胡常英, 楊何寶, 羅同陽, 王云鵬

(河北省微生物研究所， 保定 071051)

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糙皮側耳發(fā)酵液降解飼料中黃曲霉毒素B1的應用研究

胡常英, 楊何寶, 羅同陽, 王云鵬

(河北省微生物研究所， 保定 071051)

取自然條件下污染黃曲霉毒素B1的玉米、豆粕和花生粕飼料進行解毒試驗。每種飼料選擇3個黃曲霉毒素B1濃度(10.7～62.2 μg/kg)，按11‰比例加入糙皮側耳濃縮發(fā)酵液，72 h降解率為39.5%～55.4%,168 h降解率為52.4%～75.5%。在模擬牛胃條件下，以豆粕飼料含不同濃度的黃曲霉毒素B1(15.7 μg/kg、30.5 μg/kg和48.9 μg/kg)為有毒源，糙皮側耳濃縮發(fā)酵液添加11‰，24 h解毒率為25.5%、19%和17.4%，48 h解毒率為42.7%、33.1%和29% 。改變濃縮發(fā)酵液添加比例為7‰、9‰、11‰、13‰和15‰，降解時間36 h，解毒率為53.5%以下。

糙皮側耳發(fā)酵液;降解;黃曲霉毒素B1

糙皮側耳(PleurotusOstreatus)是一種含有豐富營養(yǎng)成分的食用菌，每100 g干菇含有粗蛋白約19.5 g，粗脂肪約3.8 g，碳水化合物50.2 g，粗纖維6.2 g，還有礦物質和多種維生素等[1-2]。菌體可以進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有大量的多糖、酶、氨基酸及生理活性物質。發(fā)酵液酶中尤以3種酚氧化酶含量較高[3-4]。這些酶可用于食品保鮮，可用于降解多種化工顏料，對霉菌毒素也有降解作用[5]。

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是霉菌毒素中的一種，也是毒性最強的一種[6]。張自強2009年對11省的1050個飼料樣品調查發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素污染率高達92.3%，黃曲霉毒素B1檢出率高達73.3%，黃曲霉毒素超標率為55.1%[7]。動物飼用被黃曲霉毒素B1污染的飼料后，毒素主要集聚于肝臟，干擾肝臟正常代謝功能，肌體的生理生化反應嚴重受阻[8-10]。黃曲霉毒素B1可以通過家畜的分泌物傳遞，尤其母牛乳汁中最為常見，不但危害家畜本身，還以食物鏈方式危害人的身體健康[11]。為此，黃曲霉毒素B1毒害作用已經(jīng)引起世界各國高度重視。目前，解除黃曲霉毒素B1危害可歸納為3種方法，即物理方法、化學方法和生物學法[6，11]。由于物理和化學方法均有不利方面，而生物學法降解毒素條件溫和，不產(chǎn)生副作用(二次危害)，對營養(yǎng)成分不破壞，是當前推薦的方法，也是非常有發(fā)展前途的方法[12-14]。選用糙皮側耳菌種進行液體深層發(fā)酵，發(fā)酵液用于降解黃曲霉毒素B1，降解效果良好，是一種值得深入研究和開發(fā)的生物解毒劑[5]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種糙皮側耳JWEI113H，本研究所食用菌室保藏。

1.1.2自然污染的玉米飼料選取含有黃曲霉毒素B1量分別為10.7、35.4和58.1 μg/kg，3種玉米飼料，每一濃度取3個平行樣進行試驗。

1.1.3自然污染的豆粕飼料選取含有黃曲霉毒素B1量分別為15.7、30.5和48.9 μg/kg 3種豆粕飼料，每一濃度取3個平行樣進行試驗。

1.1.4自然污染花生粕飼料選取含有黃曲霉毒素B1量分別為15.5、35.4和62.2 μg/kg 3種花生粕飼料，每一濃度取3個平行樣進行試驗。

1.2濃縮發(fā)酵液制備

1.2.1斜面培養(yǎng)基馬鈴薯提取液、葡萄糖、瓊脂。

1.2.2液體發(fā)酵培養(yǎng)基土豆淀粉60 g、蔗糖20 g、酵母膏2 g、(NH4)2SO43.0 g、KH2PO43 g、MgSO4.7 H2O 1.5 g、VB12 mg 、微量元素溶液55 mL、藜蘆醇 450～550 μL/L、吐溫80 0.1% pH 5.2。

1.2.3濃縮發(fā)酵液制備斜面菌種長好后接種于平皿培養(yǎng)基中，平皿中菌絲長到2/3面積，用直徑8～10 mm玻璃管在接近外邊緣位置取圓片菌絲接種于三角瓶中，每瓶接3～5片，26℃±1℃ 培養(yǎng)3～4 d為液體種子，按2%～3%比例接種到1000 L發(fā)酵罐中，通氣培養(yǎng)9～11 d，取濾液，采用真空旋轉薄膜濃縮器濃縮后備用。

1.3黃曲霉毒素B1降解試驗方法

1)取11‰濃縮發(fā)酵液，均勻噴施在玉米、豆粕和花生粕飼料上，攪拌均勻，飼料表面應均勻被發(fā)酵液濕潤和有液滴為好，保溫在25℃～27℃條件下，進行解毒試驗，降解時間為72 h～168 h，記錄結果。

2)模擬牛胃條件對豆粕飼料解毒試驗，加入11‰濃縮發(fā)酵液，降解時間為24～48 h,記錄結果。

3)模擬牛胃條件對豆粕飼料解毒試驗，分別加入7‰、9‰、11‰、13‰和15‰的糙皮側耳濃縮發(fā)酵液，降解時間為36 h,記錄結果。

1.4黃曲霉毒素B1抽提方法

AFB1提取參照GB—2008/ISO6651:2001。

1.5黃曲霉毒素B1測定方法

參照GB/17480—2008飼料中黃曲霉毒素B1的測定方法-酶聯(lián)免疫吸附法。

2　結果與討論

2.1玉米飼料中黃曲霉毒素B1降解試驗

對玉米飼料毒素降解按11‰比例添加濃縮發(fā)酵液。試驗的關鍵是保證二者的充分接觸，必要時可采取在保證添加比例的前提下，對濃縮液進行稀釋，增大液體量，使發(fā)酵液與飼料混合均勻，降解試驗物料靜止在26℃條件下進行，測定數(shù)據(jù)列于表1。

表1 發(fā)酵液降解玉米飼料中AFB1結果Table 1 Result of AFB1-degradation of corn feed byPleurotus ostreatus fermentation

注：所有表格中的測定數(shù)據(jù)為3個平行樣的平均值

降解毒素反應72 h：1號樣品降解率是54.2%，2號樣品降解率是43.2%,3號樣品降解率是40.3%；反應168 h 1號樣品降解率是75.7%，2號樣品降解率是62.1%,3號樣品降解率是55.4%。從降解率分析，每一相等時間段降解速度不同，表現(xiàn)出隨時間延長，降解速度下降趨勢。

濃縮發(fā)酵液噴灑在玉米飼料上直接用于降解黃曲霉毒素B1，總體屬于固體相，反應體系不利于生化反應進行，沒有液體相互融的流動相環(huán)境，毒素底物密度分配不均勻，降解產(chǎn)物不易分散，阻遏正向反應進行；飼料中黃曲霉毒素B1附著量不均勻，部分玉米粒上毒素濃度很高，制約發(fā)酵液對毒素的降解速度。但有的籽粒上也可能沒有沾附黃曲霉毒素B1，或者量很少，雖然發(fā)酵液與飼料接觸充分，可能部分發(fā)酵液不能發(fā)揮作用，是導致降解效率下降的主要原因。

2.2豆粕飼料中黃曲霉毒素B1降解試驗

按照濃縮發(fā)酵液降解玉米飼料黃曲霉毒素B1試驗方法，添加11‰濃縮發(fā)酵液與豆粕飼料充分混勻，在不同時間測定毒素的剩余量，結果見表2。

表2 濃縮發(fā)酵液對豆粕飼料中AFB1降解結果Table 2 Result of AFB1-degradation of bean cake feed by Pleurotus ostreatus fermentation

濃縮發(fā)酵液對豆粕中黃曲霉毒素B1降解，因毒素含量高低不同降解率也不同，降解速率在72 h 前快，隨時間延長降解速度下降。1號飼料前72 h降解率是55.4%，到168 h降解速率為71.3%，前后相等時間段降解速率下降39.5 %；2號飼料72 h降解率是41.3%，168 h為57.4%，前后相等時間段降解速率下降25.2%；3號飼料72 h降解率是39.5%，168 h為53.6%，前后相等時間段降解速率下降25.4%。降解規(guī)律與玉米飼料相似。

濃縮發(fā)酵液與有毒飼料混合后靜止堆放的做法為靜態(tài)降解法，從生物化學反應體系影響分析，效果遠不如家禽家畜胃腸中蠕動狀況下有利于反應進行和產(chǎn)物擴散，更不如在液體相中的生化反應容易進行。對飼料靜態(tài)降解率低是正常的。

在生物法降解黃曲霉毒素B1機理研究中，有人認為其生物法降解實質是微生物細胞壁或是菌體對毒素的吸附作用。糙皮側耳發(fā)酵液降解黃曲霉毒素B1毒性，發(fā)酵液中不含菌體，發(fā)酵液制備過程檢測指標為蛋白，由此判斷，糙皮側耳發(fā)酵液降解黃曲霉毒素B1機理應是酶促反應過程。

2.3花生飼料中黃曲霉毒素B1降解試驗

花生粕以其蛋白質含量高，資源豐富，是養(yǎng)殖業(yè)蛋白飼料的首選。正是因為其營養(yǎng)豐富，常被霉菌污染，黃曲霉毒素B1檢出率高出一般飼料，每一樣品的測定值也高于其它飼料數(shù)值。試驗方法同玉米飼料降解相同，降解測定時間72～168 h，濃縮發(fā)酵液添加量11‰,環(huán)境溫度26℃。不同時間黃曲霉毒素B1剩余量測定結果見表3。

表3 濃縮發(fā)酵液對花生粕中AFB1不同時間降解結果Table 3 Result of AFB1-degradation of peanuts cake feed by Pleurotus ostreatus fermentation

糙皮側耳發(fā)酵液降解花生粕中黃曲霉毒素B1試驗中，降解反應72 h，降解率分別為51.6%、43.5%和40.2%,168 h降解率為72.9%、57.6%和52.4%,降解規(guī)律與降解玉米飼料中毒素規(guī)律相同。繼續(xù)延長降解時間，總量在增加，但降解速率逐漸下降。同樣也表現(xiàn)了非液相狀態(tài)下產(chǎn)物不利于擴散，反應物不易流動和產(chǎn)物的抑制作用等，不利于催化反應進行。

劉睿杰等選用巨大芽孢桿菌，采用固體發(fā)酵工藝去除花生粕中黃曲霉毒素B1毒性，黃曲霉毒素B1含量低于375 μg/kg，降解率高達68%，而且對花生粕營養(yǎng)成分沒有不利影響[15]。趙麗紅等選用枯草芽孢桿菌發(fā)酵降解玉米中黃曲霉毒素B1，取得了滿意效果，當飼料中含黃曲霉毒素B170μg/kg，加入MLJ060霉立解，雞的生產(chǎn)性能恢復到對照組的99.6%[16]。糙皮側耳濃縮發(fā)酵液降解花生粕中黃曲霉毒素B1結果與二者的報道結果接近，反映了生物制劑降解黃曲霉毒素可行性和規(guī)律。

2.4模擬牛胃腸條件下發(fā)酵液降解AFB1試驗

牛吃完草料后需要飲水，正常成牛每次需要飲用20 kg左右水，因此，牛的瘤胃中有60%～80%水分。模擬牛瘤胃條件環(huán)境：1)添加11‰濃縮發(fā)酵液于豆粕飼料中，存放于模擬容器中，揉搓、翻動和研磨，保持溫度26℃，測定24～48 h的黃曲霉毒素B1剩余量，結果見表4；2)分別添加7‰、9‰、11‰、13‰和15‰濃縮發(fā)酵液于含黃曲霉毒素B1的豆粕飼料中，分別存放于模擬容器中，揉搓、翻動和研磨，保持溫度26℃，降解時間36 h，測定黃曲霉毒素B1剩余量，測定結果列于表5。

表4 模擬牛胃濃縮發(fā)酵液對豆粕飼料中AFB1降解結果Table 4 Result of AFB1-degradation of bean cake feed byPleurotus ostreatus fermentation under the stomach of ox test

表5 濃縮發(fā)酵液添加量與豆粕飼料中AFB1降解相關性Table 5 The Cornelation between AFB1-degradation of bean cake feed and added to proportion of Pleurotus ostreatus fermentation

模擬牛瘤胃對飼料攪動、翻滾過程，飼料與發(fā)酵液充分混合，增加酶與底物毒素的接觸概率和時間，攪動與翻滾分散了產(chǎn)物的集中度，產(chǎn)物不斷擴散，避免產(chǎn)物大量集聚對酶促正向反應產(chǎn)生阻遏作用。1)添加11‰濃縮發(fā)酵液，24 h降解率是25.5%、19%和17.4%；48 h降解率是42.7%、33.1%和29%。2)降解36 h，添加7‰發(fā)酵液，降解率分別是24.2%、21.7%和18.8%；添加11‰發(fā)酵液降解率是36.9%、27.9%和25.6%；添加15‰發(fā)酵液降解率是53.5%、36.4%和37%。因此推測：如果將發(fā)酵液應用于牛胃腸內(nèi)解毒，解毒效果應更好。牛胃、腸中產(chǎn)生大量酶系，有自身保護的解毒酶作用，這些酶與發(fā)酵液協(xié)同作用，能加快黃曲霉毒素B1降解速度。

3　結論

糙皮側耳濃縮發(fā)酵液用于降解玉米、豆粕和花生粕飼料中黃曲霉毒素B1，毒素含量小于62.2 μg/kg時，濃縮發(fā)酵液按11‰比例與飼料混勻，降解72 h和168 h，降解率分別大于39.5%和52.4%， 72 h前降解速率明顯高于72～168 h降解率；飼料中毒素基礎含量越低，降解率越高。模仿牛胃腸條件降解豆粕飼料中黃曲霉毒素B1，毒素含量小于48.9 μg/kg，添加11‰濃縮發(fā)酵液，24 h降解率大于17.4%，48 h降解率大于29%；改變糙皮側耳濃縮發(fā)酵液添加比例，降解率相應變化。

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Applied study on aflatoxin B1toxicity of the feed degraded by Pleurotus Ostreatus concentrated fermentation

HU Chang-ying, YANG He-bao, LUO Tong-yang, WANG Yun-peng

( Hebei Institute of Microbiology, Baoding 071051， China)

The materials for the AFB1toxicity-degradation test were natural AFB1of corn, bean cake and peanuts cake feed, the three AFB1concentrations (from 10.7 to 62.2μg/kg) were studied from every feed, taking the weight of the feed as the base, add to 11‰PleurotusOstreatusconcentrated fermentation. The rate of AFB1-degradation increased from 39.5% to 55.4% when 72 hours; the rate of AFB1-degradation increased from 52.4% to 75.5% when 168 hours. In imitate of the stomach of ox test, the test material was bean cake containing AFB1with different coucentrations such as 15.7 μg/kg, 30.5 μg/kg and 48.9 μg/kg, taking the weight of the feed as the base, 11%PleurotusOstreatusconcentrated fermentation added, the rate of AFB1-degradation are 25.5%, 19% and 17.4% when 24 hours respectively, the rate of AFB1-degradtion are 42.7%, 33.1% and 29% when 48 hours respectively, add to proportion ofPleurotusOstreatusconcentrated fermenta tion are 7‰, 9‰, 11‰, 13‰ and 15‰, the rate of AFB1-degradation are at 53.5% when 36 hours.

Pleurotusostreatusfermentation; degradation; aflatoxin B1

2015-12-28；

2016-01-22

河北省省級科技計劃資助項目(13252804D)

胡常英，研究員，主要研究方向為酶工程，E_mail:qimingxing105@126.com

S816.8

B

2095-1736(2016)05-0103-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.103