孫林林，張芬芬，沈文斌，丁　婭*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)　藥物分析教研室，江蘇　南京　210009 ；2.東華大學(xué)　分析測(cè)試中心，上?！?01620；3.中國(guó)藥科大學(xué)　藥物科學(xué)研究院，江蘇　南京　210009)

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核磁共振法測(cè)定依帕列凈含量

孫林林1，張芬芬2，沈文斌3*，丁婭1*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇南京210009 ；2.東華大學(xué)分析測(cè)試中心，上海201620；3.中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，江蘇南京210009)

分別以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)，采用定量核磁共振法對(duì)依帕列凈含量進(jìn)行測(cè)定。以氘代二甲亞砜和重水混合液為溶劑，確定氫定量核磁共振方法(1H-qNMR)的測(cè)試條件為：激發(fā)脈沖角度30°；時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)32 K；測(cè)定溫度303 K；脈沖延遲時(shí)間20 s；采樣次數(shù)32；窗函數(shù)0.3 Hz。在此實(shí)驗(yàn)條件下，結(jié)果專屬性良好，穩(wěn)定性可達(dá)24 h，耐用性符合要求。以樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比對(duì)其摩爾比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，依帕列凈與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱的摩爾比在0.512 5～1.953 8范圍內(nèi)，依帕列凈與內(nèi)標(biāo)齊多夫定的摩爾比在0.494 7～1.966 0范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均為0.999 9。以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)時(shí),依帕列凈的含量測(cè)定結(jié)果分別為99.83%和99.77%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.06%和0.19%。2種內(nèi)標(biāo)方法的測(cè)定結(jié)果一致，所建立的方法專屬、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷，適用于新藥的含量測(cè)定。

依帕列凈；定量核磁共振；鹽酸吉西他濱；齊多夫定

依帕列凈(Empagliflozin)是由勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)公司開發(fā)的一種新型選擇性鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑，商品名為Jardiance，于2014年8月1日由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于改善2型糖尿病(T2DM)患者的血糖控制。SGLT2表達(dá)于腎臟近端小管，負(fù)責(zé)腎小管內(nèi)大部分葡萄糖的重吸收。依帕列凈通過(guò)抑制SGLT2減少葡萄糖的重吸收，降低腎糖閾，增加尿糖的排泄[1-2]。此外，依帕列凈還可降低體重[3]，適度降血壓，可用于同時(shí)患有T2DM和高血壓的病人[4]。由于降糖機(jī)制不同，依帕列凈作為SGLT2抑制劑可與其他常用類型的降糖藥聯(lián)合應(yīng)用,如吡格列酮(Pioglitazone)[5]、二甲雙胍(Metformin)[6]等。由于依帕列凈是一種新型藥物，各國(guó)藥典均未收錄，尚無(wú)法確定對(duì)照品。在實(shí)際藥品檢驗(yàn)工作中，準(zhǔn)確快速測(cè)定依帕列凈的含量對(duì)于藥品的質(zhì)量控制有著非常重要的意義，因此需要制備工作對(duì)照品，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

定量核磁共振(Quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)技術(shù)不需要待測(cè)物對(duì)照品，僅以已知含量的藥物或化學(xué)物質(zhì)為參比即可對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定[7]，樣品前處理步驟簡(jiǎn)便、快捷，可顯著提高檢測(cè)效率，已先后被美國(guó)藥典、英國(guó)藥典[8]、歐洲藥典、中國(guó)藥典 2010 版收錄[9]。近年來(lái)，qNMR技術(shù)在藥品含量測(cè)定領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，主要包括藥物對(duì)照品、原料藥、藥物制劑的含量測(cè)定等。目前，qNMR 包括1H,13C,19F,31P,14N,15N-NMR等，定量方法主要包括相對(duì)定量法和絕對(duì)定量法，其中絕對(duì)定量法又分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)添加法。由于1H 核磁共振定量技術(shù)靈敏度高，適用范圍廣，國(guó)內(nèi)外已有大量研究報(bào)道[10-16]。

本研究采用齊多夫定和鹽酸吉西他濱兩種內(nèi)標(biāo)，以氘代二甲亞砜和重水混合為溶劑，分別建立了qNMR定量測(cè)定依帕列凈含量的方法，考察了實(shí)驗(yàn)條件的影響，對(duì)所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，并應(yīng)用于依帕列凈供試品的含量測(cè)定。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Avance-300型超導(dǎo)核磁共振儀及Topspin 2.1操作軟件(瑞士Bruker公司)；BT125D分析用電子天平(感量0.01 mg，德國(guó) Sartorius公司)。

依帕列凈(江蘇柯菲平醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)140202)；鹽酸吉西他濱(含量99.8%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100622-201202)；齊多夫定(含量100.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100672-200401)；氘代二甲亞砜(99.9 atom% D，DMSO-d6,Sigma-Aldrich公司)，重水(99.9 atom% D，D2O,Sigma-Aldrich公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1供試品溶液的制備分別精密稱取依帕列凈供試品約15.0 mg及內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱10.0 mg置于同一離心管中，加入0.5 mL氘代二甲亞砜(DMSO-d6)和0.1 mL D2O溶液，振蕩溶解，平行制備3份，轉(zhuǎn)移至直徑為5 mm的樣品管中待測(cè)；分別精密稱取依帕列凈供試品約15.0 mg及內(nèi)標(biāo)齊多夫定8.9 mg置于同一離心管中，加入0.4 mL DMSO-d6和0.25 mL D2O，振蕩溶解，平行制備3份，轉(zhuǎn)移至直徑為5 mm的樣品管中待測(cè)。

1.2.2核磁共振定量實(shí)驗(yàn)條件激發(fā)脈沖角度30°；時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)32 K；測(cè)定溫度303 K；脈沖延遲時(shí)間20 s；采樣次數(shù)32；窗函數(shù)0.3 Hz；掃描寬度3 840 Hz，中心頻率1 710 Hz。圖譜處理時(shí)，均采用手動(dòng)方式依次進(jìn)行相位校正、基線校正和化學(xué)位移校正，并根據(jù)所選的定量峰及積分范圍進(jìn)行積分。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品制備方法及氘代溶劑的選擇

合適的溶劑首先應(yīng)滿足對(duì)樣品和內(nèi)標(biāo)均有良好的溶解度，考慮到待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的溶解性,選擇氘代二甲亞砜為溶劑，同時(shí)加入不同比例的重水以消除活潑質(zhì)子的干擾。當(dāng)內(nèi)標(biāo)為鹽酸吉西他濱時(shí)，選擇0.5 mL DMSO-d6和0.1 mL D2O混合為溶劑；而內(nèi)標(biāo)為齊多夫定時(shí)，由于依帕列凈δ4.91附近的活潑質(zhì)子在常用的混合溶劑系統(tǒng)(0.4 mL DMSO-d6和0.1 mL D2O混合或0.5 mL DMSO-d6和0.1 mL D2O混合)中很難交換完全，需加大D2O量使其盡可能交換完全,因此最終選擇0.4 mL DMSO-d6和0.25 mL D2O混合為溶劑。由于DMSO-d6和D2O的粘度較大且內(nèi)標(biāo)液轉(zhuǎn)移可能帶來(lái)較大誤差，因此采用直接稱量樣品與內(nèi)標(biāo)配樣。

2.2內(nèi)標(biāo)物的選擇

合適的內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿足能與待測(cè)樣品同時(shí)溶于溶劑系統(tǒng)，并使參考峰與樣品峰分離，以及不與待測(cè)樣品相互作用等。根據(jù)依帕列凈的氫譜(圖1A)，選擇在7.5～8.5 ppm或4.7～6.5 ppm出現(xiàn)信號(hào)的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有研究，分別以鹽酸吉西他濱和齊多夫定作為內(nèi)標(biāo)物測(cè)定其氫譜(圖1B和C)。由兩圖可知，鹽酸吉西他濱和齊多夫定均有符合條件的信號(hào)可用作定量峰；且兩者的分子量與依帕列凈分子量接近，可減少稱量誤差。因此最終選用鹽酸吉西他濱和齊多夫定作為內(nèi)標(biāo)物。

圖1　待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物的1H NMR圖Fig.1　1H NMR spectra of analyte and the interral standardsA.empagliflozin,B.gemcitabine hydrochloride,C.zidovudine,D.mixture of empagliflozin and gemcitabine hydrochloride,E.mixture of empagliflozin and zidovudine；marked signals were selected for quantitative analysis

2.3定量峰的選擇

定量峰首先應(yīng)滿足在選定的積分范圍內(nèi)無(wú)干擾，在此基礎(chǔ)上應(yīng)選擇性質(zhì)相近的信號(hào)峰，當(dāng)有多個(gè)信號(hào)峰符合條件時(shí)，取其平均值，以減少誤差。依帕列凈和鹽酸吉西他濱混合后的氫譜見(jiàn)圖1D，δ6.78和δ4.91處的信號(hào)峰相對(duì)獨(dú)立，與鹽酸吉西他濱內(nèi)標(biāo)峰(δ8.08，δ6.16，δ6.06)無(wú)重合，因此選定δ6.78(2H，d)和δ4.91(1H，t)為依帕列凈的定量峰，δ8.08(1H，d),δ6.16(1H，d)和δ6.06(1H，t)為內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱的定量峰。依帕列凈和齊多夫定混合后的氫譜見(jiàn)圖1E，以齊多夫定為內(nèi)標(biāo)時(shí)，依帕列凈δ4.91附近的活潑質(zhì)子很難完全交換，因此選定δ6.74(2H，d)為依帕列凈的定量峰，δ7.75(1H，s),δ6.15(1H，t)為內(nèi)標(biāo)齊多夫定的定量峰。

2.4定量核磁共振參數(shù)的選擇

2.4.1脈沖延遲時(shí)間(d1)的選擇 共振峰面積與該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比是核磁共振定量的基礎(chǔ)，而保證這一基礎(chǔ)的前提是使自旋核達(dá)到完全弛豫。當(dāng)d1≥5T1(縱向弛豫時(shí)間)時(shí)，才可保障99%以上的自旋核達(dá)到完全弛豫[13]。分別設(shè)置d1為2，5，10，20，40 s進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，當(dāng)d1≥10 s時(shí)，樣品定量峰以及樣品與內(nèi)標(biāo)定量峰面積比值無(wú)明顯變化，因此最終選定延遲時(shí)間(d1)為20 s。

2.4.2采樣次數(shù)的選擇圖譜的信噪比與采樣次數(shù)的平方根成正比，核磁共振定量一般要求S/N≥250。分別考察采樣次數(shù)為2，4，8，16，32，64次的圖譜信噪比，結(jié)果表明，當(dāng)采樣次數(shù)為16，32和64次時(shí)，儀器信噪比均滿足定量要求。為了取得較高的信噪比并節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，最終選擇采樣次數(shù)為32次。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1專屬性依帕列凈供試品、內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱標(biāo)準(zhǔn)品、齊多夫定標(biāo)準(zhǔn)品，以及內(nèi)標(biāo)分別與依帕列凈混合溶液的核磁共振氫譜見(jiàn)圖1。結(jié)果表明混合溶液中樣品與內(nèi)標(biāo)各定量峰能夠完全分離，無(wú)雜質(zhì)及相互間干擾。

2.5.2線性及范圍分別精密稱取樣品約30.0，22.6，15.0，10.0，7.5 mg，內(nèi)標(biāo)齊多夫定9.0 mg或內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱10.0 mg，置于同一離心管中，按“1.2.1”方法平行配制5份樣品溶液，按“1.2.2”條件進(jìn)行測(cè)定。以(樣品/內(nèi)標(biāo))的摩爾比為橫坐標(biāo)(x)，定量峰面積比為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果顯示，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)時(shí)，樣品與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱和齊多夫定的摩爾比分別在0.512 5～1.953 8和0.494 7～1.966 0范圍內(nèi)，氫信號(hào)與樣品稱樣量成正比，回歸方程分別為y=0.009x-0.003和y=0.576x+0.026，相關(guān)系數(shù)(r2)均為0.999 9。表明所建立的核磁共振定量法線性關(guān)系良好。

2.5.3精密度精密稱取適量樣品和內(nèi)標(biāo)，按“1.2.2”測(cè)定條件分別在日內(nèi)和日間做6組測(cè)試。結(jié)果顯示，依帕列凈與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱峰面積(NRAS/NSAR) 的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.19%，日間RSD為0.28%；依帕列凈與內(nèi)標(biāo)齊多夫定峰面積(NRAS/NSAR) 的日內(nèi)RSD為0.31%，日間RSD為0.34%，方法的精密度良好。

2.5.4耐用性考察了采樣次數(shù)(ns=24～40)、溫度(T=298～308 K)及內(nèi)標(biāo)用量(IS±1 mg)變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)時(shí)，采樣次數(shù)、溫度和內(nèi)標(biāo)量的微小變化對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響均較小，表明該法的耐用性良好。

2.5.5穩(wěn)定性取同一供試品溶液分別在 0，2，4，8，12，18，24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，依帕列凈樣品與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱以及齊多夫定峰面積比值的RSD(n=7)分別為0.06%和0.16%，表明供試品溶液室溫放置 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6樣品測(cè)定

結(jié)果顯示，以鹽酸吉西他濱為內(nèi)標(biāo)測(cè)得依帕列凈供試品的含量為99.83%(n=3，RSD=0.06%)；以齊多夫定為內(nèi)標(biāo)測(cè)得依帕列凈供試品的含量為99.77%(n=3，RSD=0.19%)，兩種內(nèi)標(biāo)所測(cè)結(jié)果一致，表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

表1　依帕列凈(YPLJ)的含量測(cè)定結(jié)果Table 1　Absolute content of empagliflozin

3　結(jié)　論

本研究采用鹽酸吉西他濱和齊多夫定2種內(nèi)標(biāo)，以氘代二甲亞砜和重水混合液為溶劑，選取合適的1H-qNMR測(cè)試條件和定量峰，對(duì)依帕列凈供試品進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，2種內(nèi)標(biāo)所測(cè)結(jié)果一致，所建立的方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確，為依帕列凈原料藥的含量測(cè)定提供了一種新手段，有望為其質(zhì)量控制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Malla P，Kumar R，Mahapatra M K，Kumar M.Med.Res.Rev.，2014，34(6)：1146-1167.

[2]Zhao X，Cui Y M，Zhao S，Lang B，Broedl U C，Salsali A，Pinnetti S，Macha S.Clin.Ther.，2015，37(7)：1493-1502.

[3]Michel M C，Mayoux E，Vallon V.Naunyn-Schmiedeberg'sArch.Pharmacol.，2015，388(8):801-816.

[4]Tikkanen I，Narko K，Zeller C，Green A，Salsali A，Broedl U C，Woerle H J，Bajaj H S.Can.J.Diabetes，2013，37(S4):S30.

[5]Kovacs C S，Seshiah V，Merker L，Christiansen A V，Roux F，Salsali A，Kim G，Stella P，Woerle H J，Broedl U C.Clin.Ther.，2015，37(8):1773-1788e1.

[6]Haering H U，Merker L，Christiansen A V，Roux F，Salsali A，Kim G，Meinicke T，Woerle H J，Broedl U C.DiabetesRes.Clin.Pract.，2015，110(1)：82-90.

[7]Chen X L，Guo Y J，Hu Y J，Yu B Y，Qi J.J.Pharm.Biomed.Anal.，2016，124 ：281-287.

[8]Holzgrabe U，Deubner R，Schollmayer C，Waibel B.J.Pharm.Biomed.Anal.，2005，38(5)：806-812.

[9]National Pharmacopoeia Committee.ThePharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina(Part Ⅱ，2010 Ed．).Beijing:China Medical Science Press(國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.二部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社)，2010：81-83.

[10]Jiang M H，Yu X B，Mao L S，Shen W B，Di B.J.Chin.Pharm.Univ.(蔣孟虹，于小波，毛黎順，沈文斌，狄斌．中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2013，44(4)：339-342.

[11]Holzgrabe U.Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectrosc.，2010，57(2)：229-240.

[12]Guo Q S，Shi G Q，Song W，Xu X.J.Instrum.Anal.(郭強(qiáng)勝，石高旗，宋巍，許旭.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2012，31(1)：117-120.

[13]Bharti S K，Roy R.TrendAnal.Chem.，2012，35：5-26.

[14]Zhang F F，Jiang M H，Shen W B，Ding Y.J.NanjingNorm.Univ.:Eng.Technol.Ed.(張芬芬，蔣孟虹，沈文斌，丁婭．南京師范大學(xué)學(xué)報(bào):工程技術(shù)版)，2014，14(2):8-18.

[15]Kuchta K，Ortwein J，Hennig L，Rauwald H W.Fitoterapia，2014，96(12)：8-17.

[16]Hu M F，Jiang M，Qiu H，Wang L J，Wei Q.J.Instrum.Anal.(胡敏芳，江明，邱慧，王玲娟，魏強(qiáng).分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2013，32(12)：1511-1514.

Quantitative Determination of Empagliflozin by Nuclear Magnetic Resonance

SUN Lin-lin1，ZHANG Fen-fen2，SHEN Wen-bin3*，DING Ya1*

(1.Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China;2．Analysis and Testing Center，Donghua University，Shanghai201620，China;3.Pharmaceutical Research Institute，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China)

A method was established to determine the content of empagliflozin by1H nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H-NMR)，using gemcitabine hydrochloride and zidovudine as the internal standard，repectively.NMR spectra were recorded using a standard 1D pulse sequence at a 30° flip angle and with DMSO-d6-D2O as the solvent.Thirty two scans of 32 K data points were acquired at a temperature of 303 K，a relaxation delay of 20 s and a line broad of 0.3 Hz.Under the optimal conditions，method validation indicated specificity，robustness and stability up to 24 h.A good linear relationship was obtained between peak area ratio and molar ratio of empagliflozin to the internal standard.For gemcitabine，the regression equation wasy=0.009x-0.003(r2=0.999 9) with a molar ratio range of 0.512 5-1.953 8.For zidovudine，the regression equation wasy=0.576x-0.026(r2=0.999 9) with a molar ratio range of 0.494 7-1.966 0.The contents of empagliflozin were 99.83%(n=3，RSD=0.06%)and 99.77%(n=3，RSD=0.19%)corresponding to the internal standards gemcitabine hydrochloride and zidovudine，respectively.The results were consistent with each other，indicating that the method had the advantages of accuracy，high sensitivity and good repeatability，and could be used for the quantification of new drugs.

empagliflozin；quantitative NMR；gemcitabine hydrochloride；zidovudine

2016-03-01；

2016-03-22

沈文斌，副研究員，研究方向：核磁共振，Tel:025-83271233，E-mail：cpunmrswb@163.com

丁婭，博士，副教授，研究方向：納米藥物分析及有機(jī)光譜分析，Tel:025-83271326，E-mail：ayanju@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.015

O482.532；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1157-05