吳玉鑾，王　莉，羅海英，冼燕萍，董　浩，王　斌，韓婉清

(1.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東　廣州　511447；2.國家皮革制品質量監(jiān)督檢驗中心(廣州),廣東　廣州　511447)

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超聲萃取結合超高效液相色譜法測定皮革中10種防霉劑

吳玉鑾1,2*，王莉1,2，羅海英1,2，冼燕萍1,2，董浩1,2，王斌1,2，韓婉清1,2

(1.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州511447；2.國家皮革制品質量監(jiān)督檢驗中心(廣州),廣東廣州511447)

建立了皮革樣品中10種防霉劑(氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、BIT、MBT、IPBC、PCMC、水楊酰苯胺、OPP、TCMTB和OIT)的超高效液相色譜(UPLC)檢測方法。樣品經甲醇超聲萃取，T3色譜柱分離后，甲醇和0.1%甲酸水為流動相梯度洗脫，二極管陣列檢測器測定。在優(yōu)化條件下，10種防霉劑在一定的濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均不小于0.999 3，除IPBC的方法定量下限(S/N=10)為190.0 mg/kg外，其余9種防霉劑的方法定量下限為4.0～8.0 mg/kg，平均回收率為81.3%～104.9%，相對標準偏差(RSD，n=6)為4.7%～11.2%。該方法前處理簡單、分離效果好，適用于皮革樣品中10種防霉劑的同時測定。

皮革；防霉劑；超聲萃?。怀咝б合嗌V(UPLC)

發(fā)霉是皮革及其制品最常見的質量問題。微生物的繁殖會引起原料皮、成品革的霉變，導致皮革的物理性能下降，嚴重影響皮革的銷售和使用[1]，因此防止皮革霉變是皮革行業(yè)的熱點問題之一。添加防霉劑是防止皮革霉變的有效方法。目前用于皮革工業(yè)的防霉劑主要有無機類(包括次氯酸及其鹽、亞硫酸鹽、無機納米材料等),有機類(有機酚、醛類、酰胺類、雜環(huán)化合物等)[2-3]，如雜環(huán)化合物中的2-硫氰基甲基硫代苯并噻唑(TCMTB)、巰基苯并噻唑(MBT)、正辛基異噻唑啉酮(OIT)、1，2-苯并異噻唑-3-酮(BIT)和苯并咪唑等，有機酚及鹵代酚中的4-氯-3-甲基苯酚(PCMC)、鄰苯基苯酚(OPP)、五氯苯酚(PCP)等，酰胺類化合物中的水楊酰苯胺、氨基苯磺酰胺等，酯類化合物中的碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)等。多數防霉劑在有效防止霉變的同時，對人類、動物、環(huán)境帶來負面影響[4]，如異噻唑啉酮可引起皮膚灼傷或哮喘[5]；IPBC可導致接觸性皮炎[6]；鄰苯基苯酚等酚類防霉劑因生物毒性效應，在木材、食品接觸材料和紡織品中被列為限用或禁用物質[7]。鑒于防霉劑對人體的潛在健康威脅，且國內標準未針對上述10種防霉劑在皮革中的使用進行規(guī)定，因此有必要開展皮革中氨基苯磺酰胺等10種防霉劑的檢測方法研究。

目前國內外關于防霉劑檢測的研究主要集中在化妝品[8-9]、食品[10-11]、酒[12]和水性涂料[13]等。有少量文獻對皮革中TCMTB、OPP、BIT、水楊酰苯胺、IPBC和苯并咪唑等防霉劑進行了檢測[5,14-18]，其中ISO 13365-2011規(guī)定了皮革中TCMTB、PCMC、OPP、OIT的檢測方法，但未給出明確的檢出限。防霉劑的測定方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等[19-22]，超高效液相色譜儀是化學實驗室常配備的一種設備，在多殘留組分分析中具有分離效率高和分析時間短的優(yōu)點，可對防霉劑進行定性、定量測定。

本文針對皮革基質的特點，通過對色譜條件、萃取溶劑等實驗條件的優(yōu)化，采用超聲萃取結合超高效液相色譜技術，首次建立了同時測定皮革中氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、BIT、MBT、IPBC、PCMC、水楊酰苯胺、OPP、TCMTB及OIT共10種常用防霉劑的超高效液相色譜(UPLC)方法。

1　實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

ACQUITYTM超高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器(UPLC，美國Waters公司)，MS2 Minshaker渦旋振蕩器(德國IKA公司)，KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，N-EVAP 112水浴氮吹儀(美國OA公司)，KDC-400低速離心機(科大創(chuàng)新公司)，Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

氨基苯磺酰胺(純度≥99.0%)、苯并咪唑(純度≥98.0%)、1，2-苯并異噻唑-3-酮(BIT，純度≥98.0%)、巰基苯并噻唑(MBT，純度≥98.0%)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC，純度≥97.0%)及4-氯-3-甲基苯酚(PCMC，純度≥99.0%)均購自上海阿拉丁試劑有限公司；水楊酰苯胺(純度≥98.0%)、鄰苯基苯酚(OPP，純度≥97.0%)及正辛基異噻唑啉酮(OIT，純度≥98.0%)均購自上海阿達瑪斯試劑有限公司；2-硫氰基甲基硫代苯并噻唑(TCMTB，純度≥90.0%，加拿大Toronto research chemicals公司)。甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯(色譜純，美國Fisher公司)。

10個皮革樣品(片狀原料皮革，其中牛皮革5個，豬皮革3個，羊皮革2個)，來源于廣州本地市場。

1.2標準工作溶液的配制

分別準確稱取各標準物質10.0 mg，配成1 000 mg/L的標準儲備溶液，置于4 ℃冰箱冷藏保存。其中苯并咪唑、BIT、IPBC、水楊酰苯胺、OPP及OIT用甲醇溶解定容制得標準儲備溶液；氨基苯磺酰胺、MBT及PCMC用少量丙酮溶解、甲醇定容制得標準儲備溶液；TCMTB用少量乙腈溶解、甲醇定容制得標準儲備溶液。使用時，以甲醇逐級稀釋成所需濃度的混合標準工作液。

1.3樣品前處理

將皮革樣品剪成約5 mm×5 mm小片，稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，超聲30 min，4 000 r/min離心3 min，收集上清液于20 mL玻璃試管中。重復提取1次，合并提取液。提取液置于40 ℃水浴中氮氣吹干，加入1.0 mL甲醇復溶，渦旋搖勻，過0.22 μm濾膜待測。

1.4超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇；流動相梯度洗脫程序：0～2 min，90% A；2～4 min，90%～50% A;4～25 min，50%～30% A;25～27 min，30%～10% A；27～29 min，10%～90% A;29～32 min，90% A；流速：0.2 mL/min；進樣量：1.0 μL；紫外檢測波長：230，275，320 nm；柱溫：30 ℃。

2　結果與討論

2.1儀器條件的優(yōu)化

2.1.1檢測波長的選擇利用PDA檢測器在200～400 nm波長范圍內對各物質的標準溶液進行全掃描，得到10種防霉劑的最大吸收波長分別為：氨基苯磺酰胺258 nm，苯并咪唑266 nm，BIT 318 nm，MBT 323 nm，IPBC 230 nm，PCMC 280 nm，水楊酰苯胺268 nm，OPP 284 nm，TCMTB 281 nm，OIT 278 nm。

綜合各物質在不同波長下的響應值和不同波長對基線的影響，在減少干擾、保證有較大靈敏度的前提下，最終選取275 nm作為氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、PCMC、水楊酰苯胺、OPP、TCMTB及OIT的定量檢測波長，320 nm 作為BIT和MBT的定量檢測波長，230 nm作為IPBC的定量檢測波長。

2.1.2色譜柱的選擇測定防霉劑常用的液相色譜柱為C18柱，因此本實驗對UPLC 系統(tǒng)常用的 BEH C18(2.1 mm×500 mm，1.7 μm)和HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱進行了考察。結果顯示，兩種色譜柱均存在難分離的物質對(TCMTB與OPP)，在 BEH C18柱上目標物的峰形較寬。調節(jié)梯度洗脫程序后，10種防霉劑在 HSS T3柱上得到很好的分離；但在BEH C18柱上，僅目標物質的保留時間有輕微變化，峰形無明顯改善，TCMTB與OPP的色譜峰仍無法分開。這是由于HSS T3柱的理論塔板數高于BEH C18柱，因而峰形較尖銳；此外，HSS T3的填料是以高純硅膠作為載體，其碳載量為11%，小于BEH C18(碳載量為17%)，有利于極性較大的化合物分析，因而可將TCMTB與OPP分開。因此本文選用HSS T3柱作進一步的色譜條件優(yōu)化。

圖1　10種目標物混合標準溶液(50 mg/L)的色譜圖(λ=275 nm)Fig.1　Chromatogram of 10 analytes mixed standard solution(50 mg/L，λ=275 nm) the number of compounds denoted is the same as that in Table 1

圖2　不同提取溶劑對皮革樣品中10種待測物的提取回收率Fig.2　Recoveries of 10 analytes in leather samples extracted by different kinds of solvent

2.1.3梯度洗脫條件的優(yōu)化由于本文考察的10種物質極性范圍較寬，采用等度洗脫程序無法將其完全分離，為提高極性相似化合物的分離度，改善化合物的峰形，比較了不同梯度洗脫程序對10種目標物質的洗脫效果。當初始有機相比例為20%時，苯并咪唑的色譜峰與雜質峰重合，OPP與TCMTB的色譜峰重疊；當初始有機相比例為10%時，縮短有機相比例由50%變?yōu)?0%的時間，苯并咪唑色譜峰與雜質峰分開，且峰形較好，但OPP和TCMTB的色譜峰重疊，10種待測物質不能完全分開。采用“1.4”所示的梯度洗脫程序時，10種目標物質得到較好的分離，且響應較高。

在選定的儀器條件下，10種目標物質混合標準溶液的UPLC色譜圖如圖1所示，10種化合物獲得了較好的分離。

圖3　甲醇對皮革樣品(A,B)與標準品(C)的提取對比Fig.3　Extraction effect of different leather matrix(A,B) and standard(C) by methanol the number of compounds denoted is the same as that in Table 1

2.2提取溶劑的優(yōu)化

本研究的10種防霉劑均微溶或難溶于水，易溶于有機溶劑，因此比較了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯4種溶劑對加標皮革樣品中目標物的提取效果，其中BIT的添加濃度為10 mg/kg，其余9種防霉劑的添加濃度為25 mg/kg，回收率結果見圖2。結果表明，因皮革中脂肪和染料的含量較高，用丙酮等弱極性有機溶劑提取，會同時萃取出皮革樣品中的脂肪及染料，干擾目標物的提取，導致部分目標物質的提取回收率偏低；用乙酸乙酯作提取溶劑時，基質干擾較嚴重；用甲醇和乙腈提取時，脂肪和染料的溶解度較小，萃取液中的雜質較少，其中以乙腈萃取液中的雜質干擾最少，但與甲醇相比，差別不明顯，且甲醇提取液中雜質與目標物的色譜峰分離度超過1.5，達到基線分離，不影響目標物的定性和定量。進一步比較兩種提取溶劑對目標物的提取回收率(圖2)，甲醇的提取效率整體較好，對各目標物的提取率較為均衡，萃取效果最佳。

采用甲醇對兩份陽性牛皮革樣品進行提取，色譜圖見圖3。由圖可知，雜質出峰時間集中在5～8 min和25～30 min，雜質的含量和種類因皮革的不同而不同，但對目標物均不產生干擾。綜合以上因素，選取甲醇為提取溶劑。

2.3線性關系與檢出限

按“1.2”方法配制10種待測物系列混合標準工作液，其中氨基苯磺酰胺、MBT和水楊酰苯胺的濃度分別為1.5，15.0，50.0，100.0，200.0 mg/L，苯并咪唑、BIT、PCMC、OPP、TCMTB和OIT的濃度分別為3.0，10.0，50.0，100.0，200.0，300.0 mg/L，IPBC的濃度分別為75.0，100.0，200.0，300.0，500.0，1 000.0 mg/L。按優(yōu)化的儀器條件進行檢測，以各待測物的峰面積(y)對相應的質量濃度(x，mg/L)繪制標準曲線。以各待測物3倍信噪比(S/N=3)的響應值對應的濃度作為儀器的檢出限(LOD)，在樣品中添加混合標準溶液，于優(yōu)化的實驗條件下進行處理和測定，以10倍信噪比(S/N=10)計算方法的定量下限(MLOQ)。由表1可知，10種待測物在相應的濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均不小于0.999 3，LOD為0.5～25.0 mg/L，MLOQ為4.0～190.0 mg/kg。

表1　10種待測物的線性方程、相關系數、檢出限及方法定量下限Table 1　Linear equations，correlation coefficients(r2)，detection limits (LODs) and method quantitation limits(MLOQs) of 10 analytes

2.4回收率與精密度

選取陰性皮革樣品分別進行3個水平(MLOQ，2MLOQ，10MLOQ)的加標回收實驗，6次平行實驗的結果見表2。由表2可見，在加標濃度范圍內，10種待測物的平均回收率為81.3%～104.9%，相對標準偏差(RSD，n=6)為4.7%～11.2%，說明該方法具有良好的回收率與精密度。

表2　回收率與精密度測定結果(n=6)Table 2　Determination results of recovery and precision(n=6)

(續(xù)表2)

CompoundSpiked(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)Salicylanilide4.0,8.0,40.097.1,102.7,104.69.1,4.8,5.9OPP8.0,16.0,80.090.1,92.9,94.36.7,7.5,9.6TCMTB8.0,16.0,80.098.3,97.2,104.96.1,5.5,7.5OIT8.0,16.0,80.091.4,90.7,92.64.9,7.2,8.4

2.5實際樣品的檢測

采用本方法測定了購自市場的10個皮革樣品。結果7個樣品檢出OPP，檢出量為6.4～97.6 mg/kg；6個樣品檢出PCMC，檢出量為17.4～131.5 mg/kg；3個樣品檢出OIT，檢出量為10.6～126.7 mg/kg；其余防霉劑均未檢出。

3　結　論

本文建立了超聲萃取結合UPLC同時測定皮革中氨基苯磺酰胺、苯并咪唑、BIT、MBT、IPBC、PCMC、水楊酰苯胺、OPP、TCMTB及OIT 10種防霉劑的方法。本方法準確、靈敏，具有良好的回收率和精密度，可為定性定量分析皮革中防霉劑提供一種準確有效的檢測方法。

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Determination of 10 Kinds of Fungicides in Leather by Ultrasonic Extraction Combined with Ultrahigh Performance Liquid Chromatography

WU Yu-luan1,2*，WANG Li1,2，LUO Hai-ying1,2，XIAN Yan-ping1,2，DONG Hao1,2，WANG Bin1,2，HAN Wan-qing1,2

(1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou511447，China；2.National Center for Quality Supervision and Testing of Leather Product(Guangzhou)，Guangzhou511447，China)

A new method was established to determine 10 kinds of fungicides(including sulfanilamide，benzimidazole，BIT，MBT，IPBC，PCMC，salicylanilide，OPP，TCMTB，OIT) in leather samples by ultrasonic extraction combined with ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC).The leather samples were ultrasonically extracted with methanol，and separated with T3column，employing methanol and 0.1%(by volume) formic water as mobile phase by gradient elution．All of the samples were detected with diode-array detector.The 10 kinds of analytes presented favorable linearity in a certaim concentration range，with correlation coefficients(r2) not less than 0.999 3.The method quantitation limit(LOQ，S/N=10) of IPBC was 190.0 mg/kg，and the LOQs of other compounds were in the range of 4.0-8.0 mg/kg.The average recoveries(n=6) ranged from 81.3% to 104.9%，and the relative standard deviations (RSD，n=6) were in the range of 4.7%-11.2%.With the advantages of simple pre-treatment procedure and satisfactory separate effect，the developed method was suitable for the simultaneous determination of 10 kinds of fungicides in leather samples.

leather;fungicide; ultrasonic extraction;ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC)

2016-03-15；

2016-04-06

廣東省質量技術監(jiān)督局科技項目(2015PZ06)；廣州市質量技術監(jiān)督局科技項目(2015kj10)

吳玉鑾，博士，教授級高級工程師，研究方向：色譜-質譜檢測，Tel：020-82022303，E-mail：docwu@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.007

O657.72; TQ572.41

A

1004-4957(2016)09-1116-05