程廣強(qiáng)

(福建省測試技術(shù)研究所，福建　福州　350003)

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口腔癌患者尿液萘酚反應(yīng)物的高效液相色譜熒光檢測法篩查

程廣強(qiáng)*

(福建省測試技術(shù)研究所，福建福州350003)

利用高效液相色譜熒光檢測法(HPLC/FLD)對(duì)口腔癌患者尿液中的萘酚反應(yīng)物(NNR)進(jìn)行分離分析，通過對(duì)34例口腔癌患者和18例健康人尿液的NNR進(jìn)行分析，比較了癌癥患者及健康人尿液中的成分含量差異，提出了一種可用于口腔癌輔助診斷的新方法。結(jié)果表明，在健康人及口腔癌患者尿液的萘酚反應(yīng)物(NNR)中可檢出一種標(biāo)記物，其激發(fā)波長為440 nm，發(fā)射波長為539 nm。該標(biāo)記物含量在口腔癌患者中較低，而在健康人群中顯著偏高，這與通常的鑒定結(jié)果不同。通過采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U檢驗(yàn))，該標(biāo)記物含量在健康人群與口腔癌癥患者中存在顯著性差異(P<0.01)，其特異度為94.1%，敏感度為94.4%，ROC曲線下面積(AUC)為0.989。該模型具有較高的診斷價(jià)值，能夠用于口腔癌的輔助鑒定。

口腔癌；尿液萘酚反應(yīng)物；液相色譜熒光檢測(HPLC/FLD)；ROC曲線

尿液作為一種體液，具有重要的臨床檢驗(yàn)價(jià)值，早已列為三大常規(guī)檢查的內(nèi)容。由于其取樣簡單，對(duì)人體無傷害，是非常理想的樣本。尿液是多組分體系，包含很多人體代謝物，成分較為復(fù)雜，信息量較為豐富，因此通過分析尿液成分進(jìn)行一些特殊疾病診斷的研究報(bào)道日益增多。尿液檢測研究已應(yīng)用于胃癌[1-2]、肺癌[3-4]、肝癌[5-6]等癌癥檢測中，但靈敏度和特異性有限，用于口腔癌診斷的研究也鮮見報(bào)道。目前研究癌癥患者的尿液成分，主要利用尿液自身的特性，采用尿液自動(dòng)分析儀或其他光譜、色譜、質(zhì)譜手段進(jìn)行檢測，如對(duì)尿液的自體特異性熒光進(jìn)行檢測[7]；還有一些通過某種特定試劑(如亞硝基萘酚[8-9]等)與尿液中的成分反應(yīng)生成特定產(chǎn)物，然后采用光譜、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)行分析，確定反應(yīng)物含量與癌癥的相關(guān)性。目前已有報(bào)道大多直接采用光譜法測量吸光度或者熒光強(qiáng)度，以研究亞硝基萘酚反應(yīng)物(NNR)與各種癌癥的相關(guān)性，并對(duì)NNR的化學(xué)基礎(chǔ)與特異性有了較深入的研究[10]。由于尿液與亞硝基萘酚反應(yīng)后，其成分更為復(fù)雜，反映出的吸光度變化或熒光強(qiáng)度變化是各種產(chǎn)物的綜合結(jié)果，因此籠統(tǒng)地用這些變化來確定與癌癥的相關(guān)性，具有一定的局限性。本文在已有研究[11]的基礎(chǔ)上利用高效液相色譜(HPLC)的高分離性能以及熒光檢測器(FLD)的高選擇性、高靈敏性來研究NNR，尿液樣品在一定條件下與亞硝基萘酚反應(yīng)后形成NNR，NNR經(jīng)HPLC分離后，用FLD進(jìn)行選擇性檢測。在本文的色譜條件下，檢出一種與口腔癌密切相關(guān)的物質(zhì)，其特異度為94.1%，敏感度為94.4%，ROC曲線下面積(AUC)為0.989，該模型具有較高的診斷價(jià)值。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2475熒光檢測器，HHS-S恒溫水浴裝置(江蘇金壇市正基儀器有限公司)。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

衍生試劑的配制：將200 mg/Lα-亞硝基-β-萘酚乙醇溶液、3.0 mol/L硝酸與0.1 mol/L亞硝酸鈉按2∶3∶3比例混合即得衍生劑。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

研究樣本均取自通過病理活檢確診的口腔癌患者，大多數(shù)病例均為口腔鱗癌或者舌癌，正常組均為非癌患者。均于入院第二天采集，囑尿液采集前一天晚飯后飲水勿超過1 000 mL，自行留取清晨第一次尿液50 mL，保存于聚乙烯塑料瓶中，容器外貼標(biāo)簽(注明受檢人員姓名、編號(hào)、采集日期)，放入-20 ℃低溫冰箱內(nèi)保存，共采集34例口腔癌患者和18例正常人的尿液樣本。取患者晨尿樣1.0 mL，加入等體積的衍生劑于55 ℃水浴保溫反應(yīng)30 min后，吸取1.0 mL過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣分析。

1.3液相色譜分析條件

色譜柱：Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，柱壓：12 MPa；流動(dòng)相：甲醇-水(50∶50)；流速：1.0 mL/min；熒光檢測條件：λex/λem=440 nm/539 nm,Gain：10。

2　結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響尿液中可與α-亞硝基-β-萘酚反應(yīng)的成分較多，包括酪氨酸、5-羥-3-吲哚乙酸、愈創(chuàng)木酚衍生物、對(duì)羥酚取代物、尿高香草酸[12-14]等，均可形成NNR。本文采用酪氨酸為參考基準(zhǔn)物質(zhì)，反應(yīng)時(shí)間為10 min，對(duì)衍生反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。酪氨酸與α-顯色劑的顯色反應(yīng)在室溫下進(jìn)行緩慢且反應(yīng)靈敏度較低，適當(dāng)加熱有利于顯色反應(yīng)的進(jìn)行，根據(jù)各溫度下顯色產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在55 ℃時(shí)，試樣完全顯色且顯色產(chǎn)物在一定時(shí)間內(nèi)比較穩(wěn)定，因此選擇加熱溫度為55 ℃。

2.1.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響 在最佳反應(yīng)溫度(55 ℃)下考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，衍生物的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，衍生物的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，因此選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.2液相色譜條件的優(yōu)化

將上述衍生物進(jìn)行高效液相色譜分離分析，以期尋找口腔癌患者與正常人尿液樣品中NNR的液相色譜熒光檢測譜圖差異，尋求合適的標(biāo)記物用于診斷分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生物中一種NNR具有較強(qiáng)的熒光特性，其峰高值與口腔癌具有相關(guān)性。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果，進(jìn)一步對(duì)液相色譜的分離條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1色譜條件的優(yōu)化比較了流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)衍生物出峰時(shí)間的影響。結(jié)果表明，甲醇的體積分?jǐn)?shù)越大，衍生物的保留時(shí)間越短，峰形越尖銳，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，出峰時(shí)間在6.1 min左右，相對(duì)較為理想，因此選擇流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2.2檢測器的選擇 在最佳反應(yīng)條件及色譜條件下，分別用紫外二極管陣列檢測器(UV)和熒光檢測器檢測，得到萘酚反應(yīng)物的色譜圖見圖1。由圖1可見，采用UV檢測時(shí)，雖然口腔癌患者和正常人尿液樣品的譜圖中能顯示出有差異的色譜峰，但譜圖的干擾峰較多，其差異峰的純度不高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)； 而采用熒光檢測時(shí)，口腔癌患者和正常人的尿液樣品譜圖中的色譜峰顯示具有明顯差異(圖1B)，且無雜質(zhì)峰干擾，可作為口腔癌患者的特征標(biāo)記物峰，故選擇使用熒光檢測器。

圖1　萘酚反應(yīng)物的高效液相色譜紫外檢測色譜圖(A,λ=254 nm)與熒光檢測色譜圖(B,λex/λem=440 nm/539 nm)Fig.1　Chromatograms of NNR with UV detector(A,λ=254 nm) and FLD detector(B,λex/λem=440 nm/539 nm)

圖2　兩組人群實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的散點(diǎn)圖Fig.2　Scatter diagram of two group people

圖3　ROC曲線圖Fig.3　ROC curve

2.3實(shí)際樣品檢測

對(duì)34例口腔癌患者和18例正常人尿液樣品中的NNR進(jìn)行分離分析，選取保留時(shí)間6.1 min的峰為標(biāo)記物，比較癌癥患者及健康人尿液中NNR含量的差異。結(jié)果表明，在口腔癌患者尿液中該標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度較低(未檢出～27.8×10-2V)，而在健康人群中則顯著偏高(10.0×10-2～84.0×10-2V)。將所得數(shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖(圖2)，從散點(diǎn)圖也可直觀看出兩組數(shù)據(jù)存在明顯差異。

2.4檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

ROC曲線為受試者工作曲線(Receiver operating characteristic curve,簡稱ROC曲線)，又稱感受性曲線(Sensitivity curve)，常用于醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析[15]。ROC曲線是反映特異度和敏感度連續(xù)變量的綜合指標(biāo)，可揭示敏感度和特異度的相互關(guān)系，通過將連續(xù)變量設(shè)定出多個(gè)不同的臨界值，從而計(jì)算出一系列敏感性和特異性，再以敏感性為縱坐標(biāo)，(1-特異性)為橫坐標(biāo)繪制曲線，其曲線下面積(AUC)越大，診斷準(zhǔn)確度越高。一般認(rèn)為，當(dāng)AUC為0.5～0.7時(shí)，有較低的準(zhǔn)確性；0.7～0.9時(shí)，有一定的準(zhǔn)確性；大于0.9時(shí)，有較高的準(zhǔn)確性。本文采用SPSS13軟件，將檢測所得數(shù)據(jù)輸入軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制了ROC曲線(如圖3)。從圖3可以得出AUC為0.989，特異度為94.1%，靈敏度為94.4%，表明該模型具有很高的診斷價(jià)值。

3　結(jié)　論

本文建立了口腔癌患者尿液中NNR的高效液相色譜熒光檢測方法，方法具有很好的準(zhǔn)確性。通過分析口腔癌患者和正常人尿液樣品中的NNR含量發(fā)現(xiàn)，兩組數(shù)據(jù)存在顯著性差異，說明此法用于口腔癌普查篩選具有一定意義。建立的ROC曲線，曲線下面積(AUC)為0.989，說明診斷效果較好，方法的特異度為94.1%，靈敏度為94.4%。

致謝：衷心感謝本課題組全體成員的努力，特別是本所的倪沁顏同志和福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院口腔科林耿冰醫(yī)生。同時(shí)也感謝本所蘇勤同志提供SPSS13.0軟件用于數(shù)據(jù)分析。

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Screening of Naphthol Reactant in Urine of Oral Cancer Patients by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection

CHENG Guang-qiang*

(Fujian Institute of Testing Technology , Fuzhou350003,China)

A new aided diagnosis of oral cancer was developed for the separation and analysis of nitrosonaphthol reactant(NNR) of urine in oral cavity cancer patients by using high performance liquid chromatography with fluorescence detection(HPLC/FLD),based on the analysis of urine NNR of 34 cases of oral cancer patients and 18 healthy people and their difference of composition content.The experimental results showed that a marker with excitation wavelength of 440 nm and emission wavelength of 539 nm,could be detected in urinary nitrosonaphthol reactant(NNR) from healthy people and patients with oral cavity cancer under the condition of this paper.The marker content was relatively low in oral cancer patients and significantly high in healthy persons,which is quite different from the usual test results.Significant differences were found in the matter content in healthy people and those with oral cancer patients(P<0.01) using a non parametric test (Mann-Whitney U test).Further data analysis showed that the specificity was 94.1%,the sensitivity was 94.4%,the area under the ROC curve(AUC) was 0.989.The model showed a high diagnostic value,and could be used for the auxilary identification of oral cancer.

oral cancer；nitrosonaphthol reactants；high performance liquid chromatography with fluorescence detection(HPLC/FLD)；ROC curve

2016-02-01；

2016-03-10

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目公益類科研院所基本科研專項(xiàng)資助(2009R10002-1)

程廣強(qiáng)，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：分析化學(xué)，Tel：0591-87872379，E-mail:1585920616@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.024

O657.72；O625.313

A

1004-4957(2016)09-1199-04