于小娜， 劉艷杰， 錢云霞

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

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鱸魚stat6 cDNA克隆及表達(dá)分析

于小娜， 劉艷杰， 錢云霞

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(Signal transducers and activators of transcription，STAT6)在白介素IL-4、IL-13誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。利用RT-PCR和SMART RACE的方法從鱸魚(Lateolabraxjaponicus)肝臟中克隆得到stat6全長cDNA序列。該序列的cDNA為3938 bp，5′ 非翻譯區(qū)295 bp，3′ 非翻譯區(qū)1369 bp，開放閱讀框2274 bp，可編碼757個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為86.43 ku，等電點(diǎn)為5.90。分析STAT6氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，與鱖魚相似性達(dá)93.7%；與人相似性為41.7%。熒光定量PCR結(jié)果表明，stat6在脾、頭腎、大腦、腸和鰓中表達(dá)較高。腹腔注射哈維氏弧菌3 h后，stat6在脾、頭腎、腸、鰓組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)，表明細(xì)菌感染會增加stat6的表達(dá)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究魚類stat6在病原菌感染免疫中的分子機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。

stat6；鱸魚；克?。唤M織表達(dá)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STATs)是一種存在于胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，能被多種配體激活形成二聚體，隨后從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與目標(biāo)基因啟動子區(qū)的DNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)[1-2]。在哺乳動物中，STATs家族包含7個成員，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6[3]。研究發(fā)現(xiàn)不同的STATs功能不同，在小鼠中證實STAT1在干擾素系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng)上起到至關(guān)重要的作用[4]，白介素IL-6信號對STAT3在人類造血細(xì)胞和抗凋亡中是必需的[5]。STAT5a和STAT5b在小鼠生長、哺乳期和造血中有著重要功能[6]。以上研究表明了STAT1、STAT3和STAT5有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，而偶數(shù)STAT蛋白質(zhì)功能相對受限制，大部分集中在免疫應(yīng)答上，如STAT2被干擾素α/β激活，STAT4被IL12激活，STAT6被IL4和IL13激活[7-8]。

STAT6作為STATs的重要成員之一，Kaplan等[9]報道STAT6在白介素4(interleukin-4，IL-4)、白介素13(interleukin-13，IL-13)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。當(dāng)IL-4和細(xì)胞膜上的IL-4 受體的α鏈發(fā)生結(jié)合后，IL-4 受體形成異二聚體，從而引發(fā)酪氨酸激酶系統(tǒng)JAK的激活，使胞漿內(nèi)STAT6的酪氨酸殘基磷酸化而被激活，繼而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的 DNA位點(diǎn)結(jié)合，最終誘導(dǎo)相關(guān)炎癥基因，如IgE、IL-4R、Eotaxin、FcR和Ⅱ類MHC等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[10-11]。

也有報道STAT6參與了魚類的免疫應(yīng)答。鯰魚(Pangasiushypophthalmus)白細(xì)胞中，STAT6蛋白在生長因子和有絲分裂原刺激下被激活并移到核內(nèi)。此外，鯰魚的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞抗原受體NCCRP-1(nonspecific cytotoxic cells antigen receptor)和JAK激酶作用后刺激STAT6的活性和核移位[12]。目前stat6已經(jīng)在鱖魚(Sinipercachuatsi)[13]、東方鲀(Tetraodonfluviatilis)[2]等魚類中被分離克隆以及進(jìn)行初步功能的研究，在東方鲀中發(fā)現(xiàn)STAT6的N-末端結(jié)構(gòu)域和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域在哺乳動物IL-4受體復(fù)合體和STAT6之間的相互作用中起著關(guān)鍵作用。鱖魚的研究表明，魚類的JAK/STAT信號轉(zhuǎn)錄途徑與哺乳動物相似，并且這種信號轉(zhuǎn)錄途徑在魚類的抗病毒應(yīng)答調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。

鱸魚(Lateolabraxjaponicus)屬鱸形目，鮨科，花鱸屬。廣泛分布于太平洋西部、中國沿海地區(qū)，屬于廣鹽性魚類，其肉質(zhì)細(xì)膩，營養(yǎng)豐富，是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。本研究從鱸魚肝臟中克隆了鱸魚信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子stat6，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)分析，利用Real-time PCR技術(shù)分析哈維氏弧菌感染后鱸魚stat6的表達(dá)變化，為今后研究鱸魚stat6在免疫中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鱸魚采自寧波水產(chǎn)品大世界，大腸桿菌DH5α，由本實驗室保存。Trizol試劑(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、rTaq酶、pMD18-T Vector、SYBR Premix EX TaqTMII購自TaKaRa生物有限公司；凝膠回收試劑盒購于Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA的合成

麻醉后解剖鱸魚，將心臟、肝、脾、頭腎、鰓、眼、脂肪、肌肉、大腦和腸組織，放于液氮中，用Trizol試劑提取總RNA。用ND-2000微量核酸測定儀測定RNA濃度，各取1 μg總RNA按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將合成的cDNA進(jìn)行-20℃保存。另取1 μg肝臟總RNA按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書合成3′和5′ Ready cDNA，合成的DNA 進(jìn)行-80℃保存。

1.2.2 鱸魚stat6全長cDNA序列的克隆

實驗室經(jīng)華大基因高通量測序，獲得鱸魚cDNA文庫，BLAST比對，有一預(yù)測的stat6序列片段與鱖魚stat6相似度達(dá)到90%以上，根據(jù)該序列片段，設(shè)計引物stat6-F0：TGTTTGACTGAAGCCCTGC和stat6-R0：CAATGTCTGCTTTGCTCTCA，以鱸魚肝臟cDNA為模板擴(kuò)增stat6。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 2 min 30 s，共35個循環(huán)；最后72℃再延伸8 min。

5′ RACE和3′ RACE擴(kuò)增使用按Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進(jìn)行。根據(jù)驗證過的已知片段，設(shè)計3′和5′端引物stat6-3′ F1：TGACGACAACCTCAACCCCCTGC和stat6-5′ R1：TCAGAGAGAGGTGCCAGGGATGTAGC，分別以3′ RACE cDNA和5′ RACE cDNA為模板，以及試劑盒提供通用引物UMP進(jìn)行3′ RACE和5′ RACE PCR反應(yīng)。第2輪PCR的引物為stat6-3′ F2：CCTGGGAAGCCTGTGGTGCTAAAG和stat6-5′ R2：CCGATGGGTGACGCTTGAGGCT，與試劑盒提供的引物Nest-UPM分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件按照說明書進(jìn)行。

將上述PCR產(chǎn)物凝膠電泳，割膠回收，與pMD-18T Vector連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑克隆PCR陽性檢測，送至上海Invitrogen公司測序。

1.2.3 鱸魚STAT6氨基酸的序列分析

通過http://web.expasy.org/compute_pi/在線預(yù)測STAT6蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)，利用http://smart.embl-heidelberg.de/在線分析STAT6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用Bioedit比對氨基酸序列，用MEGA6.0構(gòu)建STAT6的進(jìn)化樹。

1.2.4 鱸魚stat6組織表達(dá)分析

根據(jù)已得到的鱸魚stat6的cDNA序列，設(shè)計熒光定量stat6引物和內(nèi)參基因stat6-F：AAGGAGTGTGTGGACTGTTTGG，stat6-R：GAGGTTGTCGTCAAAAGGATGT，β-actin-F：TGTGCAAAGCCGGATTCG，β-actin-R：CCTCTCTTGCTCTGGGCTTCA，以心臟、肝、脾、頭腎、鰓、眼、脂肪、肌肉、大腦和腸組織的cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段長度為114 bp。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性20 s；95℃變性15 s，58℃退火15 s，68℃延伸20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過測得Ct值，再利用2-△△Ct法計算stat6在不同組織中的相對表達(dá)量。

1.2.5 哈維氏弧菌感染后stat6表達(dá)分析

取50條體重約100 g，體長約20 cm的新鮮鱸魚進(jìn)行感染。水溫15℃，pH 7.2，鹽度25‰，分成4組放入養(yǎng)殖箱，2組為實驗組，另2組為對照組，實驗組腹腔注射100 μL哈維氏弧菌(3.8×106CFU/mL)，對照組腹腔注射生理鹽水，分別在0、3、6、12和24 h隨機(jī)各取5條鱸魚，麻醉后取脾、頭腎、腸和鰓組織，通過Real-time PCR測定stat6的表達(dá)。數(shù)據(jù)處理方法同上，利用SSPS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 鱸魚stat6全長cDNA的克隆

通過stat6-F0和stat6-R0引物從鱸魚肝臟的cDNA中擴(kuò)增得到長度為2350 bp的產(chǎn)物，經(jīng)BLAST分析是鱸魚stat6。根據(jù)該序列設(shè)計RACE引物，分別得到2290 bp的5′ 末端和2638 bp的3′ 末端，將其拼接得到stat6的全長cDNA序列(GeneBank 登錄號為KT956195)。鱸魚stat6全長cDNA序列為3938 bp，5′ UTR和3′UTR分別為295 bp和1369 bp，含有PolyA加尾信號aataaa，最后以Poly(A)結(jié)尾。整個CDS為2274 bp，編碼757個氨基酸，該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為86.43 ku，等電點(diǎn)5.90(圖1)。

2.2 鱸魚STAT6的氨基酸序列分析

通過NCBI的BLAST將鱸魚STAT6氨基酸序列進(jìn)行相似性檢索，發(fā)現(xiàn)鱸魚與同為鱸形目的鱖魚相似性最高，為93.7%；與鱸形目的大黃魚(Larimichthyscrocea)和鲀形目的東方鲀也都有較高的相似性，分別為86.7%和73.7%。與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的鯉形目鯉魚和鯰形目斑點(diǎn)叉尾鮰相似性為64.6%和61.5%。與人(Homosapiens)、牛(Bostaurus)和大鼠(Rattusnorvegicus)相似性分別為41.7%、40.8%和40.3%。

多序列比對結(jié)果顯示(圖2)，鱸魚STAT6蛋白質(zhì)和其他物種一樣，存在著高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，包括N-末端結(jié)構(gòu)域(2～125區(qū)段)，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(143～304區(qū)段)，DNA結(jié)合域(306～551區(qū)段)，SH2結(jié)構(gòu)域(560～647區(qū)段)和轉(zhuǎn)錄激活域(648～757區(qū)段)。根據(jù)http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html在線軟件分析，鱸魚STAT6的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域是由4個α螺旋結(jié)構(gòu)組成，分別在143～184、198～250、260～279、285～303區(qū)段。

利用MEGA6.0軟件建立STAT6系譜樹(圖3)。從系譜樹可以看出，STAT6可以分成兩大分枝。第一分枝是哺乳類、兩棲類和爬行類，第二分枝是硬骨魚類。

2.3 鱸魚stat6組織表達(dá)分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示，stat6在鱸魚檢測的組織中都表達(dá)，在脾、頭腎、鰓、大腦和腸組織中表達(dá)較高，在心臟、眼、脂肪和肌肉中表達(dá)較少，其中肌肉表達(dá)量最低，鰓中表達(dá)最高(如圖4)。

2.4哈維氏弧菌感染后stat6表達(dá)變化

由于stat6在脾、頭腎、腸和鰓中表達(dá)較高，因此用Real-time PCR技術(shù)檢測注射哈維氏弧菌后stat6在鱸魚這4個組織中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，腹腔注射哈維氏弧菌3 h后，鱸魚stat6 mRNA表達(dá)在脾、頭腎、腸和鰓中顯著增加(P< 0.05)，脾、腸和鰓在6 h達(dá)到峰值，12 h回落，24 h繼續(xù)下降，但仍高于對照組，而頭腎在12 h達(dá)到峰值，24 h回落，同樣仍顯著高于對照組(如圖5)。

圖2 鱸魚、鱖魚、大鼠和人STAT6的氨基酸序列比較Fig 2 STAT6 amino acid sequences from L. japonicus, S. chuatsi, R. norvegicus and H. sapiens黑色區(qū)域代表相同氨基酸；*代表酪氨酸(Tyr)；黑框代表NCoA-1結(jié)合位點(diǎn)；下劃線代表α螺旋

3 討論

本研究用RACE-PCR方法在鱸魚肝臟中克隆得到stat6的cDNA全長，并推斷可翻譯757個氨基酸。該蛋白具有5個典型特征： N-末端結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、SH2結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活域。

圖3 鱸魚與其他物種STAT6氨基酸序列進(jìn)化樹Fig 3 Phylogenetic tree of STAT6 amino acid sequence of L. japonicus and other species

STAT蛋白的卷曲螺旋區(qū)域參與了受體結(jié)合、磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)過程[1]。STAT1的晶體結(jié)構(gòu)顯示，卷曲螺旋區(qū)是由4個α螺旋狀結(jié)構(gòu)組成，為轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)蛋白提供作用位點(diǎn)[14]。鱸魚STAT6的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域也包含4個α螺旋(圖3)，推測鱸魚STAT6蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)具有和轉(zhuǎn)錄因子互相作用的功能。

STAT6的激活需要依靠IL-4和IL-13參與，當(dāng)其與受體結(jié)合后，引發(fā)酪氨酸激酶系統(tǒng)JAK的激活，使受體磷酸化，磷酸化后的受體與STAT6的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得STAT6的Tyr-641也被JAK激酶磷酸化。隨后STAT6形成二聚體并定位到核內(nèi)并調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[11]。可見641位的Tyr磷酸化是STAT6調(diào)控目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素，Yumiko等證實第641位的Tyr發(fā)生突變，STAT6將喪失與結(jié)合DNA的能力[15]。在東方鲀，STAT6的Tyr-637的酪氨酸的發(fā)生突變后也不能和DNA發(fā)生結(jié)合，不能轉(zhuǎn)錄激活目標(biāo)基因[2]。鱸魚STAT6蛋白的第641個氨基酸殘基也是酪氨酸(Tyr)，恰好在SH2區(qū)域上，推測鱸魚STAT6蛋白的SH2區(qū)域在磷酸化和二聚體形成過程中發(fā)揮重要功能。

圖4 鱸魚stat6在不同組織中的表達(dá)Fig 4 Expression of stat6 in various tissues of L. japonicus

1：心臟；2：肝；3：脾；4：頭腎；5：腸；6：鰓；7：眼；8：大腦；9：脂肪；10：肌肉

所有STAT蛋白質(zhì)均可和有回文結(jié)構(gòu)[TTC(N)2-4GAA]的DNA結(jié)合，而STAT6 所結(jié)合的DNA元件特征是中間間隔3或4個核苷酸[16]。研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中β-酪蛋白、免疫球蛋白和IRF4(Interferon regulatory factor 4)的啟動子區(qū)都存在該序列[17-18]，因而這3個都是STAT蛋白的靶基因。在斑馬魚(Danio rerio)中，IRF4的啟動子區(qū)也存在與STAT6的DNA結(jié)合域結(jié)合的回文序列[18]，因此在魚類中IRF4同樣可作為STAT6的靶基因。

圖 5 哈維氏弧菌感染后stat6在脾、頭腎、腸、鰓中的表達(dá)變化Fig 5 Expression of stat6 in spleen, kidney, intestine and gill of L. japonicus after intraperitoneal injectin of Vibrio harveyi

*表示顯著差異(P<0.05)

STAT6轉(zhuǎn)錄激活域的特點(diǎn)是其轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)依賴于細(xì)胞的類型，可能是不同細(xì)胞所具有的轉(zhuǎn)錄共激活子不同。人STAT6通過其轉(zhuǎn)錄激活域的羧基端招募結(jié)合共激活子NCoA-1，這種結(jié)合依賴于STAT6羧基端的LXXLL基序[19-20]，我們在鱸魚STAT6蛋白的羧基端并沒有發(fā)現(xiàn)存在LXXLL基序，所以無法推斷其轉(zhuǎn)錄激活是否需要共激活子NCoA-1參與。哺乳動物中STAT6轉(zhuǎn)錄激活域富含脯氨酸(Pro)，雖然東方鲀魚STAT6蛋白的轉(zhuǎn)錄激活域和哺乳動物的有著很大差異，但是這種差異性并沒有影響STAT6蛋白的功能[2]。

鱸魚stat6在所檢測的10個組織中均有表達(dá)，與東方鲀魚和黃顙魚(Pelteobagrusfluvidraco)[21]研究結(jié)果類似，其中鱸魚stat6在脾、頭腎、大腦、腸和鰓中表達(dá)較高，當(dāng)腹腔注射哈維氏弧菌3 h后，stat6在脾、頭腎、鰓、腸組織中均顯著上調(diào)，證明了stat6在抵抗細(xì)菌感染過程中扮演著重要作用，為stat6在研究魚類病原菌感染免疫分子機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ)。

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Gene cDNA cloning and expression analysis of stat6 from Lateolabrax japonicas

YU Xiao-na, LIU Yan-jie, QIAN Yun-xia

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Signal transduction and transcriptional activation factor 6 plays an important role in the inflammation induced by IL-4 and IL-13. A full-length cDNA of thestat6 in sea perch (Lateolabraxjaponicus) was amplified by RT-PCR and SMART RACE methods. The cDNA was 3938 bp with 5′-UTR of 295 bp, 3′-UTR of 1369 bp and open reading frame of 2274 bp. It encoded a protein of 757 amino acids with the molecular weight of 86.43 ku and pI 5.90. The blast analysis indicated that the deduced amino acids sequence of sea perch STAT6 shared the highest identity of 93.7% withSinipercachuatsiand the lowest identity of 41.7% withhomosapien. Real-time PCR results showed thatstat6 was expressed in all tissues tested with higher levels in spleen, kidney, brain，intestine and gill. The expression ofstat6 increased obviously in spleen, kidney, intestine and gill after intraperitoneal injectin ofVibrioharveyi. This obtained information will provide a theoretical basis for studying the molecular mechanism of fishstat6 in regulating fish immune response to pathogens.

stat6;Lateolabraxjaponicus; cloning; tissue expression

2015-12-21；

2016-01-19

寧波大學(xué)“水產(chǎn)”浙江省重中之重開放基金資助(xkzsc1513)

于小娜，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物免疫基因，E-mial: 1034051030@163.com

錢云霞，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事水產(chǎn)動物分子生物學(xué)，E-mial: qianyunxia@nbu.edu.cn

Q786

A

2095-1736(2016)05-0053-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.053