紀(jì)秀軍　閆丙健　趙彩玲

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·論著·

D-半乳糖誘導(dǎo)性亞急性衰老大鼠模型皮膚膠原代謝及相關(guān)通路分子的表達

紀(jì)秀軍1閆丙健2趙彩玲2

目的：明確D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老大鼠皮膚膠原代謝及TGFβ1/smads通道分子的表達。方法：20只大鼠隨機分為對照組和衰老組，衰老組大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg·d，連續(xù)6周，對照組以同樣的方法注射相同劑量的無菌生理鹽水?；铙w皮膚共聚焦顯微鏡觀察兩組大鼠皮膚膠原纖維密度的變化。RT-PCR檢測TGFβ1、Smad3、 I 型前膠原蛋白、III型前膠原蛋白及脂質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1的mRNA水平。結(jié)果：衰老組大鼠皮膚膠原纖維密度及TGFβ1、Smad3、I型前膠原蛋白、脂質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 mRNA均低于正常對照組(P<0.05)；脂質(zhì)金屬蛋白酶-1 mRNA表達量高于對照組(P<0.05)；III型前膠原蛋白mRNA表達量在兩組間沒有差異。結(jié)論：D-半乳糖可通過下調(diào)TGFβ1/Smads通路分子的表達量抑制I型前膠原蛋白合成，并通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)金屬蛋白酶-1/脂質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1促進膠原蛋白降解，使皮膚出現(xiàn)亞急性衰老效應(yīng)。

D-半乳糖；大鼠衰老模型；膠原代謝；TGFβ1/smads通路

D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老大鼠模型作為一種簡便、易行、經(jīng)濟的動物模型制作方法，已被廣泛用于器官衰老研究和藥物試驗[1]。但是其誘導(dǎo)皮膚衰老的機制目前僅在自由基方面予以探究，而其對膠原蛋白代謝狀況及機制尚未明確[2,3]。本實驗通過檢測試驗大鼠皮膚組織學(xué)變化和基因水平來探究D-半乳

糖誘導(dǎo)亞急性大鼠衰老模型皮膚組織膠原代謝狀況的變化及其可能病理機制，為皮下注射D-半乳糖作為一種誘導(dǎo)大鼠皮膚衰老的方法在膠原代謝方面提供一定的依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要實驗儀器及試劑D-半乳糖；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增試劑盒；其余試劑均為市售分析純；實驗儀器：共聚焦顯微鏡(康奧微維TMvivascop1500，上?？祳W實業(yè)發(fā)展有限公司,)；超聲細(xì)胞粉碎儀(美國biotek公司)；離心機(德國eppendorf公司)；電子天平(中國賽飛公司)；熒光定量PCR儀(roche公司)。

1.2實驗動物和方法

1.2.1實驗動物本實驗所選用大鼠均為健康雄性8周齡、體重(220±20)g、 Wistar大鼠20只 ,由青島市藥物研究中心提供。所有試驗均按照動物學(xué)倫理道德標(biāo)準(zhǔn)進行。

1.2.2實驗分組20只大鼠在經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為A組(衰老組)和B組(正常對照組)，每組10只。

1.2.3動物模型建立將固體D-半乳糖溶解于無菌生理鹽水中制作1%濃度的D-半乳糖溶液，A組頸背部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg·d,連續(xù)給藥42 d，制作成大鼠衰老模型[3]。B組大鼠采取同樣的方法注射同等劑量的生理鹽水。

1.3實驗標(biāo)本及取材方法第42 d，麻醉后5%硫化鈉脫去大鼠背部皮膚毛發(fā)并處死大鼠，所有大鼠均于背部相同部位切取皮膚標(biāo)本，部分組織以10%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋切片擬作形態(tài)學(xué)觀察。其余部分立即以無菌液氮管凍存后置于-80℃冰箱待測。

1.4指標(biāo)檢測(1)分別在實驗開始第7、14、21、28、35、42 d于共聚焦顯微鏡下觀察活體大鼠背部皮膚真皮膠原纖維密度變化并留取圖片，分別對不同時間段皮膚共聚焦顯微鏡下圖片進行隨機選取并分析。(2)組織學(xué)觀察測量：HE染色后于40倍鏡下于每張HE染色切片隨機選取5個不重疊視野留取圖片，IPP圖像分析軟件觀察真皮厚度的變化，masson染色后于400倍鏡下隨機獲取5個視野，IPP圖像分析軟件進行觀察膠原纖維形態(tài)及密度變化。(3)RT-PCR檢測皮膚I型前膠原蛋白(col I)、III型前膠原蛋白(col III)、脂質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、脂質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)、TGFβ1、Smad3 mRNA表達量(各因子引物見表1)，采用2-△△CT方法分析基因表達結(jié)果。

表1　各因子引物

2　結(jié)果

2.1活體皮膚共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果通過6次測量結(jié)果可見A組大鼠皮膚膠原纖維由致密逐漸變得稀疏(圖1)；而正常對照組膠原纖維排列致密均勻，前后無明顯變化(圖2)。

2.2真皮厚度和膠原纖維面積的系統(tǒng)定量分析HE染色及masson染色可見衰老組皮膚厚度較正常對照組相比皮膚厚度及真皮厚度均減低，膠原纖維厚度變薄且皮膚膠原纖維排列疏松，膠原束細(xì)長、斷裂、排列紊亂(圖3)。Image pro plus(IPP)圖像分析軟件分別定量測量真皮厚度和膠原纖維密度，真皮厚度以IPP分析HE染色圖片真皮表皮鏈接層到皮下脂肪層的距離表示。而膠原纖維面積IPP分析masson染色圖片中膠原纖維藍染顏色所覆蓋的面積表示(藍色區(qū)域面積)。測量結(jié)果示：衰老組大鼠真皮厚度和膠原纖維面積顯著低于正常對照組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3、表2)。

表2　IPP圖像分析軟件對HE染色

2.3RT-PCR定量測量結(jié)果實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示衰老組與正常對照組大鼠相比col I、TGFβ1、smad3 mRNA表達量均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，col III基因表達量在兩組間沒有差異(P>0.05)，但是MMP-1 mRNA表達量在衰老組明顯高于正常對照組(P<0.05)(表3)。

隨D-半乳糖注射次數(shù)的增加，皮膚共聚焦纖維鏡6次檢測結(jié)果可見衰老組大鼠皮膚膠原纖維密度在第7、14、21、28、35、42 d呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。

圖1衰老組大鼠皮膚共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果

皮膚共聚焦纖維鏡檢測結(jié)果示：正常對照組大鼠皮膚膠原纖維密度在第7、14、21、28、35、42 d無明顯改變。

a、b 可見衰老組皮膚厚度較正常對照組皮膚厚度及真皮厚度均減低(HE，×40)；c、d 可見衰老組大鼠皮膚膠原纖維排列疏松，膠原束細(xì)長、斷裂、排列紊亂(masson×400)。

圖3　大鼠皮膚組織HE染色和masson染色

注：*兩組大鼠相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

3　討論

皮膚衰老模型的制作在人們研究衰老、抗衰老機制及抗藥研發(fā)過程中扮演重要角色。目前關(guān)于皮膚衰老模型的制作方法常用的主要包括模擬紫外線照射法和D-半乳糖誘導(dǎo)法。模擬紫外線照射法是利用紫外線燈模擬外源性陽光中的紫外線對皮膚損傷為原理，每次照射的波長、角度、距離不同及大鼠毛發(fā)遮擋等因素都會對實驗造成一定的誤差，且皮膚衰老是一個復(fù)雜的既有內(nèi)源性也有外源性因素造成的結(jié)果。而D-半乳糖誘導(dǎo)法具有簡單、有效、方便、快捷的優(yōu)點，且其可誘導(dǎo)包括皮膚、大腦、心、腎臟等全身各個器官衰老[1]，這個過程于人體自然衰老過程更為相近。所以從整體和平衡角度來看低劑量D-半乳糖誘導(dǎo)皮膚衰老的方法更加可靠。

低劑量D-半乳糖長時間皮下注射可導(dǎo)致機體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高。在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，形成過量的超氧陰離子自由基。自由基過量產(chǎn)生是活性氧合成增加，活性氧加成到堿基的雙鍵中破壞堿基生成嘧啶、嘌呤自由基，堿自由基相互結(jié)合或被過氧化，使堿基缺失甚至主鏈斷裂，產(chǎn)生遺傳突變[4,5]。從而嚴(yán)重影響遺傳信息的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，使膠原蛋白表達量降低甚至消失，另外衰老皮膚中膠原酶與其抑制劑代謝失調(diào)，引起膠原蛋白的異常分解。

真皮主要有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組成，而ECM的主要成分為膠原蛋白，皮膚膠原蛋白有20多種，其中I型膠原蛋白含量最高約占75%，其次為III型膠原蛋白。膠原蛋白參與皮膚的強度、彈性及穩(wěn)定性，皮膚中膠原蛋白分解、萎縮可使皮膚變薄彈性降低導(dǎo)致皺紋的出現(xiàn)[6-8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)衰老組大鼠膠原纖維密度及I型前膠原蛋白(col I)mRNA表達量及其體現(xiàn)在空間結(jié)構(gòu)上的皮膚真皮厚度、細(xì)胞層數(shù)較正常對照組相比均降低。但是III型前膠原蛋白(col III)mRNA表達量在兩組間并沒有差異。數(shù)據(jù)表明低劑量D-半乳糖皮下注射42 d可導(dǎo)致大鼠皮膚I型前膠原蛋白合成減少從而導(dǎo)致皮膚真皮變薄，最終導(dǎo)致衰老的出現(xiàn)。

研究表明：膠原蛋白的降解與合成受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。TGFβ1作為組織纖維化的調(diào)控者，通過與成纖維細(xì)胞膜I、II型受體結(jié)合依次磷酸化下游smad2、smad3、smad4信號通路，磷酸化的smad2、smad3、smad4復(fù)合體作用于細(xì)胞核相應(yīng)編碼區(qū)參與并調(diào)控成纖維細(xì)胞中的纖維化基因(ColIa1,ColIa2,ColVa2,ColVIa1, and ColVIa3、TIMP-1)發(fā)揮其生物學(xué)作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)， smad3是TGF-β1/Smads致纖維化信號傳導(dǎo)通路中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)[10,11]。本實驗發(fā)現(xiàn)衰老組大鼠皮膚組織TGF-β1、Smad3 mRNA均減少，且col I mRNA表達量在衰老組大鼠皮膚組織也減少，數(shù)據(jù)表明D-半乳糖皮下注射可在基因水平上降低TGFβ1/smad3的表達量，從而進一步減少I型膠原蛋白合成達到皮膚衰老效應(yīng)。

本實驗還檢測了皮膚MMP-1、TIMP-1 mRNA表達量。MMP-1通過裂解I型膠原蛋白末端的C位點從而啟動其降解過程[12,13]。TIMP-1可以抑制MMP-1活性，且MMP-1/TIMP-1失衡可以導(dǎo)致過多的膠原蛋白降解[14,15]。最近研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1是TGFβ1/smad3通路的下游產(chǎn)物[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖可增加MMP-1 mRNA表達量，并降低TIMP-1 mRNA的表達量，MMP-1/TIMP-1比例失衡。我們的數(shù)據(jù)表明D-半乳糖皮下注射對皮膚膠原的作用也可以通過降低TGFβ1/smad3的表達量進一步降低TIMP-1的合成并促進膠原酶合成途徑從而促進膠原蛋白的降解，達到亞急性皮膚衰老的效應(yīng)。

低劑量D-半乳糖皮下連續(xù)注射42 d可導(dǎo)致大鼠皮膚I型前膠原蛋白合成減少，降低真皮細(xì)胞層數(shù)及厚度，從而導(dǎo)致衰老的出現(xiàn)。低劑量D-半乳糖皮下注射降低I型膠原蛋白合成與負(fù)調(diào)節(jié)TGFβ1/smads通路分子表達量密切相關(guān)。 D-半乳糖誘導(dǎo)衰老機制與通過負(fù)調(diào)接TGFβ1/smads通路分子表達量使MMP-1/TIMP-1平衡失調(diào)，促進膠原蛋白降解息息相關(guān)。這為低劑量D-半乳糖皮下注射與導(dǎo)致衰老關(guān)系的進一步探討提供了思路。

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(收稿：2015-08-05修回：2015-10-09)

Expression of collagen metabolism and the related signaling pathway in skin aging rat models induced by D-Galactose

JIXiujun1,YANBingjian2,ZHAOCailing2.

1.LaiwuInstituteofDermatology,Laiwu271100,ShandongChina; 2.LaiwuPeople’sHospital,Laiwu271100,ShandongChina

Objective: To determine the expression of collagen metabolism and the related signaling pathway in skin aging rat models induced by D-Galactose. Methods: Twenty rats were randomly divided into the D-gal group and control group. Ten rats in the D-gal group were given subcutaneous injection of D-galactose, 125 mg/kg·d for 6 weeks. The rats in the control group were treated with the same volume of normal saline. The collagen density was detected by the confocal microscopy. The expression of Col I, Col III, MMP-1, TIMP-1, TGFβ1 and Smad3 mRNA was detected by RT-PCR. Results: The collagen density of rats and the level of Col I, MMP-1, TIMP-1, TGFβ1 and Smad3 mRNA were lower in the D-gal group than in the control group (P<0.05). The expression of MMP-1mRNA was higher in the D-gal group than in the control group. There was no significant difference in the level of Col III between the D-gal group and control group. Conclusion: D-Galactose inhibits the Col I synthesis through down-regulating the expression of TGFβ1/Smad3 and accelerates the degradation of collagen through regulating the balance between MMP-1 and TIMP-1, which makes the skin into subacute aging.

D-Galactose; rat skin aging model; collagen metabolism; TGFβ1/smads pathway

1山東省萊蕪市皮膚病防治所， 山東萊蕪，271100

2山東省萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪，271100