陳麗娟，費曉慶*，譚夢茹，吳　斌，沈崇鈺，張　睿，丁　濤，劉　蕓，楊功俊

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局　食品實驗室，江蘇　南京　210001;2.中國藥科大學　藥學院，江蘇　南京　211198)

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超高效液相色譜-高分辨質譜法測定蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安賽蜜與糖精鈉

陳麗娟1，費曉慶1*，譚夢茹2，吳斌1，沈崇鈺1，張睿1，丁濤1，劉蕓1，楊功俊2

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局食品實驗室，江蘇南京210001;2.中國藥科大學藥學院，江蘇南京211198)

建立了蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的超高效液相色譜-高分辨質譜分離測定方法。樣品采用甲醇-水溶液(10∶90)提取，Diamonsil Plus C18色譜柱進行色譜分離，以0.5 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇為流動相梯度洗脫，通過高分辨負離子掃描模式進行定性，外標法定量。結果表明，4種物質在0.02～2.0 mg/L范圍內均具有良好的線性關系，相關系數(shù)為0.998 7～0.999 7。苯甲酸、山梨酸的方法定量下限為0.5 mg/kg，安賽蜜、糖精鈉為0.3 mg/kg 。在低、中、高3個加標濃度下，方法的回收率為89.0%～104.0%，相對標準偏差(RSD)為2.0%～7.9%。該方法靈敏、簡單、快速，定性準確可靠，適用于大批量蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的檢測。

蜂蜜；高分辨質譜；超高效液相色譜；防腐劑；甜味劑

苯甲酸和山梨酸作為常見的防腐劑，因良好的防腐效果被廣泛用于各類食品中。雖然人體腎臟具有排毒功能，但長期且同時食用含有多種防腐劑的食物會對人體產生如貧血、神經系統(tǒng)的損壞和導致癌癥[1]等多種毒害作用。安賽蜜和糖精鈉作為非營養(yǎng)性甜味劑具有甜度高、用量少等特點，因而備受食品生產廠商青睞，但其安全性問題一直是消費者關注的焦點[2]。

一些不法廠家為降低成本，謀取利益，在糖漿中添加防腐劑、甜味劑、色素和香精，制成摻假蜂蜜，這種摻假行為嚴重干擾了蜂產品市場秩序。蜂蜜的產品標準GH/T 18796-2012中明確規(guī)定“蜂蜜中不得添加當前明確或者不明確的添加物”[3]。食品添加劑的限量標準GB 2760-2014中也規(guī)定了各類食品中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的使用限量[4]，但未對蜂蜜產品進行規(guī)定。已有的關于這4種物質的檢測標準中[5-9]，檢測的樣品基質包括醬油、果醬、飲料、乳制品、飼料等，并未涉及蜂蜜。所以亟需建立一種能夠快速、簡單地同時檢測蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的分析方法。

目前苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的主要檢測方法有紫外分光光度法、氣相色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法[10-16]。其中紫外分光光度法操作較簡單，但方法靈敏度較低，定量不準確，易造成假陽性結果。氣相色譜法具有較高的選擇性和靈敏度，但操作步驟繁瑣，需衍生，分析時間長。常規(guī)的高效液相色譜法和毛細管電泳法的操作耗時，檢出限相對較高。液相色譜-質譜法在食品檢測中應用較普遍，該法一般基于保留時間和質量數(shù)進行定性，接近保留時間和質量數(shù)的物質對被分析物質會存在干擾，可能導致假陽性。高分辨質譜利用一級質譜進行篩查，依靠提取精確質量數(shù)和保留時間進行定性，理論質量數(shù)與實際測得的質量數(shù)相對偏差越小，檢測結果可信程度越高，抗干擾能力越強，假陽性可能越低。目前使用高分辨質譜法同時檢測蜂蜜中防腐劑和甜味劑的研究尚未見文獻報道和標準方法發(fā)布。

本實驗采用甲醇-水溶液(10∶90)提取蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉，使用高分辨質譜同時檢測這4種物質，相對于紫外分光光度法、毛細管電泳法和高效液相色譜法，該方法的檢出限明顯降低，能夠滿足日常檢測要求且適合大批量樣品的快速檢測。采用本方法首次對國內純正蜂蜜樣本和抽檢樣本進行分析，從而為我國有關部門進一步開展蜂蜜的品質監(jiān)管工作提供了科學根據和數(shù)據基礎，在保護消費者利益方面具有重要作用。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜及DIONEX UltiMate 3000 超高效液相色譜儀(Thermo Fisher公司，美國)；Option-Q超純水儀(Elga公司，美國)。

甲醇、乙酸銨(色譜純，Merck公司)；苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉標準品(純度均大于99.0%，Dr.Ehrensorfer)；天然純正蜂蜜樣本共246個，來自國內蜂蜜企業(yè)和蜂農，油菜蜜36個、洋槐蜜33個、椴樹蜜29個、荊條蜜28個、百花蜜25個、棗花蜜22個、蕎麥蜜15個、葵花蜜13個、棉花蜜10個、進口蜂蜜35個(包括麥盧卡蜂蜜、桉樹蜜、黑森林蜜等)；市場抽檢蜂蜜共276個，來自國內各大超市及蜂蜜生產企業(yè)。

1.2溶液配制

單標儲備液：分別稱取標準品各25 mg(精確至0.01 mg)于25 mL容量瓶中，苯甲酸、山梨酸以乙醇定容，安賽蜜、糖精鈉以水定容，配成1.0 g/L標準儲備液，于4 ℃冷藏條件下保存。

混合標準工作溶液：準確量取適量的標準儲備液，用甲醇-水(10∶90)溶液逐級稀釋，得到20 mg/L的混合標準工作溶液，于4 ℃冷藏條件下保存。

1.3樣品前處理

準確稱取(1±0.01) g蜂蜜樣品于10 mL容量瓶中，用甲醇-水(10∶90)溶液定容至刻度，渦旋溶解混勻后，過0.22 μm聚醚砜濾膜，待測定。

1.4UPLC條件

色譜柱：Diamonsil Plus C18(5 μm×150 mm×4.6 mm，Dikma公司)；柱溫：室溫；流速：0.60 mL/min；進樣量：10 μL。流動相：0.5 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1～4 min，5%～90%B；4～6.5 min，90%B，6.5～7 min，90%～5%B；7～8 min，5%B。分析時間8 min。

1.5質譜條件

加熱源溫度300 ℃，毛細管溫度350 ℃，噴霧電壓3 000 V(負離子模式)，質量掃描范圍m/z100～1 000，一級質譜全掃描分辨率35 000，C-trap最大容量(AGC) 3×106，C-trap最長等待時間200 ms。

2　結果與討論

2.1前處理方法的優(yōu)化

由于本方法前處理簡單，在提取過程中添加劑幾乎無損失，所以對可能造成提取損失的濾膜進行優(yōu)化?？疾炝丝讖?.22 μm尼龍濾膜、0.45 μm聚醚砜濾膜、0.22 μm聚醚砜濾膜對4種化合物回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，此3種濾膜對苯甲酸、山梨酸基本無吸附作用；但0.22 μm尼龍濾膜對安賽蜜、糖精鈉有吸附，損失可達50%，其他兩種濾膜對這兩種物質無吸附作用?？紤]到保護儀器，實驗選擇0.22 μm聚醚砜濾膜。

圖1　苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜標準品的UPLC-Q Exactive 色譜圖Fig.1　Chromatograms of UPLC-Q Exactive for benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium and acesulfame-K standards

2.2色譜-質譜條件的優(yōu)化

高效C18柱是UPLC分析較常用的一類色譜柱，如Kinetex 2.6u C18(Phenomenex)、Atlantis T3(Waters)、Diamonsil Plus C18(Dikma)。實驗比較了這3種色譜柱對苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的分離效果，發(fā)現(xiàn)苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉在3種色譜柱上均可有效分離。但在實際檢測中，Kinetex 2.6u C18(Phenomenex)和Atlantis T3(Waters)的使用壽命較短，當樣品檢測數(shù)量較大時，使用15～20 d會出現(xiàn)峰形較差、嚴重拖尾以及分峰的現(xiàn)象，而相同檢測樣本數(shù)量下Diamonsil Plus C18(Dikma)的使用壽命可達4～5個月且價格低廉，因此，實驗最終選用Diamonsil Plus C18(Dikma)作為色譜分離柱(圖1)。

同時考察了使用乙腈作為流動相時的分離情況，該條件下苯甲酸和山梨酸的峰形過寬，拖尾嚴重；而改用甲醇作流動相后峰形明顯改善。使用純水作為流動相水相時，高濃度標準溶液的峰形不佳；以5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相水相時，峰形明顯改善，但出峰時間較晚，當乙酸銨濃度為0.5 mmol/L時，4種化合物的出峰時間明顯提前，繼續(xù)降低乙酸銨濃度至0.1 mmol/L時，安賽蜜、糖精鈉的出峰時間均在1 min內，不能有效保留。因此，實驗最終選用甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相。

由于本文考察的化合物或含有羥基(—OH)，或以K+，Na+鹽形式存在，在極性溶劑中，易失去H+，K+，Na+等離子，形成帶負電荷的基團，因此適合在負離子模式下檢測。用Q Exactive以全掃模式進樣分析，對得到的總離子流圖提取可能產生的離子質荷比，發(fā)現(xiàn)含Na+或K+的糖精鈉、安賽蜜會同時產生多個離子，選取質荷比響應最高的作為定量離子。由于本方法利用一級質譜進行篩查，依靠提取精確質量數(shù)進行定性，因此理論質量數(shù)與實際測得值的相對偏差越小，檢測結果可信程度越高。由于高分辨質譜為新開發(fā)儀器，目前暫無準確的定性偏差指標，所以將化合物實測質荷比(m/z)與理論值相差不超過±1×10-5定性為相同物質。陽性樣品可通過與標準物質的保留時間和精確質量數(shù)比對來進一步定性定量。4種化合物的UPLC-Q Exactive MS分析參數(shù)見表1。

表1　4種化合物的UPLC-Q Exactive MS分析參數(shù)Table 1　UPLC-Q Exactive MS parameters of four compounds

2.3線性關系、檢出限與定量下限

將20 mg/L的4種物質混合標準溶液稀釋配制成2.0,1.0,0.5,0.2,0.1,0.05,0.02 mg/L的系列標準溶液，在最佳條件下進行檢測，以標準品的峰面積(Y)為縱坐標，對應的質量濃度(X,mg/L)為橫坐標，繪制標準工作曲線。將4種物質的混合標準溶液不斷稀釋至信噪比S/N=3，以此進樣濃度為檢出限(LOD)，以10倍信噪比對應的加標水平為定量下限(LOQ)，結果見表2。4種物質在0.02～2.0 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(r2)不低于0.998 7，防腐劑苯甲酸和山梨酸的LOD和LOQ分別為0.2 mg/kg和0.5 mg/kg，甜味劑安賽蜜、糖精鈉的LOD和LOQ分別為0.1 mg/kg和0.3 mg/kg。

表2　4種化合物的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限Table 2　Regression equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs and LQDs of four compounds

2.4回收率與相對標準偏差

以陰性蜂蜜樣品加標的回收率考察方法的準確度，以回收率的相對標準偏差(RSD)考察方法的精密度。在陰性蜂蜜樣品中添加4種化合物混合標準溶液，加標水平分別為0.5，1.0，2.0 mg/kg，每個添加水平平行測定6個樣品，其回收率和RSD見表3。方法的平均回收率為89.0%～104.0%，RSD為2.0%～7.9%。說明本方法的精密度和準確度良好。

表3　蜂蜜樣品中4種化合物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3　Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of four compounds in blank honey(n=6)

2.5實際樣品分析

采用本方法對246個天然蜂蜜樣品和276個市場抽檢蜂蜜樣品進行分析。天然純正蜂蜜中有11個油菜蜜檢出苯甲酸，含量為0.6～1.3 mg/kg，而其他純正樣本均不含4種分析物，推測這是由于油菜對苯甲酸有一定的富集效應，但有待于進一步研究。市場抽檢蜂蜜樣品中有32個樣品檢出苯甲酸，含量為10.5～433.9 mg/kg，苯甲酸含量明顯高于上述純正油菜蜜；11個樣品檢出安賽蜜，含量為8.5～160.2 mg/kg。采用已有的蜂蜜摻假檢測技術標準[17]和實驗室內部方法對檢出苯甲酸和安賽蜜的市場抽檢樣品進行驗證，結果表明這些樣本均為摻假蜂蜜。

3　結　論

本文建立了一種簡單、準確、快速、靈敏、環(huán)境友好的超高效液相色譜-高分辨質譜測定蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜和糖精鈉的方法。高分辨質譜在樣品分析中能夠消除基質干擾，提高分析定性的準確性。該方法適用于蜂蜜中防腐劑和甜味劑的測定，用于蜂蜜實際樣品的檢測，能有效考察苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉在蜂蜜中的添加情況。

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Determination of Benzoic Acid，Sorbic Acid，Acesulfame-K and Saccharin Sodium in Honey by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

CHEN Li-juan1，F(xiàn)EI Xiao-qing1*，TAN Meng-ru2，WU Bin1，SHEN Chong-yu1，ZHANG Rui1,DING Tao1，LIU Yun1，YANG Gong-jun2

(1.Laboratory of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China；2.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing211198，China)

A method based on ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry was developed to separate benzoic acid，sorbic acid，acesulfame-K and saccharin sodium in honey.The targeted compounds in honey samples were extracted with methanol-water mixtures(10∶90),and separated on a Diamonsil Plus C18column with 0.5 mmol/L ammonium acetate-methanol as mobile phase by gradient elution.The qualitative and quantitative analyses were operated under t-MS2by high resolution mass spectrometry with the external standard method.The results indicated that four analytes had good linearities in the concentration range of 0.02-2.0 mg/L with correlation coefficients of 0.998 7-0.999 7.The quantilition limits for benzoic acid，sorbic acid,acesulfame-K and saccharin sodium were 0.5，0.5，0.3,0.3 mg/kg，respectively.The recoveries of four compounds at three spiked levels were in the range of 89.0%-104.0%，with relative standard deviations(RSDs) of 2.0%-7.9%.The method was simple and rapid，and was suitable for the determination of benzoic acid，sorbic acid and acesulfame-K，saccharin sodium in honey.

honey；high resolution mass spectrometry(HRMS)；ultra high performance liquid chromatography(UPLC)；preservative；sweetener

2016-03-11；

2016-04-06

國家質檢總局科技計劃項目(2015IK138)；江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(2015KJ31)；國家自然科學基金資助項目(21275162)

費曉慶，碩士，高級工程師，研究方向：食品分析與食品摻假鑒別，Tel：025-52345193，E-mail：dii01208@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.012

O657.63;S482.294

A

1004-4957(2016)09-1142-05