周長朋，王東武，張曼玉，許　潔，鄭文鳳

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術(shù)中心，山東　威?！?64205)

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高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀測定鹽酸決奈達隆中兩種基因毒性雜質(zhì)的痕量殘留

周長朋*，王東武，張曼玉，許潔，鄭文鳳

(迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術(shù)中心，山東威海264205)

建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-QTRAP-MS/MS)測定鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質(zhì)(雜質(zhì)C和D)痕量殘留的分析方法。鹽酸決奈達隆藥物以0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)溶解后，分別采用Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)或YMC Pack-CN色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)進行分離，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動相分別進行梯度洗脫，電噴霧正離子(ESI+)掃描方式下選擇離子監(jiān)測(SRM)模式對樣品進行檢測。結(jié)果表明，雜質(zhì)C和D在1.0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限(S/N=3)分別為0.20 μg/L和0.30 μg/L，定量下限(S/N=10)分別為0.80 μg/L和1.0 μg/L。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的測定。

高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀；基因毒性雜質(zhì)；鹽酸決奈達隆；殘留

鹽酸決奈達隆(Dronedarone hydrochloride)，化學(xué)名為N-[2-丁基-3-[4-[3-(二丁基氨基)丙氧基]苯甲?；鵠-5苯并呋喃基]甲磺酰胺鹽酸鹽(合成路線見圖1)，是由法國賽諾菲-安萬特公司開發(fā)的極化抑制劑，2009年7月首次在美國上市[1-2]。該物質(zhì)是一種多通道阻滯劑，可同時抑制Na，K，Ca的離子通道，并具有β受體拮抗作用，可通過降低竇房結(jié)的自律性、減慢傳導(dǎo)速度、延長動作電位時程和延長QT-QTC間期而產(chǎn)生抗心律失常作用，適用于心房顫動和心房撲動患者的心律控制、維持竇性心律和減慢室性心律[3]。該藥與胺碘酮(Amiodarone)具有類似的電生理作用，但其親脂性低，對甲狀腺及甲狀腺激素影響較小，無明顯的心臟毒性，是新型的抗心律失常藥物[4-5]。

基因毒性雜質(zhì)在很低的濃度下即可誘導(dǎo)基因突變導(dǎo)致染色體斷裂和重排，具有潛在的致癌毒性[6]，現(xiàn)已引起廣泛關(guān)注。國外已有多篇文獻報道利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測藥物中的基因毒性雜質(zhì)[7-8]，國內(nèi)也有利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[9-10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[11-12]等監(jiān)控基因毒性雜質(zhì)的方法報道。鹽酸決奈達隆合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)C和D具有苯胺和硝基結(jié)構(gòu)，依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則[13]，二者均屬于潛在基因毒性雜質(zhì)，需在產(chǎn)品中加以控制。基因毒性雜質(zhì)限度為1.5 μg/d，1 d的服藥量為800 mg，故雜質(zhì)C和D的限度為1.875 μg/g，普通的液相色譜法測定很難達到限度[13-14]，國內(nèi)也未見利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行監(jiān)控的報道。

四極桿-線性離子阱(QTRAP)質(zhì)譜儀是混合型串聯(lián)質(zhì)譜，既保留了四極桿傳統(tǒng)的定量功能，又可通過多級碎裂提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，具有高靈敏度和高特異性的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境等領(lǐng)域[15-20]。本文基于高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù)，通過高分辨掃描后定性分析質(zhì)譜圖，并結(jié)合對照品定位確定了鹽酸決奈達隆藥物中的兩種基因毒性雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，同時建立了測定鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質(zhì)的分析方法。該方法簡單、快速，回收率好、靈敏度高，填補了國內(nèi)鹽酸決奈達隆藥物中基因毒性雜質(zhì)檢測研究的空白，有利于對鹽酸決奈達隆藥物合成過程中的質(zhì)量參數(shù)進行有效監(jiān)測。

圖1　鹽酸決奈達隆的合成路線圖Fig.1　Graphical synthetic route of dronedarone hydrochloride

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Thermo LTQ-XL型高效液相色譜-四極桿/離子阱質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源；超聲波清洗機(昆山超聲儀器公司)；精密分析天平(OHAUS DV215CD)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；0.22 μm有機系濾膜(上海津騰公司)。

雜質(zhì)C、雜質(zhì)D對照品(迪沙藥業(yè)集團有限公司，純度≥99%)；甲醇、乙腈(色譜級，德國Merck公司)；甲酸(優(yōu)級純，天津大茂化學(xué)試劑廠)；實驗用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·m)；鹽酸決奈達隆藥品粗品和精品(迪沙藥業(yè)集團有限公司)。

1.2溶液的制備

對照品溶液：取雜質(zhì)C和D約10 mg，精密稱定至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后，用乙腈定容至刻度，混勻，配制成1.0 g/L的標準儲備液，-18 ℃避光保存。取適量標準儲備液，用乙腈配制成10.0 mg/L的標準中間液，作為對照品溶液，4 ℃避光保存。

定性分析溶液：取鹽酸決奈達隆粗品約10 mg，精密稱定至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后再加入0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)定容。

供試品溶液：取鹽酸決奈達隆精品約10 mg，精密稱定至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超聲溶解后再加入0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)定容。以上溶液均需過0.22 μm濾膜后進行質(zhì)譜分析。

1.3色譜條件

1.3.1定性檢測色譜條件Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)；流動相：A相為0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：0.2 mL/min，等度洗脫(0～12 min，40%B)；柱溫35 ℃；進樣體積為1.0 μL。

1.3.2雜質(zhì)C定量檢測色譜條件Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：0.2 mL/min，梯度洗脫：0～1.0 min，15%B；1.0～5.0 min，15%～80% B；5.0～12.0 min，80%～15% B；柱溫35 ℃；進樣體積為10 μL。

1.3.3雜質(zhì)D定量檢測色譜條件YMC-Pack CN色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：1.0 mL/min(柱后1∶4分流)，等度洗脫(0～15 min，50%B)；柱溫35 ℃；進樣體積為10 μL。

1.4質(zhì)譜條件

1.4.1定性檢測質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：全掃描監(jiān)測(SCAN)；掃描范圍：100～1 000；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣(Sheath gas)：35 L/min；輔助氣(Aux gas)：15 L/min；毛細管電壓：3 500 V。

表1　雜質(zhì)C和D的保留時間與質(zhì)譜條件Table 1　Retention times and optimized spectrometric parameters of impurity C and impurity D

*quantification ion pairs

1.4.2定量檢測質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇離子監(jiān)測(SRM)；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣：35 L/min；輔助氣：15 L/min；毛細管電壓：3 500 V；定量方式：外標法定量。具體質(zhì)譜條件見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1定性分析與雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確定

按照“1.3.1”和“1.4.1”條件制備定性分析溶液并進行檢測，得到鹽酸決奈達隆粗品的紫外色譜圖和質(zhì)譜離子流圖(見圖2)，由圖可見主峰后有兩個雜質(zhì)峰較為明顯(峰2和峰3)，并得到峰2和峰3的精確質(zhì)荷比分別為m/z509.312 0和m/z479.413 0。通過儀器MassFrontier軟件計算同位素位置和豐度比，得到兩種離子的元素組成分別為C30H41N2O5+和C30H43N2O3+，即為C30H40N2O5和C30H42N2O3的[M+H]+信號。C30H40N2O5和C30H42N2O3的分子式分別與雜質(zhì)C和D的分子式一致，將雜質(zhì)C和D的對照品溶液按照上述條件檢測后比對，保留時間和質(zhì)荷比與峰2和峰3也完全一致，可判斷峰2和峰3分別為雜質(zhì)C和D，并在后期開展兩種雜質(zhì)的定量檢測工作。

圖2　鹽酸決奈達隆粗品的色譜圖及峰2、峰3的全掃描質(zhì)譜圖Fig.2　Chromatograms of dronedarone hydrochloride and scan mass spectra of peak 2 and peak 3

2.2定量檢測色譜條件的選擇

在相近的色譜條件下，考察了Agilent Extend-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)、Thermo Hypersil-C18色譜柱(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)和Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)的分離情況。結(jié)果顯示，在3種色譜柱上均能實現(xiàn)鹽酸決奈達隆主峰和雜質(zhì)C、雜質(zhì)D的良好分離，且兩種雜質(zhì)的峰形均較好。但紫外圖譜顯示，鹽酸決奈達隆主峰在后兩種色譜柱上拖尾較為明顯；進一步考察回收率時發(fā)現(xiàn)，在后兩種色譜柱上雜質(zhì)C的回收率明顯降低。利用Agilent Extend-C18色譜柱能有效分離雜質(zhì)C和主峰，且鹽酸決奈達隆主峰無明顯拖尾現(xiàn)象，雜質(zhì)C峰形好、回收率高，故本文采用Agilent Extend-C18色譜柱檢測鹽酸決奈達隆中雜質(zhì)C的殘留。

通過回收率實驗發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)D在上述3種色譜柱上分離檢測后回收率均很低，調(diào)節(jié)梯度洗脫濃度使主峰和雜質(zhì)D分離度增大后回收率也無明顯改善，可能的原因是鹽酸決奈達隆高濃度主峰對雜質(zhì)D有強烈的離子抑制效應(yīng)。嘗試利用氰基柱(YMC-Pack CN色譜柱)對二者進行分離，雜質(zhì)D在鹽酸決奈達隆主峰前2 min出峰，峰形較好；回收率實驗進一步表明，雜質(zhì)D在主峰前出峰時的回收率良好，基本在80%以上，故本文采用氰基柱(YMC-Pack CN色譜柱)檢測鹽酸決奈達隆中雜質(zhì)D的殘留。

2.3質(zhì)譜條件的選擇

采用電噴霧離子源，在正離子模式下，對1.0 mg/L雜質(zhì)C和雜質(zhì)D標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子[M+H]+峰(m/z509.3和479.4)；對分子離子峰進行子離子掃描，得到二級質(zhì)譜圖，篩選響應(yīng)值較高、基線噪音低的兩個離子作為定性離子對。采用SRM模式采集數(shù)據(jù)，駐留時間設(shè)定為100 ms，優(yōu)化各離子的碰撞能，得到最佳質(zhì)譜條件如表1所示。

2.4線性范圍、檢出限及定量下限

以0.1%甲酸水溶液-乙腈(20∶80)配制0，1.0，5.0，10，20，50 μg/L的雜質(zhì)C和雜質(zhì)D標準系列溶液分別進行測定，以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果表明，雜質(zhì)C和雜質(zhì)D在1.0～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.998)；以S/N=3計算檢出限分別為0.20 μg/L和0.30 μg/L；以S/N=10計算定量下限分別為0.80 μg/L和1.0 μg/L。方法的靈敏度完全滿足依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則計算的1.875 μg/L的雜質(zhì)限度。

2.5回收率實驗

采用不含雜質(zhì)C和雜質(zhì)D的鹽酸決奈達隆精品為空白基質(zhì)，添加80%限度、100%限度、120%限度濃度的雜質(zhì)C和雜質(zhì)D分別做回收率實驗，平均回收率分別為87.8%～96.8%和82.0%～88.0%，相對標準偏差(RSD)分別為1.5%～5.0%和2.0%～2.7%(見表2)。

表2　鹽酸決奈達隆中添加雜質(zhì)C和雜質(zhì)D的回收率與相對標準偏差Table 2　Recoveries ans RSDs of impurity C and impurity D in dronedarone hydrochloride

圖3鹽酸決奈達隆中含雜質(zhì)C(A)和雜質(zhì)D(B)的陽性樣品總離子流圖(TIC)

Fig.3Total ion chromatograms(TIC) of positive samples with impurity C(A) and impurity D(B) in dronedarone hydrochloride

2.6實際應(yīng)用

將所建方法應(yīng)用于合成的鹽酸決奈達隆藥物小試3批、中試3批及工藝驗證3批共9份樣品的檢測，檢出2批含有雜質(zhì)C殘留，含量分別為3.42 mg/kg和1.93 mg/kg；6批含有雜質(zhì)D殘留，含量為3.82～148.2 mg/kg，其他樣品均未檢出。陽性樣品的色譜圖見圖3。

3　結(jié)　論

本文建立了高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-QTARAP-MS/MS)測定鹽酸決奈達隆藥物中兩種基因毒性雜質(zhì)(雜質(zhì)C和雜質(zhì)D)痕量殘留的分析方法。利用線性離子阱質(zhì)譜的高分辨掃描功能聯(lián)合對照品定性成功確定了兩種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，并建立了定量檢測方法。該方法靈敏度高、分離度好，回收率、精密度及定量下限均能滿足基因毒性雜質(zhì)限度的要求，是檢測鹽酸決奈達隆藥品中兩種基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的有效方法。將所建方法應(yīng)用于合成的鹽酸決奈達隆藥物樣品的檢測，共檢出2批樣品含有雜質(zhì)C，6批樣品含有雜質(zhì)D，有效指導(dǎo)了鹽酸決奈達隆合成反應(yīng)的進行。

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Determination of Two Genotoxic Impurities Residues in Dronedarone Hydrochloride by HPLC-QTRAP-MS/MS

ZHOU Chang-peng*，WANG Dong-wu，ZHANG Man-yu，XU Jie，ZHENG Wen-feng

(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai264205，China)

A high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the determination of two potential genotoxic impurities(impurity C and impurity D) residues in dronedarone hydrochloride.After extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile(20∶80)，the dronedarone hydrochloride samples were separated on an Agilent Extend-C18column(1.8 μm,2.1 mm×50 mm) or a YMC Pack-CN column(5 μm,4.6 mm× 250 mm) with two mobile phases of 0.1% formic acid and acetonitrile.The detection of analytes was performed in the positive mode and selective reaction monitoring(SRM) mode.As a result，the calibration curves of impurity C and impurity D showed good linearity in the range of 1.0-50 μg/L.The limits of detection(S/N=3) were 0.20 μg/L and 0.30 μg/L,respectively.The limits of quantitation(S/N=10)were 0.80 μg/L and 1.0 μg/L，respectively.The method has the advantages of simple operation，high sensitivity，good reproducibility，and could be used for the detection of two genotoxic impurities residues in dronedarone hydrochloride.

high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS);potential genotoxic impuritie；dronedarone hydrochloride；residues

2016-02-02；

2016-02-19

周長朋，工程師，研究方向：理化檢測及藥物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：20019568@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.006

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1111-05