徐　然，齊艷菲，李優(yōu)鑫

(天津大學　藥物科學與技術學院，天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點實驗室，天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津　300072)

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腺苷脫氨酶活性分析方法研究進展

徐然，齊艷菲，李優(yōu)鑫*

(天津大學藥物科學與技術學院，天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點實驗室，天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300072)

腺苷脫氨酶(ADA)是一種核酸代謝酶，與機體細胞免疫活性有重要關系，在很多疾病中，ADA活性均表現(xiàn)異常。因此，越來越多的科研工作者聚焦于ADA活性與疾病關系的研究，并一致認為ADA活性分析對臨床疾病的診斷與治療具有非常重要的意義。該文綜述了比色法、色譜法、適配體傳感器等ADA活性分析方法的研究進展，以期為ADA的活性分析提供參考。

腺苷脫氨酶；活性分析；臨床檢測；色譜；適配體傳感器

腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase，ADA)是一種核酸代謝酶，與機體細胞免疫活性有重要關系[1]。ADA活性異常與多種疾病相關，如重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病(SCID)、結核性胸膜炎、癌癥(如乳腺癌、淋巴瘤和結腸癌、T細胞淋巴瘤等)等[1-4]。另外，ADA抑制劑也不斷被研究，開發(fā)成抗癌與抗炎的藥物[1,5]。因此，ADA活性分析對于疾病的臨床診斷、治療、病理學及藥理學研究有非常重要的意義。

近年來，ADA活性分析新方法不斷被開發(fā)，以提高ADA活性分析的準確度、靈敏度及專屬性，滿足臨床檢測及藥理學、病理學研究的需求，但未見相關綜述報道。本文綜述了紫外分光光度法、比色法、化學發(fā)光法、氨氣敏電極法、高效液相色譜、毛細管電泳以及適配體傳感器等ADA活性分析方法的研究進展，以期為ADA的進一步研究及臨床檢測提供參考。

1　ADA活性測定原理及特點

生物組織中的ADA含量微乎其微，直接測定ADA含量非常困難。因此，臨床上普遍通過測定ADA所催化的酶促反應速率(v)測定酶活性。ADA可通過不可逆的脫氨作用分別催化腺苷和脫氧腺苷形成肌苷和脫氧肌苷。由于ADA對腺苷的親和性高，因此，腺苷常為ADA酶促反應的底物，可根據(jù)腺苷的消耗速率、產物肌苷或氨的生成率評估ADA的活性[1]。

但生物樣品成分復雜，在分析其ADA活性時，腺苷與肌苷還可能參與其他代謝途徑，如嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)也廣泛地存在于人體組織中，它可快速將肌苷轉化成次黃嘌呤，若單獨通過肌苷的生成率評估ADA活性，會產生較大的偏差[6-7]。Carlucci等[6]以肌苷與次黃嘌呤的生成量來評估正常人與SCID患者紅細胞中的ADA活性。而Paul等[7]僅通過肌苷的生成分析T淋巴瘤細胞中ADA的活性，由于PNP也存在于T細胞中，肌苷是否被分解需要驗證。因此，對于臨床樣品中ADA的活性分析，待測底物與產物是否進一步參與其他代謝需首先被考慮。

2　ADA活性分析方法

2.1紫外分光光度法

腺苷分子中的嘌呤環(huán)在265 nm處有特征吸收峰，而肌苷的特征吸收峰在250 nm處，通過直接測定ADA催化體系中265 nm處吸光度的降低，即腺苷濃度的減少速率，或測定250 nm處吸光度的升高，即肌苷濃度的生成速率，從而實現(xiàn)酶活性的測定[8-9]。最近，董佩杰等[10]基于該方法分析ADA活性，搭建了簡單快速的抑制劑篩選平臺。該法簡便(只有一步反應)，但檢測信號易受干擾，主要有以下原因：①肌苷與腺苷的紫外吸收光譜有部分重疊；②對于復雜生物樣品，體系中的其他蛋白、核苷酸等成分會對檢測造成干擾；③一些生物樣品中，PNP與ADA同時存在，會瞬間分解酶促反應產生的肌苷形成次黃嘌呤，而直接通過檢測250 nm處吸光度的增強來分析ADA活性，會造成測定結果的偏差非常大。

2.2比色法

2.2.1波氏比色法底物腺苷在ADA催化下水解產生NH3后，在堿性條件下可與次氯酸鈉、苯酚反應生成靛酚蘭，其在628 nm處有特定吸收，通過比色法檢測靛酚蘭含量可評估ADA活性[11-12]。該方法應用廣泛，如Pinnelli等[13]采用該方法分析了2型糖尿病患者血清中ADA活性與血糖狀態(tài)之間的關系。Gandhi[14]和Bhushan[15]等分別采用該方法分析了ADA活性變化對結核性胸膜炎的診斷價值。

該方法所需試劑和儀器簡單，無需預先去除蛋白質，從而得到了很廣泛的應用。但易受外源性NH3的影響，與顯色劑反應耗時，手工操作時間長，干擾因素多，不適宜全自動分析，并且由于吸收的干擾，不能用于紅細胞中ADA活性的直接測定。

2.2.2酶聯(lián)比色法腺苷經ADA反應后生成的NH3可在α-酮戊二酸和還原型輔酶Ⅰ(NADH)存在下，經谷氨酸脫氫酶(GLDH)催化發(fā)生氨化還原反應，生成谷氨酸和氧化型輔酶Ⅰ(NAD十)，通過在340 nm處監(jiān)測NADH的消耗率來評估ADA活性，也可通過測定反應體系中NADH的熒光變化速率來評估ADA活性[16-18]。該法可實現(xiàn)自動化分析，但易受外源性NH3的影響。

另外，另一產物肌苷的酶聯(lián)比色法也被廣泛用于ADA活性分析。如Oosthuizen和萬雄萍等[19-20]報道了一種測定ADA活性的酶聯(lián)比色法，其原理為：底物腺苷被ADA和PNP催化成次黃嘌呤后，經黃嘌呤氧化酶(XOD)催化，可將藍色的2,6-二氯酚吲哚酚(DCIP，λmax=606 nm)還原成無色，通過測定606 nm處吸光度的變化可評估ADA活性。胡衛(wèi)紅和周美霞[21-22]等報道了另一種測定ADA活性的酶聯(lián)比色法，其原理為：底物腺苷經ADA，PNP，XOD作用后，生成尿酸和H2O2，H2O2再經過氧化物酶(POD)催化的Trnider反應生成有色醌類化合物，通過測定其最大吸收波長處吸光度的上升速率(ΔA/min)，即有色醌類化合物的生成速率來測定ADA活性。酶聯(lián)法可實現(xiàn)自動分析，但需多步酶偶聯(lián)反應，操作復雜，檢測成本較高。

多種比色法已被制成試劑盒，并廣泛應用于生物樣品中ADA活性的分析。該方法與紫外分光光度法相比，能夠避免幾種核苷酸物質紫外吸收光譜部分重疊的干擾，同時也考慮了生物樣品中酶促反應產物進一步被分解后對檢測的影響。但該方法的檢測靈敏度較低，所需酶反應較多，需要昂貴的酶聯(lián)試劑，耗時較長，且存在滯后檢測的現(xiàn)象[23]。

2.3化學發(fā)光法

基于化學發(fā)光法分析ADA活性的原理為：底物腺苷經ADA和PNP催化后可生成次黃嘌呤，再經XOD氧化生成尿酸和H2O2，H2O2與魯米諾(Luminol SERVA)發(fā)生化學發(fā)光反應，其發(fā)光強度與次黃嘌呤含量成正比，由此可測定ADA活性。徐順清等[24]基于上述原理報道了檢測ADA活性的化學發(fā)光法，該法對癌性胸水及結核性胸膜炎的診斷鑒別有較好的實用價值。

此法需要發(fā)光測量儀，雖然靈敏度高，但重現(xiàn)性和準確度差，并且需多步酶聯(lián)反應，耗時，成本較高，因此尚無進一步的應用進展。

2.4同位素法

同位素法的主要原理是以3H或14C標記的底物進行ADA酶促反應，通過測定標記的底物含量的變化來計算ADA活性。Niedzwicki等[25]用同位素法測定了人血漿中ADA的活性,以[8-14C]2′-脫氧腺苷為底物，酶促反應混合物經薄層色譜分離后進行放射性測定，通過測定產物的生成率計算ADA的活性。

同位素法雖靈敏度高、特異性強，但需要放射性的同位素標記，操作復雜，費用較高，不適合常規(guī)應用，且污染環(huán)境[26]。

2.5氨氣敏電極法

腺苷經ADA反應后生成的NH3進入電極的氣透膜內，滲入中介液薄層，改變中介液的pH值，從而使得指示電極發(fā)生改變。Hjemdahl-Monsen等[27]以氨氣敏電極為指示電極，飽和甘汞電極為參比電極，通過測定NH3濃度從而間接測得ADA活性。李毓琦等[28]用該法測定人血中ADA的活性。之后，該課題組進一步采用該法測定孕婦羊水[29]，以及大鼠胸腺、脾組織[30]中的ADA活性。

該法簡單方便，檢測時間短，無需特殊儀器和昂貴試劑，且不易受顏色及沉淀物質干擾，可用于臨床診斷。但該法較難控制電極的響應信號和響應時間，且易受外源性NH3的干擾，未能推廣使用。

2.6高效液相色譜法

近30年來，高效液相色譜技術(HPLC)發(fā)展迅速，并被應用于核苷酸與核苷的分離以及核苷酸代謝酶的測定。1977年，Uberti等[31]首次以強陽離子交換色譜柱分析人淋巴細胞與血紅細胞中的ADA活性，由于人淋巴細胞中PNP的存在，因此肌苷會進一步轉化為次黃嘌呤，基于分離的產物與底物，定量分析產物的生成速率進而評估ADA活性。隨后，1978年，Hartwick等[32]用反相HPLC分析了人血紅細胞中ADA的活性。Obata等[33]通過微透析技術將透析探針注入到小鼠的腸粘膜內，并灌注含腺苷的生理鹽水，使ADA酶促反應在小鼠體內發(fā)生，后經HPLC分析透析液中腺苷與肌苷的含量并推算肌苷的生成量。該法首次提出體內酶促反應分析ADA的方法，但因只能定性分析ADA在體內的酶促反應，缺少活性定量標準而未能深入發(fā)展。Paul等[7]比較了HPLC法與光譜學法，指出了紫外分光光度法檢測的不足，即酶的底物腺苷、產物肌苷的吸收光譜有重疊，另外ADA抑制劑在腺苷與肌苷的吸收光譜范圍內也有吸收，單純的光譜學檢測缺少分離過程，檢測結果受到很大干擾，而具有分離功能的HPLC法能更準確地分析ADA活性。Ni等[34]采用反相HPLC法研究了ADA的活性抑制劑。Schepp等[35]采用HPLC法測定ADA的活性，并探討了ADA的缺失與抗體缺失和免疫調節(jié)異常的關系。此后，HPLC法被廣泛應用于不同樣品中核苷酸代謝的分析[26]。

HPLC法分析ADA活性，能夠將ADA酶促反應的底物與產物完全分離并準確定量，可消除底物與產物檢測的干擾。該法有較高的準確性與靈敏度。然而，該法也有很多不足，其樣品前處理過程(如蛋白的完全沉淀，過濾與pH值的調節(jié))復雜，而過酸過堿或是含有一定量蛋白的樣品均會損壞色譜柱，且沖洗和平衡過程較耗時。

2.7毛細管電泳法

毛細管電泳(CE)具有分離效率高、樣品消耗量小的特點，并且有多種運行模式，在酶分析領域有廣泛的應用。本課題組的Bao等[36]在1992年首次提出了電泳介導微分析法(Electrophoretically mediated microanalysis，EMMA)，隨后毛細管電泳微型固定化酶反應器(Immobilizedenzyme reactors，IMERs)技術被提出。EMMA與IMERs方法的提出實現(xiàn)了毛細管柱上的酶分析。本課題組在此基礎上不斷地將毛細管電泳技術應用于酶分析領域[37]，并完成了毛細管電泳中ADA與PNP連續(xù)分析的工作。

1995年，Sun等[38]通過自制的高效毛細管電泳在線監(jiān)控了ADA酶促反應，首次將CE技術應用于ADA分析。該方法在一根毛細管上設4個檢測窗口，其有效長度分別為35，66.5，97.5，129 cm。在電泳緩沖液中添加ADA后，腺苷在毛細管內運行的過程中會逐漸轉化成肌苷，隨著檢測窗口長度的增加，肌苷的產生量逐漸增加。1996年，Saevels等[39]首先通過EMMA技術，以腺苷為底物測定了ADA的Km值。ADA與腺苷依次進入毛細管的進樣端，由于ADA的電泳遷移率小于腺苷的電泳遷移率，當腺苷區(qū)帶穿過ADA區(qū)帶時，會生成產物肌苷。腺苷與肌苷被分離并依次經過檢測窗口被檢測，依據(jù)肌苷的生成來評估酶促反應速率。此后，EMMA技術分析ADA未得到進一步應用，直至2011年，Pei等[40]研究了CE分析ADA轉化的4種模式即毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動毛細管電泳(MEKC)、EMMA和IMERs。EMMA方法中，所有混合、酶促反應、分離與檢測均可在毛細管內自動進行，整個分析過程簡便、快速，無需復雜的樣品前處理過程，是一種快速簡便的酶分析方法。但是，已報道的EMMA技術分析ADA的研究中，ADA樣品均是從牛脾臟純化的酶，目前尚無直接分析生物樣品中ADA活性的報道。可能是由于：①組織細胞或體液中成分較復雜，大量的生物基質與目標物質的分離較困難；②EMMA過程的整個反應時間較短，僅有幾十秒的混合時間，在較短的時間內生物樣品中ADA產物的產生量有限，不足以達到儀器的定量下限；③ADA分解腺苷的產物肌苷還會進一步被分解，使產物更難以被檢測。因此，EMMA技術應用到臨床樣品中ADA的活性分析雖有很大發(fā)展前景，但也面臨巨大挑戰(zhàn)。本課題組正嘗試改進EMMA方法，以期實現(xiàn)集細胞進樣、孵育、分離、檢測于一體的細胞中ADA的自動化分析。IMERs是將ADA固定到毛細管上，酶促反應以及基質與產物的分離在一根毛細管中進行，該技術也被用于基于ADA活性分析的抑制劑篩選[41-42]，但這種固定的毛細管微反應器的穩(wěn)定性受很多因素影響，如當電泳緩沖液的pH值大于8.0時，固定酶的化學鍵會遭到破壞。CZE與MEKC法在分析ADA過程中，ADA酶促反應在線下完成，操作中間步驟多、費時，但這兩種方法的重現(xiàn)性相對較好。Carlucci等[6]則報道了線下酶反應、線上分析的MEKC方法檢測人血紅細胞中ADA的活性，并應用于SCID的檢測。本課題組[43]也成功地實現(xiàn)了CZE模式同時測定生物樣品中ADA與PNP的活性。

CE相對于其他方法如HPLC，檢測靈敏度相對較低，而一些組織中ADA含量較少，尤其是一些疾病患者體內的ADA活性顯著降低，酶促反應后產生產物的量更少。因此研究者們不斷致力于開發(fā)新的CE方法以提高ADA分析的靈敏度。Adam等[44]建立了短暫毛細管等速電泳-毛細管區(qū)帶電泳方法分析紅細胞中ADA，通過預濃縮低濃度的大量樣品而提高檢測靈敏度，產物次黃嘌呤與肌苷的靈敏度可提高2個數(shù)量級。Iqbal等[45]通過高靈敏的反電極轉化模式分析ADA酶促反應，先將大量的樣品水溶液引入毛細管中，反轉電極促使電滲反向，樣品基質被推回到毛細管的進樣端，達到合適的堆積效應后，電極轉換到正模式，分析物被分離并被檢測。該方法的富集因子高達10倍，能夠有效地提高檢測靈敏度。然而該方法只適于分析帶同種電荷的分析物，且樣品基質為中性物質，其應用受到限制。

毛細管電泳技術具有簡便、快速，以及無需復雜樣品前處理的特點，經過數(shù)十年的發(fā)展，可用于ADA的分析，但其方法學的改進及在實際臨床樣品分析中的應用仍在不斷深入。

2.8腺苷適配體傳感器法

適體(Aptamer)是一種功能化的可選擇性結合小分子、蛋白質甚至是細胞的DNA或RNA，這些物質作為生物傳感器材料已得到廣泛應用。腺苷適配體傳感器分析ADA活性的基本原理為：腺苷的適體對腺苷具有很高的親和力，但對肌苷等其他物質的親和力很低。有腺苷存在的情況下，適體與腺苷緊密結合，當加入ADA后腺苷被分解，緊密結構發(fā)生變化。腺苷適體的DNA片段會與其他分子結合，引起檢測信號的改變，根據(jù)信號的變化評估腺苷的減少量，從而分析ADA活性。按照檢測信號的不同將檢測ADA的適配體傳感器分為電化學、熒光和比色適配體傳感器。

2.8.1電化學適配體傳感器電化學適配體傳感器法中，ADA加入前后腺苷適配體狀態(tài)的改變可引起電化學信號的改變，從而測定ADA活性。如Zhang等[46]設計了一種電化學適配傳感器分析ADA，將氯高鐵血紅素(Hemin)作為電化學標記物，并設計了Hemin的兩段互補的適體DNA片段DNA1與DNA2，DNA2片段吸附在電極表面，DNA1可與腺苷緊密結合。有腺苷存在時，該體系會形成一個緊密結構，使Hemin的分裂適體分開。當體系中加入ADA后，腺苷轉化為肌苷，而肌苷與DNA1的脫離使DNA1不被束縛，因此Hemin的兩段分裂適體可以相互靠近易于與Hemin結合，從而得到其電化學響應。由于腺苷和電化學標記物Hemin存在著競爭關系，因此峰電流大小可以間接地反映出ADA的活性，其信號強度與ADA活性成正比，該方法可檢測到0.2 U/mL的ADA。

2.8.2熒光適配體傳感器熒光適配體傳感器有較高的檢測靈敏度，近年來，研究者們設計了多種高靈敏的熒光適配體傳感器系統(tǒng)，用以分析ADA活性。Zhang等[47]提出電化學適配體傳感器后，又設計了一種時間分辨熒光適配體傳感器測定ADA。首先將DNA1通過生物素-抗生物素蛋白固定在鏈霉親和素涂層的金屬板上，腺苷存在時，腺苷適配體DNA1形成一個緊密堆積結構，加入ADA后，腺苷被催化成為肌苷，使DNA1轉變?yōu)樽杂蓱B(tài)。此時加入地高辛(DIG)修飾的DNA2，與DNA1雜交后，接在金屬板表面，DIG與Eu-anti-DIG結合后，通過電子轉移使銪離子Eu (Ⅲ)發(fā)射出熒光，繼而通過熒光信號檢測ADA的活性，該方法的檢出限為2 U/L。隨后，Zhang等[48]又改進了該方法，用辣根過氧化物酶修飾DNA2，將檢測靈敏度提高到0.5 U/L。由于Eu (Ⅲ)的熒光壽命比背景信號更長，因而該方法可以消除背景熒光信號以及傳感器自身信號的干擾。

隨后，熒光分子信標技術被設計用來分析ADA，設計的傳感器包括腺苷的適配體DNA1、與適配體DNA1互補的另外一條DNA2和能夠發(fā)射熒光的片段3部分。當有腺苷存在時，適配體區(qū)域形成一個緊密的結構，不能產生熒光信號，加入ADA后，兩段互補的DNA片段雜交，內嵌的嘧啶環(huán)產生熒光信號。張凱等[49]以DNA為模板，用以銀納米簇為信號指示器的熒光分子信標技術分析了ADA，其檢測靈敏度可達0.05 U/L，分析過程的原理圖如圖1所示。

圖1　以銀納米簇為信號指示器的熒光分子信標方法分析ADA的原理圖[49]Fig.1　Schematic illustration of the fluorescent molecular beacon using silver nanoclusters as a signal indicator[49]

圖2　碳納米管-熒光核酸適配體傳感器檢測腺苷脫氨酶活性的原理[52]Fig.2　The principle of MWCNT-based fluorescence aptasensor for adenosine deaminase activity and inhibitor screening[52]

此外，采用熒光共振能量轉移(FRET)技術作為適配體熒光傳感器的信號轉換方式也有大量文獻報道，該方法通過供體熒光分子的激發(fā)，誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光。He等[50]設計了一種磁輔助熒光比率法，利用水溶性陽離子多聚體(CCP)與熒光素之間的能量共振轉移發(fā)射熒光信號，測定ADA活性。其中熒光素標記的單鏈DNA信號探針(ssDNA-F1)與末端生物素標記的腺苷適配體(Biotin-aptamer)互補，可形成雙鏈DNA (Biobin-dsDNA-Fl)，由于鏈霉親和素對生物素具有很高的親和性，鏈霉親和素涂層的磁珠可以快速捕捉生物素標記DNA。未加ADA時，Biobin-dsDNA-Fl加入腺苷后解旋，ssDNA-F1信號探針在磁場作用下從待測溶液中分離，加入CCP時，不能發(fā)生從CCP到熒光素的能量共振轉移。加入ADA后，腺苷水解，Biobin-dsDNA-Fl重新形成并附到磁珠上，加入CCP使其發(fā)生CCP到熒光素的有效的能量共振轉移，繼而可通過熒光光譜檢測出ADA的活性。隨后Wang等[51]設計合成了新型的熒光共軛聚合物，可以檢測0.5 U/L的ADA。

通過納米材料的熒光猝滅作用檢測ADA活性也有很多文獻報道，如Hu等[52]基于碳納米管-熒光腺苷適配體平臺檢測ADA活性并篩選其抑制劑，其原理如圖2所示。該法中，首先以熒光素標記適配體1和2兩段片段(FAM-Apt-1和FAM-Apt-2)，當無ADA時，腺苷與FAM標記的適配體片段1，2結合形成復合物，不能與碳納米管結合，有較高的熒光信號，當體系中加入ADA后，腺苷被分解，F(xiàn)AM-Apt-1和FAM-Apt-2會吸附至碳納米管上，熒光信號被猝滅。隨著ADA的不斷增加，熒光信號逐漸降低。該方法的檢測靈敏度達0.2 U/mL。張亮亮等[53]設計了基于氧化石墨烯-核酸適配體平臺的無標記熒光傳感器技術，并應用于ADA的分析，與文獻[52]方法相比，適配體DNA片段未被熒光標記，而是以SYBR green Ⅰ(SG)核酸嵌入染料為熒光指示劑，以氧化石墨烯為能量受體，猝滅熒光信號。另外氧化石墨烯的超強熒光猝滅能力較大地提高了該方法的檢測靈敏度，其檢出限可達0.025 U/mL。

最近，Xie等[54]設計了一種新型的腺苷適配體平臺分析ADA。利用檢測目標片段的“指數(shù)擴增反應”，能夠檢測到0.8 mU/L的ADA，在該類方法中靈敏度最高。

2.8.3比色適配體傳感器比色適配體傳感器方法主要是結合金納米粒子技術對ADA進行分析，金納米粒子的膠體溶液產生紅色的可見光，在630 nm處有特征吸收峰，而金納米粒子膠體溶液沉聚后，可產生藍色的可見光，在520 nm處有特征吸收峰。根據(jù)這一特點，可通過可見光檢測數(shù)值的變化分析ADA的活性。

Zhao等[55]在2008年首次提出了可見光適配體傳感器分析ADA，將適配體固定到金納米粒子上，通過加入ADA后金納米粒子膠體溶液的顏色變化來檢測ADA的活性。張亮亮等[56]對該方法加以改進，設計了無標記的金納米粒子腺苷傳感器，腺苷上的氨基會吸附到金納米粒上，使金納米粒子沉聚，產生藍色可見光，而加入ADA后，腺苷轉化成肌苷，不會發(fā)生此現(xiàn)象，金納米粒子的膠體溶液產生紅色可見光，從而檢測ADA的活性。該方法的檢出限為0.822 7 U/L。Cheng等[57]利用短的單鏈DNA分子能夠保護金納米粒子不發(fā)生聚合的特點，也設計了未修飾的金納米粒子腺苷適配體傳感器。當無ADA存在時，腺苷與其適配體結合成網狀結構，金納米粒子呈現(xiàn)藍色，當體系中加入ADA后，腺苷會被分解，單鏈的DNA分子呈游離狀保護金納米粒子不聚集，呈現(xiàn)紅色，原理如圖3所示。但該方法的檢出限為1.526 U/L，未能進一步提高ADA活性檢測的靈敏度。

圖3　金納米粒子-比色適配體檢測腺苷脫氨酶的原理[57] Fig.3　Scheme for the principle of a AuNP-based colorimetric aptasesor for ADA detection[57]

可見光適配體傳感器不需要熒光標記過程和多步結合反應，檢測簡便、快速，但檢測靈敏度遠低于熒光適配體傳感器。

適配體傳感器的方法能夠專屬性地分析ADA的底物腺苷，從而間接檢測ADA的活性。該方法有較低的檢出限，遠高于臨床上要求的ADA臨床檢出值即4 U/L。然而，該方法并未真正應用到實際生物樣品中ADA活性分析，與臨床實際應用的結合尚待進一步研究。

3　結論與展望

腺苷脫氨酶是體內重要的核苷酸代謝酶，與很多疾病相關，對其活性分析具有重要的臨床意義。本文聚焦ADA活性研究，綜述了比色法、HPLC、CE和適配體傳感器等技術分析ADA活性的研究進展。其中比色法是分析ADA的最常用方法，其簡便、快速，但檢測的靈敏度及準確度有很大不足。HPLC和CE等色譜技術基于樣品的分離，能夠準確地測定ADA的活性，不同的ADA活性分析模式不斷被研究，并應用于多種臨床樣品的檢測。近年來適配體傳感器技術分析ADA活性也得到較快發(fā)展，是目前ADA分析最靈敏的方法，但該方法未被應用于實際樣品中ADA活性的分析，其在臨床上的應用尚有待進一步研究。

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Research Progress for Analytical Methods of Adenosine Deaminase Activity

XU Ran，QI Yan-fei，LI You-xin*

(Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin Key Laboratory for Modern Drug Delivery and High-Efficiency，School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin300072，China)

Adenosine deaminase(ADA)， a kind of catabolic enzymes toward nucleic acid,has a close relationship with cell immunocompetence.ADA activity is abnormal in many diseases.Therefore，more and more researchers have been focusing on research of the relationship between ADA activity and some diseases.Analysis of the ADA activity is considered to has a very important significance in clinical diagnosis and treatment of diseases.Currently，many reports about novel analysis methods of ADA activity have been published，but no relevant reviews have been reported so far.In this paper，analytical methods of ADA activity such as colorimetric，chromatography and adapter sensor methods，are summarized，which is expected to provide

for the analysis of ADA.

adenosine deaminase;activity analysis;clinical test;chromatography;adapter sensor

2016-04-25；

2016-05-07

國家自然科學基金(21375093)；高等學校博士學科點專項科研基金(20130032120081)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃青年項目(15JCQNJC43200)

李優(yōu)鑫，博士，講師，研究方向：電泳技術的開發(fā)等，Tel：022-27892820，E-mail：lyx@tju.edu.cn

綜述

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.026

O629.8；G353.11

A

1004-4957(2016)09-1209-08