歐陽麗，黎　瑛，章建輝，夏立新，胡麗俐，李　莎

(長沙市食品質量安全監(jiān)督檢測中心，湖南　長沙　410013)

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三正辛胺絡合萃取法分離提取糖果中8種合成色素

歐陽麗*，黎瑛，章建輝，夏立新，胡麗俐，李莎

(長沙市食品質量安全監(jiān)督檢測中心，湖南長沙410013)

以三正辛胺為絡合劑，四氯化碳為稀釋劑，采用絡合萃取法對糖果中的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍和赤蘚紅8種合成色素進行了預處理研究。考察了樣品溶液pH值、稀釋劑種類、三正辛胺濃度、反萃相組成等對預處理效果的影響。結果表明，當樣品溶液pH值為6.0，以四氯化碳為稀釋劑，三正辛胺濃度為5%，無水乙醇-15%氨水(體積比1∶1)為反萃相時，8種合成色素的回收率為90%～98%。該預處理方法操作簡單、快速、有機溶劑用量少、回收率高，適用于糖果中多種合成色素的分離提取。

三正辛胺；合成色素；絡合萃??；高效液相色譜(HPLC)

人工合成色素因色澤鮮艷、著色力強、色調豐富、價格低而廣泛用于食品生產加工業(yè)。但合成色素以苯、甲苯、萘等化工產品為主要原料，經一系列有機反應制成，甚至含有β-萘胺和α-氨基萘酚等致癌物，對人體具有一定的毒害作用[1-2]。我國現(xiàn)行國標中嚴格規(guī)定了糖果中合成色素的種類及最大使用量[3]。糖果富含甜味劑、轉化糖、糖漿及輔料，基質復雜，因此，建立一種簡便、準確的預處理方法分離提取其中的合成色素具有十分重要的現(xiàn)實意義。

目前，合成色素的分離提取方法主要有聚酰胺吸附法[4-6]、固相萃取法[7-8]、液-液分配法[9]。聚酰胺吸附法的吸附效果不理想，操作繁瑣，常出現(xiàn)難抽濾的現(xiàn)象，且不適用于含赤蘚紅的樣品；固相萃取法和液-液分配法操作費時，有機溶劑用量較大，不利于批量樣品檢測，且固相萃取法需配置固相萃取柱，分析成本較高。為解決這些難題，不斷有新的預處理方法報道出來。其中，霍艷敏等[10]用甲醇-水代替水、乙醇-氨水作提取劑，有效地提取了冰淇淋中的10種合成色素；朱麗君等[11]采用無色素面粉作助沉淀劑，簡化了聚酰胺吸附法的操作；郭京波等[12]將離子液體引入分散液-液微萃取測定食品中的檸檬黃與亮藍，獲得良好效果，但在多種合成色素同時檢測方面尚存在不足。絡合萃取法，又稱為反應萃取法，是一種基于可逆反應的化學萃取方法。萃取時，通過選擇適當?shù)慕j合劑與目標溶質發(fā)生化學反應，形成不溶于水的絡合物并將其從水溶液中提取出，以實現(xiàn)目標溶質與復雜基質的分離；反萃時，該絡合物經過一定的處理即可實現(xiàn)絡合劑再生以及溶質的同時回收。因此，絡合萃取法具有操作條件溫和、能耗低、高效、選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點，自1987年被King教授[13]提出后，已廣泛用于羧酸[14-15]、酚[16]、磺酸[17]等的分離提取及工業(yè)廢水的處理過程[18-19]。目前絡合萃取法用于分離提取合成色素的文獻報道較少[9]，且已報道方法步驟繁瑣、操作費時，不利于樣品的批量處理。

本文以三正辛胺(TNOA)為絡合劑、四氯化碳為稀釋劑絡合提取糖果中的8種合成色素，系統(tǒng)考察了樣品溶液pH值、稀釋劑的種類、三正辛胺濃度、反萃相組成等主要操作條件對分離提取效果的影響，旨在建立一種操作簡單、有機溶劑用量少、回收率高的合成色素預處理方法，并結合高效液相色譜對其進行檢測，以期為食品檢測機構更好地監(jiān)測糖果中的合成色素提供方法儲備。

1　實驗部分

1.1實驗原理

萃取時，赤蘚紅分子上的酚羥基能與三正辛胺分子中的氮原子形成氫鍵，生成不溶于水的化合物，被萃取至有機相中；反萃時，該化合物遇堿則氫鍵斷裂，赤蘚紅進入水相。

1.2儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配自動進樣器和二極管陣列檢測器；CT14D型臺式高速離心機(上海天美生化儀器設備工程有限公司)；SK-1型快速混勻器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)；A10型超純水處理器(美國Millipore公司)；旋轉蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)。

甲醇(迪馬科技有限公司)、三氯甲烷(天津市化學試劑研究所)、四氯化碳(天津市化學試劑研究所)、氨水(天津市光復精細化工研究所)均為色譜純；正丁醇(天津市光復精細化工研究所)、無水乙醇(天津市化學試劑研究所)、醋酸銨(國藥集團化學試劑有限公司)、一水合檸檬酸(國藥集團化學試劑有限公司)均為分析純；莧菜紅、日落黃、亮藍、檸檬黃、胭脂紅標準品購自中國計量科學研究院；新紅、赤蘚紅、誘惑紅標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；實驗用水為超純水。含合成色素的糖果與空白的糖果樣品均購自當?shù)爻小?/p>

1.3標準溶液的制備

精密稱取各合成色素標準品，分別用水溶解定容，配制成濃度為0.5 mg/mL的標準儲備液；準確移取各標準儲備液適量，用水依次稀釋成濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L的混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為0.02 mol/L醋酸銨溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序：0～10 min，90%～80% A；10～15 min，80%～65% A；15～22 min，65%～2% A；22～25 min，2% A；25～27 min，2%～90% A；27～30 min，90% A 。流速：1.0 mL/min；PDA檢測器掃描范圍：190～800 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：新紅、莧菜紅、胭脂紅與誘惑紅均為520 nm；檸檬黃430 nm；日落黃490 nm；亮藍630 nm；赤蘚紅530 nm。

1.5樣品處理

將糖果粉碎，混勻，準確稱取5 g，加入約45 mL水，水浴加熱超聲溶解樣品，冷卻，5 000 r/min離心5 min，取上清液，用20%檸檬酸溶液調至pH 6.0，用水定容至50 mL；取25 mL上清液，加入含5%三正辛胺的四氯化碳5 mL，高速渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，分取有機相，重復提取1次，合并有機相；有機相中加入5 mL無水乙醇-15%氨水混合溶液(體積比1∶1)，渦旋10 s，8 000 r/min離心5 min，分取水相，重復提取1次，合并水相；水相于55 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至約為4.5 mL，用20%檸檬酸溶液調至中性，用水定容至5 mL，經濾膜過濾，取10 μL濾液供HPLC測定。

1.6條件優(yōu)化樣品溶液的制備

用空白糖果代替含合成色素的糖果，按照5 g制備50 mL溶液的比例制備空白樣品溶液，準確加入各合成色素標準儲備液適量，使加標水平均為1.0 mg/L；分取適量，用20%檸檬酸溶液調至所需pH值，作為條件優(yōu)化樣品溶液使用。

2　結果與討論

2.1樣品溶液pH值對萃取率的影響

以三正辛胺為絡合劑萃取溶液中的合成色素時，溶液pH值對萃取效果有重要影響。實驗考察了不同pH值的樣品溶液對合成色素萃取率的影響。結果顯示，隨著溶液pH值的升高，8種合成色素的萃取率先增加后降低。當pH<6.0時，可能是溶液中游離的H+與其中的鹽形成了無機酸，而無機酸可與三正辛胺發(fā)生反應導致絡合效果變差[20]。當pH>6.0時，溶液中的H+較少，不能將全部絡合劑質子化，導致萃取率降低。因此，實驗選擇樣品溶液的pH值為6.0。

2.2稀釋劑種類對萃取率的影響

稀釋劑在絡合萃取時通過調節(jié)絡合劑的粘度、密度、界面張力等物理性質來實現(xiàn)萃取過程的兩相接觸傳質與萃取后的油水兩相快速分離。考察了正丁醇、三氯甲烷、四氯化碳、十一醇作為稀釋劑時，三正辛胺對合成色素的萃取率。結果表明：十一醇因粘度太大，乳化現(xiàn)象非常嚴重；正丁醇的乳化現(xiàn)象雖然較十一醇有改善，但不能實現(xiàn)油水兩相快速分層；以三氯甲烷、四氯化碳作為稀釋劑時，8種色素的萃取率高且有機相與水相分層快速。由于四氯化碳的極性比三氯甲烷弱，在水中的溶解度比三氯甲烷小，所以實驗選擇四氯化碳作為最佳稀釋劑。

圖1　TNOA濃度對萃取率的影響Fig.1　Effect of TNOA concentration on extraction efficiency diluent:tetrachloromethane;pH 6.0

2.3三正辛胺濃度對萃取率的影響

絡合萃取時，絡合劑的濃度在萃取過程中起著至關重要的作用。增大絡合劑濃度，有利于絡合反應向生成絡合物的方向進行，萃取效率增高；然而，增大絡合劑濃度會使有機相粘度增加，導致乳化現(xiàn)象嚴重。實驗分別用不同濃度的三正辛胺-四氯化碳溶液對8種合成色素進行萃取，結果如圖1所示。由圖1可知，合成色素的萃取率隨著三正辛胺濃度的增大而逐漸增大，當其濃度增至5%以上時，均能實現(xiàn)100%萃取。因此，實驗選擇三正辛胺的濃度為5%。

2.4反萃相組成對回收率的影響

合成色素從有機溶液返回至水溶液的過程稱為反萃??；反萃取時的水溶液為反萃相；條件優(yōu)化時，樣品溶液中的合成色素經萃取、反萃取進入反萃相的量與原樣品溶液中的量之比的百分數(shù)為回收率?？疾炝朔摧拖酁?%的氨水以及不同比例的無水乙醇-2%氨水(1∶9，3∶7，1∶1，2∶1)時8種合成色素的回收率。結果表明，當反萃相為2%氨水時，合成色素幾乎不能被反萃取，回收率很低，隨著反萃相中無水乙醇比例的增加，8種合成色素的回收率逐漸增加，這是由于無水乙醇能與水、四氯化碳互溶，當反萃相中無水乙醇比例增加時，其作為分散劑能夠增加水相與有機相的接觸界面，增大合成色素的傳質面積，有利于三正辛胺與合成色素形成的絡合物和氨水溶液反應，促進反萃過程的進行。當無水乙醇-2%氨水的體積比為1∶1，繼續(xù)增加無水乙醇比例，合成色素回收率增加的趨勢不明顯。因此實驗選擇無水乙醇-2%氨水的最佳體積比為1∶1。

實驗進一步考察了氨水濃度對回收率的影響，結果顯示，隨著氨水濃度的增加，合成色素的回收率不斷增大。這是由于反萃相中氨水濃度增加，導致游離的OH-濃度增加，有利于反萃過程的進行。當氨水濃度增至15%后，回收率隨氨水濃度增加，其增加趨勢不明顯。因此，實驗選擇反萃相為無水乙醇-15%氨水(1∶1)。

2.5反萃相溶液酸度的調節(jié)

若反萃相溶液中乙醇含量大，則pH值高，不利于高效液相色譜分析，且高含量的乙醇會引起新紅、檸檬黃、莧菜紅的色譜峰形變差，定量不準確。實驗采用水浴加熱旋轉蒸發(fā)的方式去除反萃相中的大部分乙醇。實驗發(fā)現(xiàn)：如在旋轉蒸發(fā)前先將反萃相的pH值調至中性，再濃縮至4.5 mL，旋轉瓶瓶壁上會殘留許多紫紅色沉淀，赤蘚紅的回收率幾乎為零。用2%氨水將沉淀溶解，經HPLC分析可知紫紅色沉淀為赤蘚紅。若先將反萃相旋轉濃縮至4.5 mL，再調其pH值至中性，則赤蘚紅不會在溶液中沉淀。

如果實驗在溫度較低的冬季進行，不宜用乙酸調節(jié)反萃相的pH值。因為溫度低，乙酸凝固，不便取用，且乙酸濃度大，易使溶液中的合成色素因酸性太強而形成沉淀。因此，當反萃相被旋轉蒸發(fā)濃縮至約4.5 mL時，本實驗選用20%檸檬酸溶液調其pH值至中性。

2.6合成色素的回收率與富集因子

經過條件優(yōu)化，確定最佳實驗條件為：樣品溶液的pH值為6.0，四氯化碳為稀釋劑，三正辛胺濃度為5%，反萃相為無水乙醇-15%氨水(1∶1)，反萃溶液經55 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮后用20%檸檬酸溶液調pH值至中性，再定容。在最佳實驗條件下，檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍和赤蘚紅的回收率分別為92%，98%，95%，94%，96%，93%，95%，90%；富集因子(反萃相溶液與原始樣品溶液中合成色素濃度的比值)分別為4.6，4.9，4.7，4.7，4.8，4.6，4.7，4.5。實驗對原始樣品溶液、萃取后的樣品溶液和反萃相溶液用HPLC進行分析，結果如圖2所示。由圖2可見，圖2B中8種合成色素的色譜峰在圖2C中均未檢出；圖2B中8個色譜峰均在圖2D中出現(xiàn)，且峰高約為B中對應峰峰高的5倍。結果表明：在最佳實驗條件下，原始樣品溶液中的合成色素全部被萃取，且?guī)缀跞窟w移至反萃相溶液中。

圖2　合成色素的色譜圖Fig.2　Chromatograms of the synthetic pigments A:eight synthetic pigments standard solution;B:the original working solution;C:the working solution after extracted;D:the strip solution after treated；1:tartrazine;2:new red;3:amaranth;4:ponceau 4R;5:sunset yellow;6:allura red;7:brilliant blue;8:erythrosine

2.7標準曲線與檢出限

采用與標準物質色譜峰保留時間和PAD光譜圖比較的方式進行定性分析；以峰面積(Y)為縱坐標，對應質量濃度(X，mg/L)為橫坐標繪制定量工作曲線，得到線性回歸方程，外標法定量。分別取濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L的混合標準溶液進行測定，8種合成色素的質量濃度在0.5～20.0 mg/L范圍內與其峰面積呈線性關系，線性回歸方程、相關系數(shù)見表1。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以S/N=10計算定量下限(LOQ)，結果見表1。8種合成色素的檢出限為0.1～0.4 mg/kg，定量下限為0.3～1.2 mg/kg。

表1　8種合成色素的線性方程、相關系數(shù)、檢出限與定量下限Table 1　Linear equations,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 8 synthetic pigments

2.8實際樣品的測定

為驗證本方法測定實際樣品的可行性，選取4種具有代表性的含合成色素的糖果樣品(分別為棒棒糖、彩虹糖、橡皮糖與棉花糖)進行加標回收實驗，加標水平分別為2,4,20 mg/kg，每個水平平行測定3次，結果如表2所示。8種合成色素的回收率為80%～99%，相對標準偏差(RSD)為3.0%～5.5%，說明本方法回收率高，重現(xiàn)性好。

表2　糖果樣品中8種合成色素的平均加標回收率與相對標準偏差Table 2　Average recoveries and RSDs of 8 synthetic pigments in candy samples

3　結　論

本文將絡合萃取的原理引入糖果中合成色素的前處理，采用三正辛胺為絡合劑、四氯化碳為稀釋劑，通過條件優(yōu)化，建立了一種操作簡單、有機溶劑用量少、回收率高的合成色素預處理方法，并結合高效液相色譜對其進行分析檢測。該方法的回收率高，能有效地分離提取糖果中的合成色素，且便于大批量樣品的前處理，極大提高了實驗效率，在實際檢測中具有較高的應用價值。該法還可用于脂肪含量低的其它食品中合成色素的分析檢測。

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Separation and Extraction of Eight Synthetic Pigments in Candy by Complexing Extraction with Tri-n-octylamineOU

YANG Li*,LI Ying,ZHANG Jian-hui,XIA Li-xin,HU Li-li,LI Sha

(Changsha Center of Supervision and Inspection on Food Quality Safety,Changsha410013,China)

Complexing extraction was applied in the pretreatment of eight synthetic pigments such as tartrazine,new red,amaranth,ponceau 4R,sunset yellow,allura red,brilliant blue and erythrosine in candy with tri-n-octylamine(TNOA) as complexing agent and tetrachloromethane as diluent.Effects of operation conditions such as pH of working solution,kind of diluent,TNOA concentration and the strip solution composition on pretreatment efficiency were investigated.Results showed that when pH value of working solution was 6.0,the diluent was tetrachloromethane,TNOA concentration was 5% and the strip solution was ethanol-15% ammonium solution(1∶1,by volume),the recoveries of eight synthetic pigments were in the range of 90%-98%.The results indicated that the method showed the advantages of simplicity,rapidness,low solvent consumption and high recovery,and was suitable for the separation and extraction of synthetic pigments in candy.

tri-n-octylamine(TNOA);synthetic pigment;complexing extraction;HPLC

2016-02-29；

2016-03-30

國家公益性行業(yè)科研專項項目(201310130)

歐陽麗，碩士，工程師，研究方向：食品質量安全分析，Tel：0731-88635360，E-mail：yangli8945@sina.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.005

O657.72；TS264.4

A

1004-4957(2016)09-1105-06