周長朋，王東武，張曼玉，許　潔，鄭文鳳

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術中心，山東　威?！?64205)

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高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀測定鹽酸決奈達隆中兩種基因毒性雜質的痕量殘留

周長朋*，王東武，張曼玉，許潔，鄭文鳳

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術中心，山東威海264205)

建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀(HPLC-QTRAP-MS/MS)測定鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質(雜質C和D)痕量殘留的分析方法。鹽酸決奈達隆藥物以0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)溶解后，分別采用Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)或YMC Pack-CN色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)進行分離，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動相分別進行梯度洗脫，電噴霧正離子(ESI+)掃描方式下選擇離子監(jiān)測(SRM)模式對樣品進行檢測。結果表明，雜質C和D在1.0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，檢出限(S/N=3)分別為0.20 μg/L和0.30 μg/L，定量下限(S/N=10)分別為0.80 μg/L和1.0 μg/L。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質痕量殘留的測定。

高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀；基因毒性雜質；鹽酸決奈達??；殘留

鹽酸決奈達隆(Dronedarone hydrochloride)，化學名為N-[2-丁基-3-[4-[3-(二丁基氨基)丙氧基]苯甲?；鵠-5苯并呋喃基]甲磺酰胺鹽酸鹽(合成路線見圖1)，是由法國賽諾菲-安萬特公司開發(fā)的極化抑制劑，2009年7月首次在美國上市[1-2]。該物質是一種多通道阻滯劑，可同時抑制Na，K，Ca的離子通道，并具有β受體拮抗作用，可通過降低竇房結的自律性、減慢傳導速度、延長動作電位時程和延長QT-QTC間期而產(chǎn)生抗心律失常作用，適用于心房顫動和心房撲動患者的心律控制、維持竇性心律和減慢室性心律[3]。該藥與胺碘酮(Amiodarone)具有類似的電生理作用，但其親脂性低，對甲狀腺及甲狀腺激素影響較小，無明顯的心臟毒性，是新型的抗心律失常藥物[4-5]。

基因毒性雜質在很低的濃度下即可誘導基因突變導致染色體斷裂和重排，具有潛在的致癌毒性[6]，現(xiàn)已引起廣泛關注。國外已有多篇文獻報道利用液相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測藥物中的基因毒性雜質[7-8]，國內(nèi)也有利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀[9-10]、液相色譜-質譜聯(lián)用儀[11-12]等監(jiān)控基因毒性雜質的方法報道。鹽酸決奈達隆合成過程中產(chǎn)生的雜質C和D具有苯胺和硝基結構，依照歐盟基因毒性雜質指導原則[13]，二者均屬于潛在基因毒性雜質，需在產(chǎn)品中加以控制?；蚨拘噪s質限度為1.5 μg/d，1 d的服藥量為800 mg，故雜質C和D的限度為1.875 μg/g，普通的液相色譜法測定很難達到限度[13-14]，國內(nèi)也未見利用液相色譜-質譜聯(lián)用儀進行監(jiān)控的報道。

四極桿-線性離子阱(QTRAP)質譜儀是混合型串聯(lián)質譜，既保留了四極桿傳統(tǒng)的定量功能，又可通過多級碎裂提供化合物的結構信息，具有高靈敏度和高特異性的特點，現(xiàn)已廣泛應用于食品、藥品、環(huán)境等領域[15-20]。本文基于高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)技術，通過高分辨掃描后定性分析質譜圖，并結合對照品定位確定了鹽酸決奈達隆藥物中的兩種基因毒性雜質的結構，同時建立了測定鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質的分析方法。該方法簡單、快速，回收率好、靈敏度高，填補了國內(nèi)鹽酸決奈達隆藥物中基因毒性雜質檢測研究的空白，有利于對鹽酸決奈達隆藥物合成過程中的質量參數(shù)進行有效監(jiān)測。

圖1　鹽酸決奈達隆的合成路線圖Fig.1　Graphical synthetic route of dronedarone hydrochloride

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Thermo LTQ-XL型高效液相色譜-四極桿/離子阱質譜儀：配有電噴霧離子源；超聲波清洗機(昆山超聲儀器公司)；精密分析天平(OHAUS DV215CD)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；0.22 μm有機系濾膜(上海津騰公司)。

雜質C、雜質D對照品(迪沙藥業(yè)集團有限公司，純度≥99%)；甲醇、乙腈(色譜級，德國Merck公司)；甲酸(優(yōu)級純，天津大茂化學試劑廠)；實驗用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·m)；鹽酸決奈達隆藥品粗品和精品(迪沙藥業(yè)集團有限公司)。

1.2溶液的制備

對照品溶液：取雜質C和D約10 mg，精密稱定至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后，用乙腈定容至刻度，混勻，配制成1.0 g/L的標準儲備液，-18 ℃避光保存。取適量標準儲備液，用乙腈配制成10.0 mg/L的標準中間液，作為對照品溶液，4 ℃避光保存。

定性分析溶液：取鹽酸決奈達隆粗品約10 mg，精密稱定至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后再加入0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)定容。

供試品溶液：取鹽酸決奈達隆精品約10 mg，精密稱定至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后再加入0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)定容。以上溶液均需過0.22 μm濾膜后進行質譜分析。

1.3色譜條件

1.3.1定性檢測色譜條件Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)；流動相：A相為0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：0.2 mL/min，等度洗脫(0～12 min，40%B)；柱溫35 ℃；進樣體積為1.0 μL。

1.3.2雜質C定量檢測色譜條件Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：0.2 mL/min，梯度洗脫：0～1.0 min，15%B；1.0～5.0 min，15%～80% B；5.0～12.0 min，80%～15% B；柱溫35 ℃；進樣體積為10 μL。

1.3.3雜質D定量檢測色譜條件YMC-Pack CN色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：1.0 mL/min(柱后1∶4分流)，等度洗脫(0～15 min，50%B)；柱溫35 ℃；進樣體積為10 μL。

1.4質譜條件

1.4.1定性檢測質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：全掃描監(jiān)測(SCAN)；掃描范圍：100～1 000；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣(Sheath gas)：35 L/min；輔助氣(Aux gas)：15 L/min；毛細管電壓：3 500 V。

表1　雜質C和D的保留時間與質譜條件Table 1　Retention times and optimized spectrometric parameters of impurity C and impurity D

*quantification ion pairs

1.4.2定量檢測質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇離子監(jiān)測(SRM)；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣：35 L/min；輔助氣：15 L/min；毛細管電壓：3 500 V；定量方式：外標法定量。具體質譜條件見表1。

2　結果與討論

2.1定性分析與雜質結構確定

按照“1.3.1”和“1.4.1”條件制備定性分析溶液并進行檢測，得到鹽酸決奈達隆粗品的紫外色譜圖和質譜離子流圖(見圖2)，由圖可見主峰后有兩個雜質峰較為明顯(峰2和峰3)，并得到峰2和峰3的精確質荷比分別為m/z509.312 0和m/z479.413 0。通過儀器MassFrontier軟件計算同位素位置和豐度比，得到兩種離子的元素組成分別為C30H41N2O5+和C30H43N2O3+，即為C30H40N2O5和C30H42N2O3的[M+H]+信號。C30H40N2O5和C30H42N2O3的分子式分別與雜質C和D的分子式一致，將雜質C和D的對照品溶液按照上述條件檢測后比對，保留時間和質荷比與峰2和峰3也完全一致，可判斷峰2和峰3分別為雜質C和D，并在后期開展兩種雜質的定量檢測工作。

圖2　鹽酸決奈達隆粗品的色譜圖及峰2、峰3的全掃描質譜圖Fig.2　Chromatograms of dronedarone hydrochloride and scan mass spectra of peak 2 and peak 3

2.2定量檢測色譜條件的選擇

在相近的色譜條件下，考察了Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)、Thermo Hypersil-C18色譜柱(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)和Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)的分離情況。結果顯示，在3種色譜柱上均能實現(xiàn)鹽酸決奈達隆主峰和雜質C、雜質D的良好分離，且兩種雜質的峰形均較好。但紫外圖譜顯示，鹽酸決奈達隆主峰在后兩種色譜柱上拖尾較為明顯；進一步考察回收率時發(fā)現(xiàn)，在后兩種色譜柱上雜質C的回收率明顯降低。利用Agilent Extend-C18色譜柱能有效分離雜質C和主峰，且鹽酸決奈達隆主峰無明顯拖尾現(xiàn)象，雜質C峰形好、回收率高，故本文采用Agilent Extend-C18色譜柱檢測鹽酸決奈達隆中雜質C的殘留。

通過回收率實驗發(fā)現(xiàn)雜質D在上述3種色譜柱上分離檢測后回收率均很低，調(diào)節(jié)梯度洗脫濃度使主峰和雜質D分離度增大后回收率也無明顯改善，可能的原因是鹽酸決奈達隆高濃度主峰對雜質D有強烈的離子抑制效應。嘗試利用氰基柱(YMC-Pack CN色譜柱)對二者進行分離，雜質D在鹽酸決奈達隆主峰前2 min出峰，峰形較好；回收率實驗進一步表明，雜質D在主峰前出峰時的回收率良好，基本在80%以上，故本文采用氰基柱(YMC-Pack CN色譜柱)檢測鹽酸決奈達隆中雜質D的殘留。

2.3質譜條件的選擇

采用電噴霧離子源，在正離子模式下，對1.0 mg/L雜質C和雜質D標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子[M+H]+峰(m/z509.3和479.4)；對分子離子峰進行子離子掃描，得到二級質譜圖，篩選響應值較高、基線噪音低的兩個離子作為定性離子對。采用SRM模式采集數(shù)據(jù)，駐留時間設定為100 ms，優(yōu)化各離子的碰撞能，得到最佳質譜條件如表1所示。

2.4線性范圍、檢出限及定量下限

以0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)配制0，1.0，5.0，10，20，50 μg/L的雜質C和雜質D標準系列溶液分別進行測定，以定量離子峰面積對質量濃度進行線性回歸。結果表明，雜質C和雜質D在1.0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好(r>0.998)；以S/N=3計算檢出限分別為0.20 μg/L和0.30 μg/L；以S/N=10計算定量下限分別為0.80 μg/L和1.0 μg/L。方法的靈敏度完全滿足依照歐盟基因毒性雜質指導原則計算的1.875 μg/L的雜質限度。

2.5回收率實驗

采用不含雜質C和雜質D的鹽酸決奈達隆精品為空白基質，添加80%限度、100%限度、120%限度濃度的雜質C和雜質D分別做回收率實驗，平均回收率分別為87.8%～96.8%和82.0%～88.0%，相對標準偏差(RSD)分別為1.5%～5.0%和2.0%～2.7%(見表2)。

表2　鹽酸決奈達隆中添加雜質C和雜質D的回收率與相對標準偏差Table 2　Recoveries ans RSDs of impurity C and impurity D in dronedarone hydrochloride

圖3鹽酸決奈達隆中含雜質C(A)和雜質D(B)的陽性樣品總離子流圖(TIC)

Fig.3Total ion chromatograms(TIC) of positive samples with impurity C(A) and impurity D(B) in dronedarone hydrochloride

2.6實際應用

將所建方法應用于合成的鹽酸決奈達隆藥物小試3批、中試3批及工藝驗證3批共9份樣品的檢測，檢出2批含有雜質C殘留，含量分別為3.42 mg/kg和1.93 mg/kg；6批含有雜質D殘留，含量為3.82～148.2 mg/kg，其他樣品均未檢出。陽性樣品的色譜圖見圖3。

3　結　論

本文建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜儀(HPLC-QTARAP-MS/MS)測定鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質(雜質C和雜質D)痕量殘留的分析方法。利用線性離子阱質譜的高分辨掃描功能聯(lián)合對照品定性成功確定了兩種雜質結構，并建立了定量檢測方法。該方法靈敏度高、分離度好，回收率、精密度及定量下限均能滿足基因毒性雜質限度的要求，是檢測鹽酸決奈達隆藥品中兩種基因毒性雜質痕量殘留的有效方法。將所建方法應用于合成的鹽酸決奈達隆藥物樣品的檢測，共檢出2批樣品含有雜質C，6批樣品含有雜質D，有效指導了鹽酸決奈達隆合成反應的進行。

[1]He X Q，Wu T Z，Zhang F L，Xie M H.Chin.J.Pharm.(何曉清，吳泰志，張福利，謝美華.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2010，41(2)：148-151.

[2]Wang G，Zhang F L，Wang J J，Li J Q.Chin.J.Pharm.(王冠，張飛龍，王佳靜，李建其.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2011，42(12)：881-883.

[3]Xu L F，Jiang M J，Liu J，Wang X J，Wang Y，Chen Y，Zhou Y P.J.LiaoningUniv.:Nat.Sci.Ed.(徐利鋒，姜明俊，劉舉，王雪嬌，王洋，陳燁，周云鵬.遼寧大學學報:自然科學版)，2012，39(2)：103-109.

[4]Liu J，Qin Y W.J.Pharm.CareRes.(劉璟，秦永文.藥學服務與研究)，2008，8(6)：417-420.

[5]Li F，Tian S H，Song X F，Li W Y，Cheng H Y，Lei L Z，Zhu Q F，Jin C H，Li S H.Chem.J.Chin.Univ.(李峰，田拴紅，宋曉峰，李文遠，程花英，雷靈芝，朱勤豐，金春華，李少華.高等學?；瘜W學報)，2013，34(4)：858-862.

[6]Ma L，Ma Y N，Chen Z，Jiang Y.Chin.J.NewDrugs(馬磊，馬玉楠，陳震，蔣煜.中國新藥雜志)，2014，23(18)：2106-2111.

[7]Vijaya Bhaskar Reddy A，Venugopal N，Madhavi G，Gangadhara Reddy K，Madhavi V.J.Pharm.Biomed.Anal.，2013，84：84-89.

[8]Venugopal N，Vijaya Bhaskar Reddy A，Gangadhar Reddy K，Madhavi V，Madhavi G.J.Pharm.Biomed.Anal.，2012，70：592-597.

[9]Ding Y M，Wu J，Lu C X，Cui P，Wang D C.Chin.J.Pharm.(丁逸梅，吳娟，陸春曉，崔萍，王德才.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2014，45(11)：1069-1071.

[10]Liu L Y，Zhang Q R，Sun L F，Wang M M，Guo W M.Chin.J.Pharm.(劉立云，張倩如，孫連福，王曼曼，郭文敏.中國藥師)，2014，17(8)：1274-1276.

[11]Zhang L，Huang L N，Li Q R，Yang W H.Chin.J.Pharm.Anal.(張莉，黃麗娜，黎其榮，楊偉涵.藥物分析雜志)，2015，35(2)：317-319.

[12]Liu J H，Zhong Y N，Xiong Y，He W T.Chin.J.Pharm.Anal.(劉俊華，鐘雅妮，熊淵，赫渦濤.藥物分析雜志)，2013，33(7)：1168-1170.

[13]European Medicines Agency．Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities[EB/OL].http://www.ema.eu- ropa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002903.pdf，2006-06-28/2013-12-13.

[14]Jin P F，Liang X L，Li Q，Zou D，Ma J，Hu X.Chin.J.Pharm.Anal.(金鵬飛，梁曉麗，李瓊，鄒定，馬捷，胡欣.藥物分析雜志)，2013，33(3)：450-453.

[15]Luo Y Y，Liu J X，Liu X H，Lan C W，Hou Y，Ma Y，Xu L.J.Instrum.Anal.(羅益遠，劉娟秀，劉訓紅，蘭才武，侯婭，馬陽，徐力.分析測試學報)，2015，34(5)：519-524.

[16]Zhou Y，Zhao Y G，Zhang B B，Zhang Y，Chen G S.Chin.J.Anal.Chem.(周巖，趙永剛，張蓓蓓，章勇，陳國松.分析化學)，2014，42(3)：367-374.

[17]Ruan X L，Zhang A H，Wu C，Rong W F，Huang S L.J.Instrum.Anal.(阮小林，張愛華，吳川，戎偉豐，黃淑蓮.分析測試學報)，2011，30(1)：72-75.

[18]Yang J J，Wu S Q，Tong L，Song S L，Tian Q.J.Instrum.Anal.(楊佳佳，吳淑琪，佟玲，宋淑玲，田芹.分析測試學報)，2011，30(4)：374-380.

[19]Liu J，Zhang M，Wan Y，Wu H M，Hou Y N，Zheng L M，Yin Y X.Chin.J.Anal.Chem.(劉佳，張朦，萬有，吳紅梅，侯艷寧，鄭樂民，尹玉新.分析化學)，2014，43(8)：1118-1124.

[20]Zhang H W，Jian H M，Lin L M，Chen L Z，Liang C Z，Yuan T，Tang Z X，Cai X，Qin L Y.J.Instrum.Anal.(張鴻偉，簡慧敏，林黎明，陳亮珍，梁成珠，袁濤，湯志旭，蔡雪，秦良勇.分析測試學報)，2012，31(7)：763-770.

Determination of Two Genotoxic Impurities Residues in Dronedarone Hydrochloride by HPLC-QTRAP-MS/MS

ZHOU Chang-peng*，WANG Dong-wu，ZHANG Man-yu，XU Jie，ZHENG Wen-feng

(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai264205，China)

A high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the determination of two potential genotoxic impurities(impurity C and impurity D) residues in dronedarone hydrochloride.After extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile(20∶80)，the dronedarone hydrochloride samples were separated on an Agilent Extend-C18column(1.8 μm,2.1 mm×50 mm) or a YMC Pack-CN column(5 μm,4.6 mm× 250 mm) with two mobile phases of 0.1% formic acid and acetonitrile.The detection of analytes was performed in the positive mode and selective reaction monitoring(SRM) mode.As a result，the calibration curves of impurity C and impurity D showed good linearity in the range of 1.0-50 μg/L.The limits of detection(S/N=3) were 0.20 μg/L and 0.30 μg/L,respectively.The limits of quantitation(S/N=10)were 0.80 μg/L and 1.0 μg/L，respectively.The method has the advantages of simple operation，high sensitivity，good reproducibility，and could be used for the detection of two genotoxic impurities residues in dronedarone hydrochloride.

high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS);potential genotoxic impuritie；dronedarone hydrochloride；residues

2016-02-02；

2016-02-19

周長朋，工程師，研究方向：理化檢測及藥物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：20019568@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.006

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1111-05