侯　捷，雷　雯，杜曉寧 ，任　征，岳韓笑

(上?；ぱ芯吭骸∩虾７€(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海　200062)

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氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析15N標記精氨酸發(fā)酵液中的氨基酸組分及其同位素豐度

侯捷，雷雯，杜曉寧*，任征，岳韓笑

(上?；ぱ芯吭荷虾７€(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海200062)

建立了精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸等15種氨基酸的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)檢測方法。以硅烷化試劑N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)為衍生化試劑對氨基酸進行衍生化，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，15種氨基酸均達到基線分離。結(jié)合混合陽離子(MCX)固相萃取柱對氨基酸發(fā)酵液實際樣品進行凈化，將所建立的方法用于15N標記精氨酸發(fā)酵液中的氨基酸組成(包括亮氨酸-15N、脯氨酸-15N、精氨酸-15N4、谷氨酰胺-15N和賴氨酸-15N2)分析，并根據(jù)EI圖譜的離子碎片信息對15N標記精氨酸發(fā)酵液中的氨基酸同位素豐度進行計算。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)；衍生化；氨基酸；15N標記氨基酸；同位素豐度

穩(wěn)定同位素15N標記的氨基酸作為一種安全、有效、方便的示蹤工具[1]，被用于醫(yī)學、定量蛋白質(zhì)組學等領(lǐng)域。在蛋白質(zhì)定量組學領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素15N標記的亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等[2]常用作細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術(shù)(SILAC)[3]的內(nèi)標試劑，SILAC技術(shù)具有標記穩(wěn)定，可動態(tài)研究蛋白質(zhì)組的變化情況等優(yōu)點[4]。目前，15N標記的氨基酸主要采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)。由于菌體復雜的代謝過程，采用發(fā)酵法生產(chǎn)目標氨基酸的同時難免會產(chǎn)生其它氨基酸。因此，發(fā)酵液中15N標記目標氨基酸的含量及其它氨基酸種類的確定對菌種選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和后期純化有著重要的指導作用[5]。傳統(tǒng)的氨基酸檢測方法常采用全自動氨基酸分析儀[6-8]、衍生化/高效液相色譜法[9-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]。然而，15N標記的氨基酸作為SILAC技術(shù)的示蹤劑，其15N同位素豐度是除純度外的另一關(guān)鍵指標[16]，傳統(tǒng)方法無法對其進行測定。采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)15N-精氨酸，發(fā)酵液中的15N-精氨酸含量可由坂口反應法測得[17]。鄭波等[16]采用電噴霧質(zhì)譜結(jié)合質(zhì)量重心法對試劑級15N標記氨基酸的同位素豐度進行了分析。由于發(fā)酵液的基質(zhì)較為復雜，對其中的15N標記精氨酸及發(fā)酵液中非目標氨基酸的準確檢測非常重要。本文采用GC-MS聯(lián)用法測定了15N標記精氨酸發(fā)酵液中氨基酸的組成及相應15N標記氨基酸同位素的豐度。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS，7890B-7000C，美國Agilent公司)；HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；電子天平(美國OHAUS，精度0.01 mg)；真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；冷凍干燥機(德國Marin Christ公司)；固相萃取裝置(德國CNW公司)；低溫高速離心機(韓國Heraeus公司)；超純水系統(tǒng)(美國Merck Millipore 公司)。

衍生化試劑：N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA，美國Regis Technologies公司)；MCX固相萃取小柱(3 mL/60 mg，德國CNW公司)；天然豐度氨基酸對照品：谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸(純度≥99%)，精氨酸鹽酸鹽、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、天門冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸(純度≥98.5%)，天冬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸(純度≥98%)，均購于上?；菖d生化試劑有限公司；穩(wěn)定同位素15N標記氨基酸：精氨酸鹽酸鹽-15N4(豐度98.03 atom%15N)、谷氨酸-15N(豐度98.11 atom%15N)、天冬氨酸-15N(豐度98.72 atom%15N)、苯丙氨酸-15N(豐度95.22 atom%15N)、亮氨酸-15N(豐度92.5 atom%15N)、異亮氨酸-15N(豐度96.88 atom%15N)、丙氨酸-15N(豐度98.70 atom%15N)、脯氨酸-15N(豐度98.08 atom%15N)純度均≥98%，纈氨酸-15N(豐度96.51 atom%15N)、天門冬酰胺-15N2(豐度99.53 atom%15N)、谷氨酸-15N(豐度98.11 atom%15N)、谷氨酰胺-15N2(豐度98.75 atom%15N)、絲氨酸-15N(豐度95.28 atom%15N)、蘇氨酸-15N(豐度98.51 atom%15N)純度均≥98.5%，甘氨酸-15N(純度≥99%，豐度98.10 atom%15N)，均為上海化工研究院穩(wěn)定同位素研究中心研制產(chǎn)品，同位素15N豐度由氣體同位素質(zhì)譜儀MAT 271測定，作為高豐度對照品使用；天然豐度精氨酸發(fā)酵液，15N標記精氨酸發(fā)酵液(上?；ぱ芯吭悍€(wěn)定同位素研究中心提供)；甲醇(HPLC級，Scharlab公司)；吡啶(分析純)、鹽酸(分析純)、氨水(試劑級)購自上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1氨基酸對照品的配制 天然豐度氨基酸對照品：稱取精氨酸1.2 mg，賴氨酸1.0 mg，谷氨酰胺1.0 mg，亮氨酸1.2 mg，異亮氨酸1.0 mg，天門冬酰胺1.4 mg，甘氨酸1.5 mg，丙氨酸1.5 mg，脯氨酸0.9 mg，蘇氨酸1.0 mg，谷氨酸1.0 mg，絲氨酸1.2 mg，苯丙氨酸0.8 mg，天冬氨酸1.2 mg，纈氨酸1.2 mg于2.0 mL的氣相進樣瓶中。于40 ℃真空干燥2 h，依次加入800 μL吡啶和800 μL MSTFA，于60 ℃下反應2 h，待GC-MS分析。15N標記氨基酸對照品的處理方法與天然豐度氨基酸對照品相同。

1.2.2發(fā)酵液的處理15N標記精氨酸發(fā)酵液處理：取5 mL15N精氨酸發(fā)酵液于10 mL離心管中，4 000 r/min離心30 min，取上清液加入HCl調(diào)至pH 2.86，再以4 000 r/min離心10 min，取出上清液待凈化。

活化處理固相萃取小柱，將待凈化的發(fā)酵液1 mL轉(zhuǎn)移至柱中，加5 mL去離子水淋洗，0.2 mol/L氨水進行洗脫，收集流出液。將收集液于-65 ℃的冷凍干燥機中進行凍干后，40 ℃真空干燥2 h，依次加入800 μL吡啶和800 μL MSTFA，60 ℃下反應2 h，待GC-MS分析。

1.2.3實驗條件色譜條件：色譜柱：Agilent HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He氣(純度99.999%)，流速1.0 mL/min；進樣口溫度290 ℃；升溫程序：以5 ℃/min由80 ℃升至110 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，最后以20 ℃/min升至300 ℃；進樣量0.1 μL；分流比20∶1。

質(zhì)譜分析條件：電子轟擊離子源(EI)，電離能量70 eV；全掃描(Scan)模式，掃描范圍m/z50～500；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度300 ℃。

2　結(jié)果與討論

2.1固相萃取(SPE)條件的優(yōu)化

2.1.1SPE小柱的選擇對比了兩種陽離子交換SPE小柱(SCX和MCX小柱)對精氨酸發(fā)酵液的純化效果。選取MCX小柱和SCX小柱對1 mg/mL的氨基酸混合溶液(15種氨基酸)富集凈化后進行測試，結(jié)果表明，MCX小柱所需洗脫液體積為4 mL，而SCX小柱則需9 mL，前者的回收率為83.4%～94.6%，后者的回收率為82.1%～95.4%。

SCX為最強的陽離子交換小柱，其官能團為苯磺酸，除了陽離子交換外，非極性的苯環(huán)在對精氨酸發(fā)酵液凈化過程中也會產(chǎn)生非極性吸附的作用。MCX小柱的基質(zhì)為苯乙烯-二乙烯苯共聚物，聚合物表面有親水性和疏水性基團，具有良好的水浸潤性。實驗結(jié)果顯示，SCX和MCX小柱對精氨酸發(fā)酵液具有相同的純化效果，但由于SCX小柱對氨基酸的結(jié)合能力強，需要更多體積的氨水才可將氨基酸全部洗脫，實驗時間較長。因此選擇MCX小柱對精氨酸發(fā)酵液進行凈化。

2.1.2發(fā)酵液的酸堿度調(diào)節(jié)氨基酸屬于兩性極性化合物，當氨基酸溶液的pH值低于其等電點時，氨基酸帶正電。天冬氨酸為酸性最強的氨基酸，其等電點為2.85，當發(fā)酵液的pH值低于2.85時，發(fā)酵液中的氨基酸均帶有正電荷，可被MCX固相萃取小柱所吸附，從而達到凈化目的。為使全部的氨基酸帶上正電荷進而與MCX小柱上的離子進行交換，在處理精氨酸發(fā)酵液實際樣品時，將發(fā)酵液的pH值調(diào)至2.8左右。

2.1.3淋洗液、洗脫液的選擇氨基酸發(fā)酵液經(jīng)離心后，其組分均為可溶性物質(zhì)但成分復雜。因此，在SPE上樣后用超純水進行淋洗。與NaOH和NH4Cl相比，使用氨水作為洗脫劑對保留在SPE小柱上的氨基酸進行洗脫，不會引入鹽類雜質(zhì)，且可有效保護GC-MS聯(lián)用儀，根據(jù)離子交換樹脂的交換機理，當精氨酸完全被洗脫時，其他氨基酸也完全被洗脫下來。

2.2氨基酸對照品的檢測

2.2.1天然豐度氨基酸與15N標記氨基酸的GC-MS圖譜分析圖1為MSTFA與賴氨酸的反應示意圖。MSTFA是一種硅烷化試劑，在硅烷化反應進程中，四甲基硅烷(TMS)將取代氨基酸中含有活性氫的基團，衍生后的氨基酸沸點降低，極性降低，具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖1　賴氨酸與MSTFA的衍生反應Fig.1　Derivatization reaction of lysine with MSTFA

在優(yōu)化的氣相色譜條件下，15種天然豐度氨基酸達到基線分離。將氨基酸衍生物的離子碎片信息在NIST譜庫中進行匹配，其出峰順序為：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸。天然豐度氨基酸對照品和15N標記氨基酸對照品衍生物的GC-MS總離子流圖如圖2所示。

圖2　天然豐度氨基酸對照品(A)和15N標記氨基酸對照品(B)衍生物的GC-MS總離子流圖Fig.2　Total ion chromatograms of natural abundance(A) and high abundance 15N labeling(B) reference substance derivatives 1：alanine；2：valine；3：leucine；4：isoleucine；5：proline；6:glycine；7：serine；8：threonine；9：aspartic acid；10：arginine； 11：glutamate；12：phenylalanine；13：asparagine；14：glutamine；15：lysine；*derivatization byproducts

通過對GC-MS的總離子流圖做進一步解析，可得到每種氨基酸衍生物的EI圖譜信息。根據(jù)氨基酸衍生物的出峰時間以及離子碎片信息，對15N標記的氨基酸衍生物進行定性分析。以亮氨酸為例，天然豐度的亮氨酸出峰時間為10 min，基峰為m/z158，EI質(zhì)譜圖如圖3A所示；15N標記亮氨酸的出峰時間與天然豐度相同，且只有1個N被15N所取代，其基峰為m/z159，如圖3B所示。

圖3　天然豐度亮氨酸(A)和15N標記亮氨酸(B)的EI圖譜Fig.3　Electron impact(EI) spectra of natural leucine(A) and high abundance 15N labeling leucine(B)

天然豐度氨基酸和15N標記氨基酸具有相同的色譜行為，出峰時間相同。由于氨基酸中的N被15N取代的個數(shù)不同，從而具有不同的特征離子碎片(見表1)。

表1　天然豐度氨基酸和15N標記氨基酸對照品的離子碎片信息和出峰時間Table 1　Characteristic fragment and retention time of natural amino acids and high abundance 15N labeling amino acids

圖4　天然豐度精氨酸發(fā)酵液的TIC圖Fig.4　Total ion chromatogram of natural abundance fermentation broth of arginine1:leucine；2:isoleucine；3：arginine；4：glutamine；5：lysine

2.3天然豐度精氨酸發(fā)酵液中的氨基酸組分分析

采用優(yōu)化的SPE固相萃取條件，對天然豐度精氨酸發(fā)酵液進行前處理和衍生化后進樣分析。天然豐度精氨酸發(fā)酵液的總離子流圖如圖4所示，根據(jù)氨基酸衍生物的出峰時間及NIST譜庫匹配結(jié)果可以得出，天然豐度精氨酸發(fā)酵液中含有亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸5種氨基酸。從圖4可以看出，MCX固相萃取小柱對精氨酸發(fā)酵液的分離純化效果較為理想。

圖5　15N標記精氨酸發(fā)酵液的TIC圖 Fig.5　Total ion chromatogram of high abundance fermentation broth of labeling arginine1：leucine-15N；2：proline-15N；3：arginine-15N4；4：glutamine-15N；5：lysine-15N2

2.415N標記精氨酸發(fā)酵液中氨基酸組分分析及豐度計算

采用與天然豐度精氨酸發(fā)酵液相同的SPE固相萃取條件對15N標記精氨酸發(fā)酵液進行凈化。圖5為15N標記精氨酸發(fā)酵液的總離子流圖。通過圖2B的出峰時間以及表1的特征離子碎片進行定性，可知15N精氨酸發(fā)酵液中含有亮氨酸-15N、脯氨酸-15N、精氨酸-15N4、谷氨酰胺-15N和賴氨酸-15N25種氨基酸。

根據(jù)氨基酸衍生物EI圖譜的特征碎片對15N標記氨基酸的同位素豐度進行計算[18]，上述5種標記氨基酸的豐度依次為98.02%，96.36%，98.36%，95.28%以及98.53%。

3　結(jié)　論

通過優(yōu)化固相萃取條件，成功建立了固相萃取-衍生化/GC-MS聯(lián)用測定氨基酸發(fā)酵液實際樣品中15種氨基酸的方法。根據(jù)EI圖譜的離子碎片信息，對15N標記精氨酸發(fā)酵液中的亮氨酸-15N、脯氨酸-15N、精氨酸-15N4、谷氨酰胺-15N和賴氨酸-15N2的同位素豐度進行計算。該方法為氨基酸發(fā)酵液后期的分離純化和高豐度氨基酸的回收提供了指導依據(jù)。此外，該方法還可應用于食品、生物等領(lǐng)域氨基酸的檢測。

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Determination of15N Labeled Arginine Fermentation Broth and Isotope Abundance by GC-M

SHOU Jie，LEI Wen，DU Xiao-ning*,REN Zheng,YUE Han-xiao

(Shanghai Research Institute of Chemical Industry，Shanghai Engineering and Technological Research Centre for Stable Isotope，Shanghai200062,China)

A method for the determination of arginine，lysine，serine，valine and other eleven amino acids was developed by MSTFA derivatization combined with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)，and fifteen amino acids reached the baseline separation.The arginine fermentation broth was purified by cationic exchange mixed-solid phase extraction(SPE)， and then detected successfully by the developed method.Finally the15N isotope abundance was calculated by characteristic fragment.

gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);derivatization;amino acids;15N labeled amino acids;isotope abundance

2016-01-26；

2016-03-01

科技部“十二五”支撐計劃項目(2015BAK45B-20);上海市科委標準專項(15DZ0504701)；上海市科委地方攻關(guān)計劃項目(14DZ0511800)

杜曉寧，教授級高工，研究方向：穩(wěn)定同位素化學，Tel：13816255065，E-mail：xiaoningdu@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.010

O657.63;O629.7

A

1004-4957(2016)09-1132-05