計、合成與體外抗腫瘤活性

張芮，夏桂民，呂凱，柳珊，張俊，劉明亮

目的 設(shè)計合成凡德他尼衍生物，并評價其體外抗腫瘤活性。

方法 4-（2-氟-4-溴）苯胺基喹唑啉母核化合物（由 7-芐氧基-6-甲氧基喹唑啉-4-醇合成）與含有肟基的哌啶類化合物（由N-Boc-3/4-哌啶酮合成）通過縮合反應(yīng)制備目標(biāo)物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS 和 HRMS 確證。SRB 法測定所有目標(biāo)物（30 μmol/L）對肺癌細胞 A549 的抑制率，進一步測定抑制率大于 65% 的目標(biāo)物對 4 種腫瘤細胞A549、HT29、K562、KB 的 IC50值。

結(jié)果 合成了 20 個全新結(jié)構(gòu)的凡德他尼衍生物。7 個目標(biāo)物對 A549 的抑制率大于 65%，其中化合物 15b1 和 16b2對 A549 的 IC50分別為 1.94 和 0.26 μmol/L，化合物15b2 對口腔表皮癌細胞 KB 的 IC50為 4.83 μmol/L，優(yōu)于或相當(dāng)于凡德他尼。

結(jié)論 豐富了凡德他尼 7-位取代基的結(jié)構(gòu)類型，目標(biāo)物16b2 對 A549 的活性是凡德他尼的 6 倍以上，值得進一步研究。

化學(xué)技術(shù)，合成； 抗代謝藥，抗腫瘤； 凡德他尼衍生物

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(5):432-436

癌癥是僅次于心血管疾病的人類死亡的第二大原因［1］。作為一類重要的靶向抗腫瘤藥物，小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑（TKI）目前已廣泛應(yīng)用于臨床。其中 4-氨基喹唑啉類化合物令人關(guān)注，已有多個藥物被美國 FDA 批準(zhǔn)上市，更多的候選物則處于臨床或臨床前研究［2-7］。

4-氨基喹唑啉骨架的結(jié)構(gòu)改造主要集中在4 位和 7 位，并取得了很大進展［5］。凡德他尼（vandetanib，圖 1）、吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼等均是通過對這兩個位置改造而獲得的優(yōu)秀抗腫瘤藥物［8-10］。近年研究發(fā)現(xiàn)， 向母核 7 位引入堿性基團有利于這類化合物的理化性質(zhì)、藥代動力學(xué)性質(zhì)、選擇性及活性。其中 7 位含有 N-甲基哌啶片段的凡德他尼是第一個被 FDA 批準(zhǔn)（2011 年）上市的用于治療甲狀腺髓樣癌（MTC）的 TKI，其對其他實體瘤的研究目前正處于 I ～ III期臨床階段。

圖1 4-氨基喹唑啉骨架和凡德他尼的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of vandetanib

甲肟基是第三、四代頭孢菌素結(jié)構(gòu)中的常見基團，將其引入喹諾酮 7 位堿性含氮雜環(huán)片段中可明顯改善藥代動力學(xué)性質(zhì)和（或）生物活性（如吉米沙星，IMB-070593）［11-12］。借鑒這一成功的設(shè)計策略，作者擬向凡德他尼的哌啶環(huán)片段中引入肟基，同時改變哌啶環(huán)與氧原子之間的碳鏈長度，設(shè)計合成了一系列凡德他尼衍生物，并對其活性進行初步評價，以期獲得抗腫瘤活性更強的化合物，為進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 梅特勒 MP-70 熔點儀為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；Advion Mass Express 2.1.243 和 Micromass Autospec Ultima-Tof 型質(zhì)譜儀分別為美國 Advion 公司和美國Waters公司產(chǎn)品；Mercury-400 MHz 和 Inova-500 MHz 型核磁共振儀為美國 Varian 公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 色譜用薄層層析硅膠 H 為青島海洋化工廠產(chǎn)品；其他試劑和溶劑均為市售化學(xué)純或分析純，根據(jù)需要經(jīng)無水干燥處理后使用。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)合成 N-Boc-4-哌啶酮（1）和N-Boc-3-哌啶酮（2）依次經(jīng)與甲/乙/芐氧胺或羥胺肟化和脫保護基（Boc）分別得 4-肟基哌啶（3a-d）和 3-肟基哌啶（4a-d）［13］。原料 1 分別經(jīng) PhI（OAc）2氧化及水解得 5，水解產(chǎn)物 5 與甲/乙/芐氧胺肟化得 6a-c，再磺?；眉谆撬狨ィ?a-c）［14-15］（圖 2）。

國內(nèi)有商品供應(yīng)的 7-芐氧基-6-甲氧基喹唑啉-4-醇（8）與氯化亞砜反應(yīng)得 9，進一步和 2-氟-4-溴苯胺反應(yīng)得 10，再氫化脫芐基得 4-（2-氟-4-溴）苯胺基喹唑啉（11）。關(guān)鍵中間體 11 與 1-氯-2-溴乙烷或 1-氯-3-溴丙烷發(fā)生親核取代反應(yīng)得 12 和13 后與 3a-d 和 4a-d 縮合分別得目標(biāo)物 15a-d和 16a-d。11 與羥基活化的 7a-c 縮合得 14a-c 后脫 Boc 即得目標(biāo)物 17a1-c1。其中 17a1、b1 經(jīng)埃施魏勒-克拉克反應(yīng)（Eschweiler-Clarke reaction）得相應(yīng)的甲基化目標(biāo)物 17a2、b2（圖 3）［8］。

圖2 哌啶類化合物 3（4）a-d 和 7a-c 的合成Figure 2 Synthesis of piperidines 3（4）a-d and 7a-c

圖3 目標(biāo)化合物 15 ～ 17 的合成Figure 3 Synthesis of target compounds 15 - 17

1.2.2 SRB 法測定體外抗腫瘤活性 取腫瘤細胞至 96 孔板中，使每孔中的細胞數(shù)在 4000 ～ 8000之間，置 37 ℃，5% CO2中培養(yǎng) 24 h。加入 5 個濃度梯度的目標(biāo)化合物，設(shè)立 3 ～ 4 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，貼壁細胞經(jīng) 4 ℃ 預(yù)冷的 50% 三氯乙酸（TCA）固定，96 孔板置于 4 ℃ 冰箱放置 1 h，用蒸餾水洗滌細胞孔 5 次。待細胞板晾干后，用0.4% 的磺酰羅丹明 B（SRB）染色 15 ～ 30 h，1%的乙酸洗滌 5 次，晾干。加入 10 mmol/L Tris 溶液 150 μl 溶解，低速振蕩 5 ～ 10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長 490 nm 處測定吸收值，并根據(jù)以下公式計算抑制率。

根據(jù)藥物濃度與相應(yīng)的抑制率作圖，計算 IC50。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)化合物的合成

共合成目標(biāo)化合物 20 個，其結(jié)構(gòu)（圖 4）均經(jīng)1H-NMR 和 MS 確證，部分化合物還經(jīng)13C-NMR 和 HRMS 進一步確證。

2.2 體外抗腫瘤活性

利用 SRB 法測定目標(biāo)化合物 15 ～ 17 在30 μmol/L 濃度下對肺癌細胞 A549 的抑制率，結(jié)果見表 1。除化合物 15b2 的抑制率（98.93%）與對照藥凡德他尼基本相當(dāng)外，余者均弱于后者。

表1 目標(biāo)化合物 15 ～ 17 的結(jié)構(gòu)及對 A549 的抑制率Table 1 inhibition rate of target compounds 15 - 17

選取表 1 中對 A549 抑制率大于 65% 的目標(biāo)化合物 15a1/2、15b1/2、16a1、16b2、17c1，進一步評價其對 4 種腫瘤細胞 A549、結(jié)腸癌HT29、骨髓癌 K562 和口腔表皮癌 KB 的 IC50值。結(jié)果顯示，這 7 個化合物均有不同的體外抗腫瘤活性（表 2）。盡管這些結(jié)果大多不如預(yù)期，但化合物 15b1 和 16b2 對 A549 的活性（IC50分別為 1.94 和 0.26 μmol/L）以及化合物 15b2 對KB 的活性（IC50為 4.83 μmol/L）優(yōu)于或相當(dāng)于凡德他尼，令人關(guān)注。

3 討論

近年來，多個 TKI 相繼問世并廣泛用于臨床治療各種癌癥，但其選擇性及逐年增加的耐藥性等仍是今后該領(lǐng)域研究的重點。與其他類藥物的研究相似，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)具有全新結(jié)構(gòu)骨架和（或）作用機制的 TKI 無疑是解決上述問題的根本策略，但對已知 TKI 的結(jié)構(gòu)改造則不失為一條更加現(xiàn)實的途徑。

表2 目標(biāo)化合物的體外抗腫瘤活性Table 2 In vitro activity of selected compounds against 4 cell lines

作者借鑒本課題組在喹諾酮類新化合物設(shè)計中的成功經(jīng)驗，將肟基引入凡德他尼 7-位哌啶環(huán)片段中，設(shè)計合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的凡德他尼衍生物。由體外活性數(shù)據(jù)可見：①目標(biāo)化合物的構(gòu)-效關(guān)系（SAR）難以總結(jié)（即使是對某 1 株細胞系）；②活性結(jié)果大多不如人意，但部分化合物對個別腫瘤細胞仍表現(xiàn)出明顯的體外活性。③凡德他尼被認為“有希望成為抗擊非小細胞肺癌的特效藥”［16］，而化合物 16b2 對 A549 的活性是凡德他尼的6 倍以上，故極有必要深入研究。為此，我們即將展開對化合物 16b2 的初步毒性研究及其對 A549的體內(nèi)活性評價，其結(jié)果值得期待。

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Objective To design and synthesize a series of novel vandetanib derivatives， and evaluate their in vitro antitumor activity.

Methods Title compounds were synthesized through the condensation of 4-（（4-bromo-2-fluorophenyl）amino）-6-methoxyquinazolines， which were prepared from 7-（benzyloxy）-6-methoxyquinazolin-4-ol， and piperidines obtained from N-Boc-3/4-piperidones. Their structures were characterized by1H-NMR，13C-NMR， MS and HRMS. In vitro antitumor activity of the title compounds were evaluated by SRB assay.

Results Twenty novel compounds were synthesized in this work. Among them， seven compounds （at 30 μmol/L） were found to have ＞ 65% inhibition against A549 cell line. Compounds 15b1 （IC50： 1.94 μmol/L） and 16b2 （IC50： 0.26 μmol/L） against A549 cells and compound 15b2 （IC50： 4.83 μmol/L） against KB cells were more active than or comparable to vandetanib.

Conclusion The structure skeletons at C-7 position of vandetanib were enriched. Compound 16b2 with much higher activity than vandetanib against A549 cells is worthy of further research.

Author Affiliations： Department of Medicinal Chemistry， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （ZHANG Rui， XIA Gui-min， Lü Kai， LIU Shan， ZHANG Jun，LIU Ming-liang）； Zhejiang Starry Pharmaceutical Co. Ltd.， Xianju 317300， China （ZHANG Jun）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):432-436

Design， synthesis and in vitro antitumor activity of vandetanib derivatives

ZHANG Rui， XIA Gui-min， Lü Kai， LIU Shan， ZHANG Jun， LIU Ming-liang

Chemistry techniques， synthetic； Antimetabolites， antineoplastic； Vandetanib derivatives

LIU Ming-liang， Email： lmllyx@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.008

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所有機化學(xué)室（張芮、夏桂民、呂凱、柳珊、張俊、劉明亮）；317300 仙居，浙江司太立制藥股份有限公司（張?。?/p>

劉明亮，Email：lmllyx@126.com

2016-04-29